基于“質(zhì)譜分析-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測-活性驗(yàn)證”的牛黃解毒丸抗炎作用研究

伊博文 趙潔 賴華清 唐力英 陳攀龍 柴興云 高小力 吳宏偉

摘要 目的：基于“質(zhì)譜分析-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測-活性驗(yàn)證”整合研究思路，解析牛黃解毒丸抗炎潛在作用機(jī)制解析及其活性成分。方法：通過高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析牛黃解毒丸化學(xué)成分，將分析出的成分;利用中藥生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）尋找對應(yīng)的靶標(biāo);以“inflammation”作為關(guān)鍵詞利用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）獲得炎癥相關(guān)靶標(biāo);取成分靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)交集，利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)庫（STRING）對共同靶標(biāo)進(jìn)行PPI分析，并采用Cytoscape軟件對靶標(biāo)進(jìn)一步篩選，得到核心靶標(biāo);利用生物信息分析工具（DAVID數(shù)據(jù)庫），對核心靶標(biāo)進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，構(gòu)建“藥物-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖;采用AutoDock 4.2.6軟件，對關(guān)鍵靶標(biāo)及相關(guān)藥物分子進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，并針對前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）這一靶標(biāo)與其對應(yīng)化學(xué)成分進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果：經(jīng)高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析出牛黃解毒丸中236個(gè)成分，對應(yīng)456個(gè)靶標(biāo)，炎癥相關(guān)靶標(biāo)158個(gè)，二者交集靶標(biāo)21個(gè)，PPI分析及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊?，獲得核心靶標(biāo)11個(gè)，活性成分14個(gè)，涉及腫瘤壞死因子（TNF）、核因子κB（NF-κB）、Toll樣受體（TLR）和趨化因子等27條通路，分子對接結(jié)果顯示，PTGS2、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）和C-C基序趨化因子配體2（CCL2）等靶標(biāo)與其對應(yīng)的大黃酸，蟲漆酸D，齊墩果酸等成分結(jié)合活性較高，在體外活性實(shí)驗(yàn)中，大黃酸對于其對應(yīng)的PTGS2這一靶標(biāo)具有較好的抑制作用。結(jié)論：本研究構(gòu)建了牛黃解毒丸抗炎的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析了牛黃解毒丸抗炎有效成分和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了大黃酸對PTGS2這一抗炎靶標(biāo)具有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞 牛黃解毒丸;抗炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶標(biāo)

Analysis of Anti-Inflammatory Mechanism of Bezoar Antidotal Pill Based on “Mass Spectrometry Analysis-Network Pharmacology Prediction-Activity Verification”

YI Bowen1，ZHAO Jie2，LAI Huaqing2，TANG Liying2，CHEN Panlong3，CHAI Xingyun3，4，GAO Xiaoli3，4，WU Hongwei2

（1 Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China; 2 Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3 School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 4 Center for Modern Research of Chinese Materia Medica，School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Abstract Objective：To analyze the potential mechanism of anti-inflammatory action of Bezoar Antidotal Pill and its active components based on the integrated research idea of “mass spectrometry analysis-network pharmacology prediction-activity verification”.Methods：High-resolution mass spectrometry was used to analyze the components in Bezoar Antidotal Pill，and the analyzed components were used to find the corresponding targets by using the bioinformatics analysis tool of molecular mechanism of traditional Chinese medicine（BATMAN-TCM）.Inflammation-related targets were obtained from the Mendelian Inheritance Database（OMIM） database，and the intersection of component targets and disease targets was taken.The protein interaction analysis of common targets was performed using the Protein Interaction Database（STRING） database，and the targets were further screened by Cytoscape software.Using the DAVID database，the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis was performed on the core targets，and a “drug-component-target-pathway” network diagram was constructed; AutoDock 4.2.6 software was used to conduct molecular docking verification on key targets and related drug molecules，and for prostaglandin endoperoxide synthase 2（PTGS2） target and its corresponding chemical constituents for in vitro verification.Results：A total of 236 components in Bezoar Antidotal Pill were analyzed by high-resolution mass spectrometry，corresponding to 456 targets，158 inflammation-related targets，and 21 intersection targets.After protein interaction analysis and network topology analysis，11 core targets and 14 active ingredients were obtained，involving 27 pathways including tumor necrosis factor（TNF），nuclear factor kappa-B（NF-κB），Toll-like receptors（TLR） and chemokines.The docking results showed that the targets of PTGS2，interleukin-1β（IL-1β），interleukin-13（IL-13） and chemokine 2（CCL2） and their corresponding rhubarb Acid，laconic acid D，oleanolic acid and other components had higher binding activities.In vitro activity experiments，rhein had a good inhibitory effect on their corresponding PTGS2 target.Conclusion：In this study，the anti-inflammation regulatory network of Bezoar Antidotal Pill was constructed，and the active ingredients and mechanism of action of Bezoar Antidotal Pill were analyzed.It was found that rhein had a good inhibitory effect on the anti-inflammatory target PTGS2.

Keywords Bezoar Antidotal Pill;Anti-inflammation;Network pharmacology;Target

中圖分類號：R285;R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.006

炎癥是機(jī)體受到多種炎癥介質(zhì)刺激以后由體內(nèi)的核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞等吞噬細(xì)胞參與的一系列復(fù)雜的防御反應(yīng)[1-2]，往往會有紅、腫、熱、痛和功能障礙等一些表現(xiàn)。通常情況下，適度的炎癥可以幫助機(jī)體激活免疫系統(tǒng)清除病原體，促進(jìn)組織愈合，但是一旦反應(yīng)過度，將會帶來嚴(yán)重的炎癥損傷，隨之而來的還會有多種疾病，大大增加了疾病的發(fā)病率和病死率[3]。

牛黃解毒丸是我國一種傳統(tǒng)的中成藥，由牛黃（人工牛黃）、大黃、雄黃、黃芩、生石膏、冰片、桔梗及甘草8味藥組成，其具有瀉火通便，清熱解毒的功效，在臨床上主要應(yīng)用于咽喉腫痛，頭痛牙痛，口舌生瘡等癥[4]，由于其清熱力比較強(qiáng)，在臨床中還可以治療因熱毒內(nèi)盛、風(fēng)火上攻所致的急性咽炎、急性口炎、復(fù)發(fā)性口瘡、急性牙齦（周）炎、急性結(jié)膜炎等疾病。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，牛黃解毒丸中牛黃，大黃，黃芩，桔梗等這些成分都具有抗炎，抗菌，抗氧化，保護(hù)肝腎的作用[5-8]。牛黃解毒丸可以顯著降低炎癥水平，但是其有效作用成分和作用機(jī)制卻還不清楚。

本研究以經(jīng)典名方牛黃解毒丸為研究對象，從證候?qū)?yīng)的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)炎癥入手，采用“質(zhì)譜分析-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測-活性驗(yàn)證”的整合研究策略進(jìn)行研究。為使得臨床應(yīng)用成分與網(wǎng)絡(luò)分析后的成分一致，先借助高分辨質(zhì)譜技術(shù)，分析牛黃解毒丸中的成分，然后采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，借助BATMAN-TCM這個(gè)平臺，搜索成分相關(guān)的靶標(biāo)，再用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）這個(gè)數(shù)據(jù)平臺，搜索炎癥相關(guān)靶標(biāo)，并對得到的成分和靶標(biāo)做分子對接和體外活性驗(yàn)證，以此幫助明確牛黃解毒丸抗炎機(jī)制，為臨床使用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 超高效液相色譜儀（Agilent，美國，型號：HPLC 1290）;5600+質(zhì)譜儀（AB Sciex Instruments，美國，型號：Triple TOF 5600+）;多功能酶標(biāo)儀（ThermoFisher，美國，型號：SpectraMax iD5）;電子天平（梅特勒-托利多集團(tuán)，瑞士，型號：Toledo PL402-L）。

1.1.2 試劑 質(zhì)譜級甲醇（賽默飛世爾科技有限公司，美國，批號：A456-4）;質(zhì)譜級乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，批號：A955-4）;色譜純甲醇（賽默飛世爾科技有限公司，美國，批號：643023256）;娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號：GB17323）;環(huán)氧化酶-2抑制劑篩選試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：052421210531）

1.1.3 分析樣品 牛黃解毒丸[北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，批號：18010695];阿司匹林（廣東九明制藥有限公司，批號：H44021139）;大黃酸（成都克洛瑪生物科技有限公司，貨號：CHB-D-006，純度≥98%）、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（成都克洛瑪生物科技有限公司，貨號：CHB-Q-002，純度≥98%）。

1.2 供試品制備 取牛黃解毒丸（大蜜丸）1粒（3 g），用剪刀剪碎，并加入適量硅藻土與丸劑一起研磨，分散均勻后，精密加入質(zhì)譜甲醇100 mL，超聲提取45 min，放冷，濾過，即得供試品溶液，將制得的樣品進(jìn)樣進(jìn)行化學(xué)成分分析。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC Xbridge C18 Column（2.5 μm，2.1 mm×150 mm），流動相A為0.1%的甲酸水，B為乙腈，洗脫程序見表1。柱溫為35 ℃，進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用正/負(fù)離子模式（ESI+/-），采集范圍為5～1 200 Da，采用獨(dú)立數(shù)據(jù)采集（Independent Data Acquisition，IDA）模式，碰撞電壓為35 V，毛細(xì)管電壓為4 500 V（負(fù)離子）和5 500 V（正離子），離子源溫度為400 ℃（負(fù)離子）和550 ℃（正離子），去簇電壓為60 V。氣簾氣流量為25 L/min，Gas1和Gas2氣流量均為50 L/min，所有氣體均為氮?dú)狻?/p>

1.4 牛黃解毒丸化學(xué)成分及炎癥相關(guān)靶標(biāo)搜集?? 基于生物信息學(xué)分析平臺BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性（得分>20分）對經(jīng)過液質(zhì)分析后牛黃解毒丸中的成分進(jìn)行藥物靶標(biāo)預(yù)測。采用OMIM平臺（www.omim.org），以炎癥（inflammation）為檢索詞，搜索炎癥相關(guān)靶標(biāo)。

1.5 牛黃解毒丸抗炎核心靶標(biāo)篩選 將牛黃解毒丸液質(zhì)分析所得化學(xué)成分靶標(biāo)與炎癥相關(guān)靶標(biāo)取交集，利用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)（PPI score>0.4），然后將這些靶標(biāo)導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行可視化分析，利用連接度（Degree），介度（Betweenness），緊密度（Closeness）3個(gè)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行篩選，篩選條件為同時(shí)大于等于這3個(gè)參數(shù)值的中位數(shù)，以此進(jìn)一步縮小牛黃解毒丸抗炎核心靶標(biāo)的范圍。在可視化分析得到的核心靶點(diǎn)的關(guān)系圖中，靶點(diǎn)圖標(biāo)的形狀越大，表明該靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中與其相關(guān)的其他靶點(diǎn)越多、在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要;靶點(diǎn)間的連接線越粗，表明相關(guān)靶點(diǎn)蛋白間的Degree值越大，二者間的生物關(guān)聯(lián)度越高。

1.6 通路富集分析 將上述分析的核心靶點(diǎn)使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。以P<0.05為閾值，從中篩選牛黃解毒丸抗炎潛在的信號通路，并且P值越小表明富集得到的通路的可信度越高;“數(shù)量”表示該條通路富集的靶標(biāo)數(shù)。利用Cytoscape軟件，將富集到的通路、核心靶點(diǎn)以及其對應(yīng)的化學(xué)成分繪制成“藥物-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，全面闡明牛黃解毒丸抗炎的機(jī)制。

1.7 分子對接驗(yàn)證 為驗(yàn)證牛黃解毒丸抗炎潛在靶點(diǎn)準(zhǔn)確性，將部分核心靶標(biāo)與其對應(yīng)的成分進(jìn)行分子對接。在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）下載核心靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)，并保存為*.pdb格式文件;將藥物成分分子式導(dǎo)入Chem 3D軟件（18.0）進(jìn)行能量優(yōu)化后保存為*.pdb格式，然后利用Auto Dock軟件（4.2.6）進(jìn)行對接，找到最佳構(gòu)象后然后利用Pymol軟件可視化分析。一般認(rèn)為，結(jié)合能<0，則認(rèn)為該成分與靶點(diǎn)能夠結(jié)合在一起，結(jié)合能越低，則二者結(jié)合能力越強(qiáng)，形成的構(gòu)象也就越穩(wěn)定。

1.8 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 利用環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑篩選試劑盒檢測其有效成分的抗炎活性，阿司匹林為陽性藥。試劑盒中提供了人重組COX-2（Recombinant Human COX-2，rhCOX-2）、底物（Substrate）、輔助因子（Cofactor）及可以被COX-2催化產(chǎn)生熒光的熒光探針（Probe）反應(yīng)生成的強(qiáng)熒光探針，檢測時(shí)的激發(fā)波長為560 nm，發(fā)射波長為590 nm。COX-2抑制率的計(jì)算，抑制率（%）=（RFU100%酶活性對照-RFU樣品）/（RFU100%酶活性對照-RFU空白對照）×100%。

2 結(jié)果

2.1 牛黃解毒丸化學(xué)成分分析 通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)共鑒定出236種化合物：其中黃酮60種，類黃酮18種，查耳酮6種，色原酮2種，蒽醌45種，蒽酮4種，萜類35種，甾體10種，香豆素6種，苯乙醇苷5種，二苯乙烯類6種，油脂3種，有機(jī)酸5種，其他31種。見圖1～2，表2。

2.2 牛黃解毒丸成分靶標(biāo)及疾病靶標(biāo)分析結(jié)果?? 基于液質(zhì)分析后得到的236個(gè)成分，利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，分析這些成分作用的靶標(biāo)，提取評分大于20的成分靶標(biāo)作為潛在的藥物成分靶標(biāo)，去除重復(fù)值以后共得到456個(gè)化合物靶標(biāo)。利用OMIM數(shù)據(jù)庫，共篩選得到158個(gè)與炎癥相關(guān)的疾病靶標(biāo)。

2.3 核心靶標(biāo)篩選 將分析到的藥物成分靶標(biāo)與炎癥相關(guān)靶標(biāo)取交集，共得到21個(gè)共有的靶標(biāo)，將這21個(gè)靶標(biāo)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，去除沒有相互作用關(guān)系的邊緣靶標(biāo)蛋白，將剩下的靶標(biāo)導(dǎo)入到Cytoscape中，以Degree、Betweenness、Closeness這3個(gè)拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)（分別為9.500 0、0.015 3、0.613 5）作為篩選條件，最終獲取牛黃解毒丸抗炎的11個(gè)核心靶標(biāo)，并且在11個(gè)核心靶標(biāo)中，IL-10、CCL2、IL-1β和PTGS2這4個(gè)靶點(diǎn)的形狀最大，表明與其發(fā)生直接（或間接）生物信息關(guān)聯(lián)的其他蛋白靶標(biāo)最多，在網(wǎng)絡(luò)中的作用更為重要。見圖3。

2.4 KEGG通路分析和藥物-成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于11個(gè)核心靶標(biāo)，通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)并得到27條信號通路，根據(jù)通路富集顯著度評價(jià)參數(shù)P值的大小，現(xiàn)出了排名靠前的10條通路。其中細(xì)胞因子受體相互作用通路（Cytokine-cytokine Receptor Interaction）、TNF信號通路（TNF Signaling Pathway）、核因子κB信號通路（NF-kappa B Signaling Pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like Receptor Signaling Pathway toll）、趨化因子信號通路（Chemokine Signaling Pathway）、NOD樣受體信號通路（NOD-like Receptor Signaling Pathway）等，均與炎癥有著緊密的關(guān)系，并為牛黃解毒丸發(fā)揮抗炎作用的潛在信號通路。見表3。

此外，在“藥物-成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中涉及PTGS2，IL-1β，IL-10，CCL2，IL-13等11個(gè)靶標(biāo)和大黃酸，齊墩果酸，白藜蘆醇等14個(gè)成分，以及TNF信號通路（TNF signaling pathway）、NF-κB信號通路（NF-kappa B Signaling Pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like Receptor Signaling Pathway）、趨化因子信號通路（Chemokine Signaling Pathway）等27條信號通路。其中核心靶點(diǎn)對應(yīng)的成分中，白藜蘆醇（89）、大黃酸（90）、大黃酚（107）、表兒茶素5，3′-O-β-D-葡萄糖苷（187）與蟲漆酸D（188）5種成分源于大黃，甘草醇C（113）、光甘草定（157）、Glyasperin C（165）和光甘草素（171）4種成分源于甘草，派立托胺（84）源于黃芩，齊墩果酸（227）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（234）源于桔梗，麥角甾醇（196）源于人工牛黃，硬脂酸（233）源于桔梗。以上結(jié)果從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的角度整體上揭示了牛黃解毒丸抗炎潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。見圖4。

2.5 分子對接分析 選取牛黃解毒丸抗炎作用核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中（圖3）最為重要的4個(gè)靶標(biāo)PTGS2，IL-1β，CCL2，IL-10及與其對應(yīng)的化學(xué)成分進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn)，從計(jì)算的角度驗(yàn)證以上預(yù)測的準(zhǔn)確性。將每個(gè)靶點(diǎn)與其對應(yīng)成分對接的結(jié)果按照結(jié)合能大小依次排列。結(jié)合能小于0代表靶點(diǎn)與成分可以結(jié)合到一起，值越小則說明結(jié)合能力越強(qiáng)。其中PTGS2與齊墩果酸（-10.55 kcal/mol）、蟲漆酸D（-9.6 kcal/mol）、大黃酸（-8.2 kcal/mol）均具有較好的結(jié)合能力;IL-1β與蟲漆酸D（-8.36 kcal/mol）、大黃酸（-8.09 kcal/mol）的結(jié)合能力最佳;IL-13與蟲漆酸D（-8.23 kcal/mol）、大黃酸（-7.83 kcal/mol）結(jié)合能力最佳;CCL2與硬脂酸的結(jié)合能為-4.08 kcal/mol （1 kcal=4.184 J）。見表4。

2.6 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 基于分子對接的結(jié)果，選取炎癥介質(zhì)前列腺素合酶2（Prostaglandin Synthase，PTGS2）及其對應(yīng)的化學(xué)成分大黃酸和齊墩果酸，進(jìn)行體外活性驗(yàn)證。利用環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑篩選試劑盒檢測其有效成分的抗炎活性，阿司匹林為陽性藥。抑制COX-2的劑量反應(yīng)曲線結(jié)果見圖5，與陽性藥阿司匹林（IC50=1 063.4 nmol/L）比較，大黃酸（IC50=250 nmol/L）有較好的COX-2抑制活性，齊墩果酸抑制COX-2活性稍弱，但阿司匹林的最大抑制率要高于大黃酸和齊墩果酸。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了分子對接的部分結(jié)果以及牛黃解毒丸中抗炎的活性成分。

3 討論

本研究先通過高分辨質(zhì)譜技術(shù)，得到牛黃解毒丸中的236個(gè)成分，然后利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，分析得到11個(gè)核心靶標(biāo)，對應(yīng)14個(gè)化學(xué)成分，經(jīng)KEGG分析發(fā)現(xiàn)有27條相關(guān)通路。其中涉及的核心靶標(biāo)有PTGS2、IL-10、IL-1β、CCL2、IL-13等11個(gè)核心靶標(biāo)，與之相對應(yīng)的有大黃酸，齊墩果酸，白藜蘆醇等這些成分。

大黃酸具有顯著抗炎作用，有實(shí)驗(yàn)證明，大黃酸及其前體藥物雙醋瑞可以下調(diào)高熱幼鼠腹腔液和非肥胖型糖尿病小鼠血清中IL-1β、IL-12和TNF-α細(xì)胞因子的濃度[9-10]。齊墩果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，具有抗炎、抗病毒等許多藥理作用，連俊江等[11]在研究齊墩果酸對SW982細(xì)胞的毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)齊墩果酸可以通過調(diào)節(jié)促分裂原活化的蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B ，PI3K/AKT）和核因子κB信號通路而抑制IL-1β刺激的炎癥介質(zhì)的表達(dá)。白藜蘆醇，一種多酚類化合物，王鵬[12]在對白藜蘆醇抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效及機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能抑制IL-1β的分泌，緩解關(guān)節(jié)組織中炎性細(xì)胞的浸潤。

核心靶標(biāo)中，PTGS2又稱COX-2，是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶其中的一個(gè)亞型，參與細(xì)胞生長，發(fā)育以及多種炎癥反應(yīng)[13]，在正常情況下，COX-2在組織細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而當(dāng)處于病理狀態(tài)時(shí)，表達(dá)量就會上調(diào)[14]。CCL2是趨化因子的一種，在炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)等生理病理過程中發(fā)揮著重要作用[15]，炎癥反應(yīng)會引導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生定向遷移，加速釋放炎癥介質(zhì)，并形成惡性循環(huán)[16]。IL-13是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的多效性細(xì)胞因子，是引起氣道炎癥反應(yīng)的始動因子，在哮喘及過敏性氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[17]。IL-1β是針對真菌感染的炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要的炎癥介質(zhì)[18-19]。在體外活性實(shí)驗(yàn)中，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，選取PTGS2靶標(biāo)對應(yīng)的大黃酸和齊墩果酸這2個(gè)成分進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了大黃酸和齊墩果酸對于炎癥介質(zhì)PTGS2均有一定的抑制作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，涉及NF-κB，TNF，Toll樣受體等27條信號通路。NF-κB是核蛋白因子，在參與炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖、分化與凋亡，免疫反應(yīng)等相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用[20]。Toll樣受體信號通路，趨化因子信號通路。腫瘤壞死因子包含兩大主要成員，TNF-α和TNF-β，其中TNF-α參與全身炎癥和免疫反應(yīng)[21]。Toll樣受體是介導(dǎo)天然免疫的重要模式識別受體，它在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中極其重要，控制著脂多糖炎癥信號的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)和NF-κB的激活，以及眾多炎癥介質(zhì)的釋放[22-23]。可見，多條通路都參與炎癥反應(yīng)，這同時(shí)也揭示了牛黃解毒丸抗炎機(jī)制。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，牛黃解毒丸通過大黃酸，白藜蘆醇，齊墩果酸等化合物，作用于PTGS2，CCL2，IL-1β，IL-13等這些靶點(diǎn)上，通過NF-κB，Toll樣受體，趨化因子等這些通路發(fā)揮抗炎作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Low A，Mak E，Rowe JB，et al.Inflammation and cerebral small vessel disease：A systematic review[J].Ageing Res Rev，2019，53：100916.

[2]Trépanier MO，Hopperton KE，Mizrahi R，et al.Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia：a systematic review[J].Mol Psychiatry，2016，21（8）：1009-1026.

[3]楊曉君，何洋，沈秦可，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討北沙參的抗炎機(jī)制[J].現(xiàn)代食品科技，2021，37（5）：31-37.

[4]王銀梅.牛黃上清丸（片）與牛黃解毒丸（片）之異同[J].湖北中醫(yī)雜志，2015，37（12）：50-50，51.

[5]梅慧奇，陳碧，黃增峰，等.體外培育牛黃對急性腦出血致全身炎癥反應(yīng)綜合征患者TNF-α、IL-6的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2008，17（12）：1663，1667.

[6]唐春麗，魏江存，滕紅麗，等.黃酮類成分抗炎活性及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2021，39（4）：154-159.

[7]任正肖，車萍，李紫薇，等.黃芩化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].山東化工，2021，50（3）：65-67.

[8]陳丹丹，洪挺，王棟，等.桔梗的化學(xué)成分及其藥理作用研究概況[J].藥品評價(jià)，2020，17（15）：9-11.

[9]Pasin JS，F(xiàn)erreira AP，Saraiva AL，et al.Diacerein decreases TNF-alpha and IL-1beta levels in peritoneal fluid and prevents Baker′s yeast-induced fever in young rats[J].Inflamm Res，2010，59（3）：189-196.

[10]Malaguti C，Vilella CA，Vieira KP，et al.Diacerhein downregulate proinflammatory cytokines expression and decrease the autoimmune diabetes frequency in nonobese diabetic （NOD） mice[J].Int Immunopharmacol，2008，8（6）：782-791.

[11]連俊江，程彬峰，高堯鑫，等.齊墩果酸對IL-1β誘導(dǎo)的SW982細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51（11）：1711-1716.

[12]王鵬.白藜蘆醇抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效及機(jī)制研究[D].青島：青島大學(xué)，2014.

[13]Echizen K，Hirose O，Maeda Y，et al.Inflammation in gastric cancer：Interplay of the COX-2/prostaglandin E2 and Toll-like receptor/MyD88 pathways[J].Cancer Sci，2016，107（4）：391-397.

[14]蔡凡，王紅艷，王毅盟，等.老年糖尿病患者對阿司匹林敏感性差異與炎癥因子的關(guān)系[J].內(nèi)科理論與實(shí)踐，2016，11（4）：234-239.

[15]王薇，布力布·吉力斯?jié)h，許春蕾，等.胃癌患者血清CCL2、ANXA2含量與癌細(xì)胞浸潤性生長的相關(guān)性研究[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2021，43（2）：404-412.

[16]Scanzello CR.Chemokines and inflammation in osteoarthritis：Insights from patients and animal models[J].J Orthop Res，2017，35（4）：735-739.

[17]Wills-Karp M，Chiaramonte M.Interleukin-13 in asthma[J].Curr Opin Pulm Med，2003，9（1）：21-27.

[18]Gao X，Zhao G，Li C，et al.LOX-1 and TLR4 aff ect each other and regulate the generation of ROS in A.fumigatus keratitis[J].Int Immunopharmacol，2016，40：392-399.

[19]Gringhuis SI，Kaptein TM，Wevers BA，et al.Dectin-1 is an extracellular pathogen sensor for the induction and processing of IL-1β via a noncanonical caspase-8 inflammasome[J].Nat Immunol，2012，13（3）：246-254.

[20]楊雷，鄧進(jìn)，鄧志紅.NFkB及其基因多態(tài)性與炎癥及腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].貴州醫(yī)藥，2016，40（10）：1098-1100.

[21]唐強(qiáng)，尹俠，朱路文，等.運(yùn)動預(yù)適應(yīng)對離體老齡大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心肌梗死面積及心肌組織炎癥反應(yīng)的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，23（12）：4-8.

[22]Zhu YG，Qu JM.Toll like receptors and inflammatory factors in sepsis and differential expression related to age[J].Chin Med J（Engl），2007，120（1）：56-61.

[23]徐穎，王爽，秦婷婷，等.復(fù)方銀花解毒顆粒對脂多糖致幼齡大鼠急性肺炎模型的抗炎作用及TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路的影響[J].中草藥，2021，52（1）：203-210.

（2022-03-10收稿 本文編輯：王明）