基于網絡藥理學與分子對接探討“黃芪-當歸”治療年齡相關性黃斑變性的作用機制

孟歡 劉自強 韓夢雨 農璐琪 金明

摘要 目的：通過網絡藥理學和分子對接方法探討中藥“黃芪-當歸”治療年齡相關性黃斑變性（AMD）的作用機制。方法：借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（TCMSP）獲取中藥黃芪、當歸的有效成分與作用靶點，使用Uniport數(shù)據庫進行基因ID的注釋，在GeneCards、OMIM數(shù)據庫中查找AMD的相關基因。使用Cytoscape 3.7.2將藥物-關鍵有效成分-疾病靶點網絡可視化，在String數(shù)據庫平臺構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，再利用Metascape基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，使用AutoDock4.2.6軟件對關鍵靶點蛋白及有效成分進行分子對接驗證。結果：通過篩選，得到黃芪-當歸有效成分22個，與AMD相關的關鍵有效成分14個，黃芪-當歸與AMD的共同基因靶點52個;PPI中核心基因依次為CASP3、IL6、VEGFA、EGFR、ESR1等;GO功能富集得到1 064個條目，生物學過程主要涉及細胞凋亡、對類固醇激素的反應、活性氧代謝、對脂多糖的反應等;KEGG富集分析后得到119條信號通路，與癌癥的通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、TNF信號通路、VEGF信號通路等機制相關;分子對接結果表明，核心有效成分可與靶點蛋白形成構象能量較低、結構穩(wěn)定的對接。結論：“黃芪-當歸”治療AMD具有多成分、多靶點、多通路的特點，為進一步研究AMD的治療提供了思路。

關鍵詞 黃芪;當歸;年齡相關性黃斑變性;機制;網絡藥理學;分子對接

Mechanism of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix on Age-related Macular Degeneration Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

MENG Huan1，LIU Ziqiang1，HAN Mengyu1，NONG Luqi1，JIN Ming2

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix in the treatment of age-related macular degeneration（AMD） based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active ingredients and targets of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix were obtained from TCMSP，and Uniport was used to annotate gene IDs.AMD-related genes were screened out in GeneCards and OMIM.Cytoscape 3.7.2 was used to visualize the drug-key active ingredient-disease target network and protein-protein interaction（PPI） network was plotted by String.Metascape was used to perform Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analyses.AutoDock 4.2.6 was used for molecular docking of key target proteins to active ingredients.Results：Twenty-two ingredients of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix were screened out，14 of which were key active ingredients related to AMD.There were 52 common gene targets of drugs and the disease.The core genes in the PPI network were CASP3，IL6，VEGFA，EGFR，ESR1，etc.GO function enrichment resulted in 1 064 entries，with biological processes mainly involving apoptosis，response to steroid hormones，active oxygen metabolism，and response to lipopolysaccharide.KEGG enrichment yielded 119 signaling pathways，which were related to cancer pathway，fluid shear force and atherosclerosis，HIF-1 signaling pathway，TNF signaling pathway，and VEGF signaling pathway.Molecular docking results showed that the core active ingredients could dock to the target proteins with low conformational energy and stable structure.Conclusion：The therapeutic effect of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix on AMD is characterized by multiple components，multiple targets，and multiple pathways.This study is expected to provide a scientific basis for further research on the treatment of AMD.

Keywords Astragali Radix; Angelicae Sinensis Radix; Age-related macular degeneration; Mechanism; Network pharmacology; Molecular docking

中圖分類號：R285;R276.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.008

年齡相關性黃斑變性（Age-related Macular Degeneration，AMD）是一種難治性眼底病變，以年齡為主要危險因素，臨床根據有無脈絡膜新生血管（Choroidal Neovascularization，CNV）分為干性與濕性2型，分別以眼底黃斑部玻璃膜疣、地圖樣萎縮及視網膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）脫離、黃斑部出血水腫為主要特征表現(xiàn)，是全球第三大致盲因素，我國AMD患病人數(shù)預計在2050年達5 519萬人，嚴重危害中老年人視力健康[1]。目前西醫(yī)治療AMD的方法較多，包括抗血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）玻璃體腔內注射、光動力療法（Photodynamic Therapy，PDT）、激光及手術等[2]，但均為針對CNV的治療手段，對以地圖樣萎縮為主要表現(xiàn)的干性AMD尚無有效療法，且存在治療頻率高、對藥物的延遲應答或不應答等不足[3]。近年來，中醫(yī)藥在AMD的治療中彰顯了明確的優(yōu)勢，AMD在中醫(yī)屬“視瞻昏渺”“視直如曲”及“暴盲”的范疇，病位在腎、脾、肝，針對其本虛標實的病機，以扶正祛邪為治則，往往能取得較好的療效，可改善患者視功能、延緩疾病進展。

黃芪味甘，性微溫，被譽為補中益氣之要藥，來自豆科植物蒙古黃芪或者膜莢黃芪的根，歸脾、肺經，具有健脾補中、升陽舉陷、益氣固表等功效;當歸為傘形科植物當歸的根，味甘、辛，性溫，歸肝、心、脾經，具有補血調經，活血止痛等功效，為補血之圣藥[4]。黃芪、當歸相須配伍，是臨床非常常用的氣血雙補藥對?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪與當歸配伍可促進造血干細胞的增殖，通過提高機體免疫力、清除自由基發(fā)揮抗衰老作用，還可抑制病變部位血管內膜增生時血管局部的炎癥反應[5-7]，因此臨床常將二者配伍用于AMD的治療。

網絡藥理學是一門以系統(tǒng)生物學、生物信息學和高通量組織學為基礎，集藥理學和信息網絡為一體的綜合學科，對預測中藥多成分、多靶點、多途徑的作用機制有重要意義，在探索藥物對疾病的基本作用與機制、分析中醫(yī)理論及研究中藥的應用等方面廣泛運用[8-9]。因此，本研究采用網絡藥理學聯(lián)合分子對接的研究方法，分析中藥黃芪-當歸治療AMD的有效成分、作用靶點及參與的生物途徑，探討其可能的療效機制，以期為今后進一步的實驗探索提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 藥物主要有效成分及作用靶點的獲取 借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲得藥物的主要有效成分和作用靶點[10]。在其中搜索關鍵詞“黃芪”“當歸”，并將檢索條件設置為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18，進一步篩選其主要有效成分和作用靶點。在Uniport數(shù)據庫中對藥物作用靶點進行標準化處理，轉化為對應基因。

1.2 藥物-疾病核心靶點的獲取 與AMD疾病相關的基因靶點從在線數(shù)據庫人類孟德爾遺傳研究平臺（OMIM，https：//omim.org/）、人類基因信息數(shù)據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/）中分別檢索獲取。以“age-related macular degeneration”為關鍵詞分別從中檢索相關基因，刪除重復后合并。將黃芪-當歸的藥物靶點基因與AMD的疾病相關基因取交集，所得交集基因即為黃芪-當歸治療AMD的核心基因，并對所得結果在線繪制韋恩圖。

1.3 藥物-關鍵有效成分-疾病靶點網絡可視化 黃芪-當歸及其關鍵有效成分與AMD靶點之間作用網絡的可視化借助Cytoscape 3.7.2軟件實現(xiàn)。通過藥物與疾病的交集基因再次篩選藥物有效成分后，可獲得黃芪-當歸治療AMD的關鍵有效成分，將核心基因與關鍵有效成分同時導入軟件，完成可視化處理。

1.4 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡 藥物-疾病交集基因的蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡分析由String在線數(shù)據庫（https：//string-db.org/）完成。將黃芪-當歸與AMD所共有的基因在線導入，物種選擇為人（Homo Sapiens），將所得結果隱藏離散點后，計算網絡中蛋白質相互作用關系對數(shù)量，并按照節(jié)點度對核心基因進行排序。

1.5 生物信息富集分析 藥物-疾病核心基因的生物信息富集分析通過在線基因注釋工具Metascape（http：//www.metascape.org/）實現(xiàn)。包括在基因本體（Gene Ontology，GO）生物信息（包括生物過程、細胞組分、分子功能）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路的富集分析等，了解黃芪-當歸干預AMD主要參與的生物通路，探討其作用機制。

1.6 分子對接 使用AutoDock4.2.6軟件對PPI網絡中節(jié)點度較高的關鍵靶點與可視化網絡中呈現(xiàn)的黃芪與當歸的關鍵有效成分進行分子對接。靶點蛋白與有效成分的分子結構分別來自于RCSB PDB數(shù)據庫（http：//www.rcsb.org/）和ZINC數(shù)據庫（https：//zinc.docking.org/），通過靶點與有效成分的最佳構象下的結合能評價活性成分和關鍵靶點之間的對接效果，并將最佳構象導入Pymol2.4.0軟件對結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 黃芪-當歸有效成分篩選 在TCMSP數(shù)據庫中共檢索到黃芪-當歸有效成分212個，其中黃芪87個，當歸125個。按照同時滿足OB≥30%和DL≥0.18的條件篩選后最終得到黃芪-當歸的有效成分22個，其中黃芪20個，當歸2個。

2.2 藥物-疾病核心基因的獲取 在TCMSP數(shù)據庫中共檢索到黃芪-當歸主要有效成分的作用靶點共531個，去除重復及無意義的作用靶點后，使用Uniport數(shù)據庫進行基因ID的注釋，共獲得100個藥物作用靶點。在GeneCards及OMIM數(shù)據庫中檢索到2 607個與AMD疾病相關基因，篩除重復項后獲得2 223個相關基因，將黃芪-當歸與AMD的靶點基因進行映射，得到52個藥物與疾病的共同基因靶點。見圖1。

2.3 藥物-關鍵化學成分-疾病網絡的構建 將52個共同靶點基因與藥物的22個有效成分進行匹配，再次篩選得到14個黃芪-當歸治療AMD的關鍵有效成分，然后將52個共同靶點基因和14個關鍵有效成分均導入Cytoscape軟件進行可視化處理。其中藍色六邊形為藥物關鍵化學成分，外圈綠色橢圓為作用于疾病的基因靶點。見圖2。

2.4 PPI網絡分析 將52個黃芪-當歸與AMD的共有的靶點基因輸入String數(shù)據庫平臺，隱藏1個離散點后得到的PPI網絡圖。該圖包含51個靶基因蛋白，924個PPI關系對，其中節(jié)點度處于前10位的分別為CASP3、IL-6、VEGFA、EGFR、ESR1、MAPK8、MYC、CCND1、ERBB2、AR。見圖3～4，這些可能是黃芪-當歸治療AMD作用的關鍵靶點。

2.5 生物信息富集分析 對篩選出來的52個核心基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能分析后得到1 064個條目，其中生物過程條目（Biological Process，BP）952個，主要與細胞凋亡、對類固醇激素的反應、活性氧代謝、對脂多糖的反應及細胞因子介導的信號通路等過程相關;細胞組分條目（Cellular Component，CC）36個，基因產物主要位于膜筏、轉錄因子復合物、質膜蛋白復合物、髓鞘、線粒體外膜等位置;分子功能（Molecular Function，MF）76個，主要與轉錄因子結合、激酶結合、核受體活性、泛素蛋白連接酶結合、雌激素16α-羥化酶活性、半胱氨酸型內肽酶活性與凋亡信號通路的關系等方面相關。將所得結果以GO分析的P值的-log10函數(shù)表示（P值越小，函數(shù)值越大）。見圖5。P值越小表明富集程度越高。KEGG通路分析得到119條相關通路，列舉了前14個集群中最具代表性的富集通路（以P值的-log10函數(shù)排序）。見圖6。52個核心基因主要富集于癌癥的通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路，此外還包括TNF信號通路、甲狀腺激素信號通路、催乳素信號通路和VEGF信號通路等。

2.6 分子對接驗證 利用AutoDock軟件，選擇PPI網絡中節(jié)點度最高的5個靶點蛋白（CASP3、IL6、VEGFA、EGFR、ESR1）和“藥物-關鍵化學成分-疾病”可視化網絡中的5個關鍵有效成分（Quercetin、Kaempferol、Isorhamnetin、Beta-sitosterol、Formononetin）分別進行分子對接驗證，在其最佳構象下靶點與有效成分結合所需的結合能。見表1。利用Pymol軟件對分子對接結果進行可視化分析，圖7即β-谷甾醇與各靶點蛋白分子對接的構象模式圖。

3 討論

中醫(yī)學中沒有“黃斑變性”這一病名，因其“外不見癥，從內弊之”而被歸于內障眼病范疇，《證治準繩·七竅門》中有相關癥狀描寫：“目內外別無證候，但自視昏渺，蒙昧不清也”“視直物如曲，弓弦、界尺之類視之皆如鉤。”中醫(yī)從整體觀出發(fā)，認為AMD的發(fā)生原因“有神勞、有血少、有元氣弱、有元精虧而昏渺”，根本病機在于精、氣、血的虧損，主要責之腎、脾、肝，是一個本虛標實的病理過程[11]，治療應以益氣養(yǎng)血、扶正祛邪為原則。黃芪作為“補中益氣之要藥”、當歸為“補血之圣藥”，二者相須配伍，是補氣生血的核心藥對，《內外傷辨惑論》記載的當歸補血湯即為黃芪、當歸按一定的比例配伍而成，是“氣血雙補”代表方之一[12]。黃芪-當歸在虛證的治療中具有重要的意義，也是AMD臨床組方的高頻用藥[13]。

本研究篩選出黃芪-當歸治療AMD的14個關鍵有效成分，包括槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、異鼠李素、聯(lián)苯雙酯、毛蕊異黃酮、豆甾醇及β-谷甾醇等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，以上有效成分，可分別通過對抗氧化應激或抑制新生血管生成等機制發(fā)揮對AMD的潛在治療作用。槲皮素在體外能激活Keap1-Nrf2-ARE通路發(fā)揮對RPE細胞的抗氧化作用，還可以抑制促分裂原活化的蛋白激酶（Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK）磷酸化和核因子κB信號通路，減輕RPE細胞的炎癥反應，對AMD等老年性眼病有一定保護作用[14-16]。山柰酚則可調節(jié)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性，抑制H2O2（過氧化氫）誘導的RPE細胞內VEGF表達上調，還可通過靶向VEGF和胎盤生長因子（Placenta Growth Factor，PGF），抑制Src-AKT1-ERK1/2信號通路的激活，發(fā)揮抗新生血管的作用[17-18]。芒柄花黃素[19]和異鼠李素[20]可通過抑制H2O2誘導的RPE細胞和視網膜神經節(jié)細胞的凋亡，從而保護視網膜。此外，聯(lián)苯雙酯[21]、毛蕊異黃酮[22]在體外研究中也被證實具有一定抗氧化、抗炎等作用;豆甾醇[23]、β-谷甾醇[24]則可抑制體內VEGF表達，具有抗血管生成的活性。

由52個黃芪-當歸與AMD共有的核心基因構建的PPI網絡中，節(jié)點度較高的有CASP3、IL6、VEGFA、EGFR等，這些基因，極有可能是黃芪-當歸治療AMD的關鍵治療靶點。胱天蛋白酶（Caspase）是細胞凋亡的核心，CASP3是細胞凋亡最重要的執(zhí)行者，直接參與DNA斷裂、染色質凝聚和凋亡小體的形成等過程[25]。研究發(fā)現(xiàn)，長期慢性炎癥刺激下的RPE與脈絡膜組織，其CASP3表達增加，凋亡途徑被異?；罨?，直接導致了RPE細胞的死亡，是AMD的重要發(fā)病機制[26];IL-6是感染或外傷急性期反應的主要炎癥誘導因子，研究發(fā)現(xiàn)IL6在干性AMD地圖樣萎縮患者和濕性AMD患者的血清中含量均明顯升高[27-28]，并且AMD患者眼底M1型巨噬細胞和小膠質細胞極化所分泌的IL6對CNV的發(fā)展有促進作用[29];VEGF是濕性AMD的主要致病因子，VEGFA是VEGF所有亞型中對血管內皮細胞增殖和分化影響最大、最重要的一個亞型，可以增加血管通透性、增強炎癥反應并且誘導血管生成，AMD患者VEGF的表達提示了血-視網膜屏障的破壞和眼內病理性新生血管的生成[30]，而敲除VEGFA基因可顯著降低激光誘導的CNV模型小鼠的病變程度[31]，因此抗VEGF治療已成為濕性AMD的一線治療方法;EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，吸煙是AMD的重要危險因素，研究表明香煙煙霧暴露可導致RPE細胞EGFR的高表達，而EGFR抑制劑的使用降低了香煙誘導下RPE分泌轉化生長因子-β1及VEGF的水平，對AMD具有潛在治療作用[32]。

GO功能與KEGG信號通路富集結果顯示了黃芪-當歸可能參與AMD的生物信號通路。GO富集結果顯示BP主要涉及細胞凋亡、對類固醇激素的反應、活性氧代謝及對脂多糖的反應等生物途徑。細胞凋亡和氧化應激是AMD發(fā)病的重要機制，其異常激活可破壞眼底微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、誘發(fā)RPE細胞及光感受器的死亡;類固醇激素具有抗炎、抗?jié)B透和血管抑制作用，臨床常用于治療黃斑水腫的皮質類固醇類藥物包括曲安奈德、地塞米松等，可以通過降低炎性因子和VEGF基因在眼內的表達水平，減輕細胞免疫反應、降低炎癥血管的滲透性，從而實現(xiàn)穩(wěn)定細胞膜，增強血-視網膜屏障的功能[33-34];脂多糖是革蘭氏陰性菌外表面的一種成分，可誘導RPE內細胞因子、VEGF、腫瘤壞死因子受體（Tumor Necrosis Factor Receptor，TNFR）和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related Apoptosis-inducing Ligand，TRAIL）的表達，通過氧化應激和核因子κB介導的炎癥等機制導致急性眼部炎癥，引起葡萄膜炎和不同程度的視網膜變性，常被用作AMD體外模型的制作[35]。

KEGG富集結果顯示，治療過程中可能涉及的信號通路包括癌癥的通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化、缺氧誘導因子-1（Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1）信號通路、TNF信號通路及VEGF信號通路等。其中HIF-1調控近百種靶基因，涉及缺氧代償性反應、免疫反應、新生血管的生成調節(jié)、能量代謝等多方面，以增加組織的缺氧耐受力，使機體更好地適應低氧環(huán)境，VEGF信號通路是血管生成的關鍵途徑，AMD患者眼底缺血缺氧的狀態(tài)可同時激活HIF-1信號通路與VEGF信號通路，誘導對HIF-1α和VEGF的表達，刺激CNV的生成[36-38];腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）是重要的炎癥介質，TNF-α在視網膜上的表達可通過刺激TNFR1和腫瘤壞死因子受體相關因子2[Tumor Necrosis Factor（TNF） Receptor Associated Factor 2，TRAF2]，激活蛋白激酶Cδ/JNK1/2/c-Jun信號通路誘導細胞間黏附分子-1（Intercelluar Adhesion Molecule-1，ICAM-1）的表達，從而介導AMD等視網膜炎性疾病[39]。

本次分子對接選擇了PPI網絡中節(jié)點度最高的5個靶點蛋白與“藥物-關鍵化學成分-疾病”可視化網絡中的5個關鍵有效成分分別進行驗證。結合能是衡量分子間是否能自發(fā)形成穩(wěn)定結構的指標，結合能小于0，說明二者可以自發(fā)結合，最低結合能越小說明分子與靶點蛋白間結合越好，可形成相對穩(wěn)定的結構，當結合能小于-5.0 kcal/mol時表示結合活性較好[40]。本次分子對接結果顯示，5個有效成分與靶點蛋白的最低結合能大部分都小于-5 kcal/mol，相互間可形成能量低、結構穩(wěn)定、結合活性較高的構象，展現(xiàn)出了良好的結合能力。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學與分子對接方法，分析了中藥經典藥對黃芪-當歸參與AMD治療多成分、多靶點、多通路的可能作用機制，為黃芪-當歸治療AMD提供了理論依據，也為更深入的實驗研究奠定了基礎。

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（2020-07-22收稿 本文編輯：王明）