N2a/APP695細(xì)胞表達(dá)載脂蛋白E4對線粒體自噬的影響*

付燕林， 吳昌學(xué)， 鄭菊， 龍培艷， 張文萍， 高霄， 王正微， 齊曉嵐， 肖雁*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種以細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(amyloidP protein, Aβ)沉積和細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化形成的纏結(jié)為主要病理學(xué)特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。淀粉樣蛋白級聯(lián)假說提出后，關(guān)于Aβ沉積的研究開展得更多，結(jié)果表明Aβ的有害作用不可否認(rèn)，還提出Aβ沉積會觸發(fā)該疾病的其他致病機(jī)制的新觀點(diǎn)[2]。然而，隨著AD發(fā)病機(jī)制研究的深入，Aβ沉積被認(rèn)為有可能不是AD的早期發(fā)病機(jī)制，因?yàn)榇竽X新陳代謝和線粒體功能障礙在AD早期已經(jīng)發(fā)生改變[3-4]。因此有關(guān)學(xué)者提出線粒體功能障礙可能是AD的早期發(fā)病原因，但具體機(jī)制尚不明確。載脂蛋白E(apolipoprotein E, APOE)是一種由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其主要功能是將星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的膽固醇運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)細(xì)胞中，在某些特定的情況，神經(jīng)細(xì)胞中也會合成APOE以維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的穩(wěn)定。APOE根據(jù)其突變位點(diǎn)不同分為3種不同亞型，分別為APOE4、APOE43、APOE2[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，APOE4的攜帶者患AD的風(fēng)險比其他亞型攜帶者增加約4～12倍，APOE4攜帶者患AD的時間早于非攜帶者[6-7]。同時還發(fā)現(xiàn)APOE4攜帶者在AD早期認(rèn)知功能正常時，大腦區(qū)域就有葡萄糖代謝減退，在未受AD影響的皮質(zhì)區(qū)域，線粒體復(fù)合Ⅳ的活動已經(jīng)減少，提示APOE4與線粒體功能障礙也有關(guān)[8-9]。特別是在神經(jīng)元中，APOE4與線粒體呼吸受損、神經(jīng)生長減少和神經(jīng)毒性發(fā)生有關(guān)[10-11]。線粒體對神經(jīng)元的生存、發(fā)育和功能十分重要，神經(jīng)元的數(shù)量和質(zhì)量通過線粒體分裂融合調(diào)控，而線粒體分裂融合則由線粒體融合蛋白-2 (mitofusin 2,MFN2)、線粒體融合蛋白-1(mitofusin1,MFN1)、線粒體分裂蛋白-1(fission 1,FIS1)調(diào)控[12-13]。正常情況下線粒體分裂融合保持相對穩(wěn)定，但當(dāng)線粒體分裂融合平衡破壞后會增強(qiáng)線粒體自噬的發(fā)生將受損線粒體清除，PINK1/Parkin信號通路是線粒體自噬的關(guān)鍵通路[14-15]。正常情況下，位于線粒體外膜的張力蛋白同源物誘導(dǎo)的假定激酶1 (PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)，經(jīng)轉(zhuǎn)位酶的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)膜；但當(dāng)線粒體受損后，PINK1膜內(nèi)轉(zhuǎn)移受阻，線粒體外膜的PINK1累積增加，導(dǎo)致自身磷酸化而被激活[16]。E3泛素連接酶 (E3 ubiquitinpotein ligase parkin,Parkin)作為PINK1的下游分子，在接受PINK1刺激活化后，募集至線粒體基質(zhì)與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅰ, LC3Ⅰ)結(jié)合，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，從而形成 LC3Ⅱ，LC3Ⅱ促進(jìn)線粒體包裹進(jìn)入自噬體，從而導(dǎo)致線粒體自噬的發(fā)生[17]。該途徑能夠?qū)⑹軗p線粒體清除，使細(xì)胞產(chǎn)生新的有效的線粒體，而當(dāng)線粒體自噬途徑出現(xiàn)異常時，受損的子線粒體無法通過自噬途徑清除而堆積于細(xì)胞內(nèi)，將會影響線粒體功能甚至對細(xì)胞造成損傷[15]。研究表明APOE4的神經(jīng)元中膽固醇外排減少，而高膽固醇累積于細(xì)胞中會影響細(xì)胞線粒體自噬異常[18-19]。因此，推測APOE4表達(dá)可能使線粒體自噬發(fā)生異常從而引起線粒體功能障礙。本研究以穩(wěn)定表達(dá)APP695小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞株(mouse neuroblastoma cell line, N2a)為AD的細(xì)胞模型(N2a/APP695)，通過構(gòu)建表達(dá)APOE4細(xì)胞株，探討APOE4表達(dá)時對N2a/APP695細(xì)胞中線粒體自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞來源 N2a/APP695細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室譚俊教授惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 FIS1、β-Actin抗體(美國 GeneTex公司)，MFN2、MFN1、PINK1、Parkin抗體和Cholesterol Assay Kit(Cell-Based)(美國 Abcam公司)，LC3、LC3Ⅱ、CYC、HRP標(biāo)記的兔二抗及鼠二抗(美國 CST公司)，APOE4慢病毒及陰性對照慢病毒(上海 吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)，線粒體探針(上海 碧云天生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清(美國 Gibco公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國ermo fisher公司) ，多功能酶標(biāo)儀(美國 BIOTEK公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本 Olympus公司)，高速離心機(jī)(德國 Eppendorf公司)，GeneGnome XRQNPC化學(xué)發(fā)光成像儀(英國 Syngen公司)，BG-power600 型穩(wěn)流電源(北京百晶生物)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組和嘌呤霉素篩選處理 高糖DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM選擇培養(yǎng)基、胎牛血清和雙抗以45 ∶44 ∶10 ∶1的比例配成完全培養(yǎng)基；N2a/APP695細(xì)胞懸液、2 mL完全培養(yǎng)基加入15 mL離心管中，離心(1 000 r/min，5 min)；去上清，加入4 mL完全培養(yǎng)基吹打混勻后于T25培養(yǎng)瓶中恒溫培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)，取對數(shù)生長期N2a/APP695細(xì)胞接種于6孔板中；設(shè)N2a/APP695正常細(xì)胞組(正常組)、APOE4慢病毒感染組(表達(dá)組) 和陰性對照慢病毒空載組(陰性對照組)，除正常組外，各組加入對應(yīng)的慢病毒和助感染試劑；感染培養(yǎng)72 h后經(jīng)過嘌呤霉素的培養(yǎng)基不斷篩選(正常組中細(xì)胞不含有嘌呤抗性基因，陰性對照組和APOE4表達(dá)組中含有嘌呤抗性基因)具有抗性的細(xì)胞。

1.2.2APOE4、MFN2、MFN1、FIS1、PINK1、Parkin和LC3蛋白表達(dá) N2a/APP695細(xì)胞用1XPBS洗3次，每孔加入100 μL/100 PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心(14 000 r/min，20 min)后收集上清液，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度；通過12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)30 mA恒流電泳至蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物分離到合適間距(約1.5～2 h),結(jié)束電泳；將凝膠中的蛋白質(zhì)通過濕法電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上(200 mA，2 h)，用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗APOE4(1 ∶1 000)、MFN1(1 ∶1 000)、MFN2(1 ∶1 000)、FIS1(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶1 000)、PINK1(1 ∶200)、Parkin(1 ∶1 000)、β-Actin(1 ∶4 000)，4 ℃搖床過夜；第二日TBST漂洗3次，每次10 min；加入對應(yīng)的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h；TBST 漂洗3次，每次10 min；使用ECL發(fā)光試劑盒和GeneGnone XRQ曝光儀進(jìn)行曝光，Image J軟件分析目標(biāo)蛋白條帶灰度值。

1.2.3線粒體形態(tài)變化 將細(xì)胞以1×104個/孔種于共聚焦培養(yǎng)皿， 37 ℃培養(yǎng)24 h，Mito-Tracker Green(1 ∶20 000)稀釋于無酚紅培養(yǎng)基配置成工作液，37 ℃預(yù)溫育15 min；細(xì)胞去除原培養(yǎng)液，PBS洗1次后，用無酚紅DMEM洗滌1次，加入Mito-Tracker Green染色工作液1 mL/孔，37 ℃孵育60 min；去掉Mito-Tracker Green染色工作液，用無酚紅DMEM洗1次后加完全培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4細(xì)胞膽固醇染色熒光觀察 細(xì)胞以5×105個/孔種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長到60%后備用；去掉培養(yǎng)基，加入Cholesterol Assay Kit中的固定液固定15 min、去掉固定液，洗滌液洗3次、每次5 min；加入配置好的染色試劑，黑暗環(huán)境常溫孵育40 min，洗滌液洗3次，每次5 min；激光共聚焦觀察熒光情況。

1.2.5細(xì)胞免疫熒光染色 將細(xì)胞以5×104個/孔種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)24 h，去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗3次，每次5 min；加入4%的細(xì)胞組織固定液固定細(xì)胞20 min，PBS洗3次、每次5 min；加入1 mL 0.3%的Triton溶液15 min，PBS洗3次、每次5 min；加入1 mL山羊血清封閉液30 min，回收山羊血清封閉液，加入按比例用羊血清配制好的一抗稀釋液，4 ℃過夜；次日回收一抗，PBS洗3次、每次5 min；用PBS配制好的二抗稀釋液，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次、每次5 min；激光共聚焦檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 APOE4蛋白表達(dá)

嘌呤霉素篩選結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中逐漸死亡，陰性對照組和表達(dá)組僅有少量細(xì)胞死亡；Western blot結(jié)果顯示，正常組和陰性對照組細(xì)胞中不表達(dá)APOE4，表達(dá)組細(xì)胞中表達(dá)APOE4蛋白；鑒定慢病毒感染成功。見圖1。

注：A為經(jīng)過含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選出來具有抗性的細(xì)胞結(jié)果(20×)，B為Western blot檢測細(xì)胞APOE4表達(dá)。圖1 嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選具有抗性N2a/APP695細(xì)胞及APOE4蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.1 Puromycin dihydrochloride culture medium screened N2a/APP695 with resistance and APOE4 expression (Western blot)

2.2 MFN1、MFN2、FIS1蛋白含量及線粒體形態(tài)變化

Western blot結(jié)果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達(dá)組中線粒體融合蛋白MFN1、 MFN2差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，線粒體分裂蛋白FIS1明顯上調(diào)(P<0.01，圖2)；Mito-Tracker Green熒光染色結(jié)果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達(dá)組中線粒體形態(tài)呈現(xiàn)碎片化(圖3)。

注：A為Western blot法檢測各蛋白表達(dá)結(jié)果，B為各蛋白表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與陰性對照組比較，P<0.01。圖2 各組N2a/APP695細(xì)胞中MFN1、MFN2及FIS1蛋白的表達(dá)(Western blot)Fig.2 MFN1, MFN2, and FIS1 protein expression in cells of all groups(Western blot)

注：藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為線粒體。圖3 各組N2a/APP695細(xì)胞中線粒體形態(tài)變化(熒光染色，×100)Fig.3 Mitochondrial morphological changes in cells of all groups(fluorecent staining，×100)

2.3 PINK1、Parkin和LC3蛋白含量

結(jié)果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達(dá)組細(xì)胞中線粒體自噬蛋白PINK1和Parkin明顯上調(diào)(P<0.01)，LCⅡ/Ⅰ下調(diào)(P<0.05，圖4)。

注：A為Western blot法檢測各蛋白表達(dá)結(jié)果，B為各蛋白表達(dá)定量結(jié)果；與正常組比較，(1) P<0.01, (3) P<0.05；與陰性對照組比較，(2) P<0.01, (4) P<0.05。圖4 各組N2a/APP695細(xì)胞中PINK1、Parkin和LC3蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.4 The expression of PINK1, Parkin, and LC3 protein in cells of all groups(Western blot)

2.4 細(xì)胞中膽固醇染色結(jié)果

結(jié)果顯示，正常組與陰性對照組中膽固醇主要分布在細(xì)胞膜上，表達(dá)組中細(xì)胞膽固醇不僅在細(xì)胞膜上，同時在細(xì)胞內(nèi)高分布(紅色箭頭所指，圖5)。

圖5 各組N2a/APP695細(xì)胞膽固醇染色結(jié)果(熒光染色，×20)Fig.5 Cellular cholesterol staining in all groups(cell immunofluorescence，×20)

2.5 LC3Ⅱ與線粒體之間的共定位情況

細(xì)胞色素C(cytochrome C, CYC)位于真核細(xì)胞的線粒體膜上，可作為線粒體上的標(biāo)志蛋白，免疫熒光檢測CYC與LC3Ⅱ的共定位情況結(jié)果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達(dá)組中LC3Ⅱ與CYC的共定位減少(黃色部分)。見圖6。

注：紅色為線粒體，綠色為LC3Ⅱ，黃色為線粒體與LC3Ⅱ共定位。圖6 各組N2a/APP695細(xì)胞CYC與LC3Ⅱ之間的共定位情況(免疫熒光，×100)Fig.6 Co-localization between CYC and LC3Ⅱ in all groups(immunofluorescent,×100)

3 討論

本研究通過成功構(gòu)建表達(dá)APOE4的N2a/APP695細(xì)胞，觀察APOE4對線粒體分裂融合蛋白的影響，結(jié)果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達(dá)組中MFN2和MFN1未觀察到表達(dá)水平改變，但是FIS1蛋白上調(diào)，線粒體熒光染色發(fā)現(xiàn)表達(dá)組中線粒體形態(tài)呈現(xiàn)碎片化，這提示APOE4可促進(jìn)線粒體裂變。線粒體分裂融合的不平衡容易造成線粒體自噬的異常，進(jìn)而影響線粒體功能的變化。進(jìn)一步檢測線粒體自噬關(guān)鍵通路蛋白，結(jié)果表明自噬蛋白PINK1、Parkin顯著上調(diào)，LCⅡ/Ⅰ下調(diào)，這提示線粒體自噬出現(xiàn)異常。受損的線粒體募集PINK1蛋白在線粒體外膜的累積增加，激活Parkin蛋白，但是可能沒有與LC3Ⅱ結(jié)合，阻礙線粒體包裹入溶酶體，從而導(dǎo)致線粒體自噬通路發(fā)生異常，導(dǎo)致大量損傷線粒體無法排除細(xì)胞外，堆積于細(xì)胞內(nèi)。這與ROCA等人[20]研究結(jié)果相似，在神經(jīng)元細(xì)胞中，膽固醇介導(dǎo)的抗氧化線粒體防御下調(diào)觸發(fā)了 PINK1-Parkin信號通路，激活PINK1蛋白和Parkin蛋白高表達(dá)，但溶酶體無法識別受損線粒體導(dǎo)致線粒體不完全降解，LC3Ⅱ/Ⅰ下降，線粒體自噬不足。同時，APOE4是膽固醇與脂質(zhì)的載體，有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞中APOE4的脂質(zhì)結(jié)合域與脂質(zhì)結(jié)合，減少膽固醇對外運(yùn)輸，使得細(xì)胞體內(nèi)膽固醇積累，高膽固醇能破壞自噬體與溶酶體囊泡的融合，從而破壞了線粒體自噬通路[21]。本研究對各組細(xì)胞內(nèi)膽固醇進(jìn)行熒光染色檢測，結(jié)果顯示，正常組與陰性對照組中膽固醇主要分布在細(xì)胞膜上，表達(dá)組中細(xì)胞膽固醇不僅在細(xì)胞膜上，同時在細(xì)胞內(nèi)高分布。這提示APOE4可能通過減少膽固醇外排而影響受損線粒體與LC3的結(jié)合從而導(dǎo)致線粒體自噬的異常。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建表達(dá)APOE4的N2a/APP695細(xì)胞，在有APOE4表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞中線粒體分裂增多，但自噬途徑發(fā)生異常而導(dǎo)致大量損傷線粒體堆積于細(xì)胞中，這可能是AD發(fā)病機(jī)制中線粒體功能障礙的原因之一。