低氮源培養(yǎng)對鼠李糖乳桿菌脅迫耐受能力的影響

王岱，韓越眉,3，桂亞，虞星彤,3，瓦云超,3，顧瑞霞,3，張臣臣,3,4*

1(揚州大學 江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州，225127)2(揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇 揚州，225127) 3(揚州大學 益生菌與乳品深加工重點實驗室，江蘇 揚州，225127) 4(揚大康源乳業(yè)有限公司 江蘇省乳業(yè)生物工程技術研究中心，江蘇 揚州，225004)

益生菌具有維持腸道菌群穩(wěn)定、調(diào)節(jié)免疫、產(chǎn)生有益物質(zhì)、抑制病原微生物等益生作用[1]。其中乳酸菌及其發(fā)酵乳制品已成為目前最受歡迎的功能食品[2]，近年來在國內(nèi)亦受到越來越多的關注。

活性是乳酸菌在食品中進行發(fā)酵和在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的必要基礎。研究人員認為食品中益生菌的活菌數(shù)達到106～107CFU/g，日攝入量達到109CFU方能發(fā)揮較好的益生功能[3]。然而，乳酸菌在生產(chǎn)、貯藏、運輸和消費過程中，會遭受來自于工藝流程、宿主、及自身代謝所產(chǎn)生的多種脅迫，產(chǎn)生嚴重的活性損失[4]。因此，如何提高乳酸菌的脅迫耐受能力是重要的研究課題。

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)hsryfm 1301分離自中國巴馬的長壽老人，具有顯著功能特性[5]。該菌株對熱脅迫和氧化脅迫存在明顯的交叉適應[6]。將鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301分別在熱脅迫或氧化脅迫條件下進行轉(zhuǎn)錄組-表型匹配，發(fā)現(xiàn)多達32個寡肽轉(zhuǎn)運、肽酶和氨基酸代謝等氮代謝相關基因受到下調(diào)；進一步研究顯示，低氮源環(huán)境下培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌具有更強的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力[7]。降低培養(yǎng)環(huán)境中的氮源濃度有助于鼠李糖乳桿菌耐受生產(chǎn)過程(如噴霧干燥)中的熱脅迫和氧化脅迫。另一方面，氨基酸在乳酸菌的酸脅迫、膽鹽脅迫和滲透壓脅迫等的耐受中發(fā)揮積極作用[4, 8]。因此，氮源濃度的降低是否會影響菌株對其他脅迫的耐受尚未可知。

氮源作為所有培養(yǎng)基都不可或缺的成分，其含量對脅迫耐受的影響不容忽視。本文主要探究鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源環(huán)境下的脅迫耐受變化，以期提高菌株在生產(chǎn)中的脅迫耐受能力。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301于2013年分離自廣西省巴馬瑤族自治縣的長壽老人，具有顯著的降血脂功能[5]，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.8545)。

1.2 材料與試劑

胃蛋白酶(1∶10 000)、牛膽鹽，北京索萊寶科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix，寶日醫(yī)生物技術有限公司。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉浸粉8.0、酵母浸粉4.0、葡萄糖20.0、磷酸氫二鉀2.0、檸檬酸氫二銨2.0、乙酸鈉5.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.04、吐溫80 1.0，pH(6.5±0.2)。

不同氮源濃度的MRS培養(yǎng)基通過添加不同量的胰蛋白胨進行調(diào)整(表1)[7]。

表1 不同氮源濃度培養(yǎng)基中胰蛋白胨的濃度Table 1 Concentrations of tryptone peptone in the modified MRS media

人工胃液：氯化鈉5.0 g/L、胃蛋白酶3.0 g/L，用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.5。

膽鹽培養(yǎng)基：準確稱取一定量的膽鹽溶于MRS液體培養(yǎng)基中，使其膽鹽質(zhì)量濃度為1 g/L，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH(6.5±0.2)，高壓滅菌后(121 ℃，15 min)，冷卻備用。

1.3 儀器與設備

Biophotometer plus核酸蛋白測定儀、5424R臺式冷凍離心機，艾本德中國有限公司；JF-SX-500全自動滅菌鍋，日本TOMY公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；SPX-150BSH生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DNA水平電泳槽，北京六一生物科技有限公司；藍光透射儀，天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)與鑒定

從凍存管中取鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的凍干菌粉(約1.0 g)，置于10 mL MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；將菌液在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化；挑取單菌落，在MRS液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h；4 ℃保藏備用。

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%(體積分數(shù))的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。然后4 ℃，6 000×g離心10 min收集菌體。利用細菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取菌株的DNA，使用鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的菌株鑒定引物進行擴增，并與母株擴增圖譜進行比較[9]。

1.4.2 生長能力比較

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到含不同氮源濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，放置37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔1 h測1次OD600值，記錄不同培養(yǎng)基菌體OD600值到達0.5、1.0、2.0、3.0和4.0時的時間，每次測定平行3次。

1.4.3 活菌數(shù)測定

將處理樣品10倍梯度稀釋于MRS液體培養(yǎng)基，滴注5 μL稀釋液于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h；選擇菌落數(shù)在30～200(稀釋梯度為Tdilution)的菌斑計數(shù)為Ncolony。CFU計算方法：CFU/mL=10Tdilution×200×Ncolony[10]。

1.4.4 熱脅迫存活率測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到9支0P MRS和MRS培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜置培養(yǎng)至OD600值達到0.5。然后3支直接進行熱脅迫(54 ℃，1 h)處理；3支先經(jīng)溫和熱脅迫(46 ℃，1 h)預處理，再進行熱脅迫(54 ℃，1 h)處理；3支先經(jīng)溫和氧化脅迫(0.5 mmol/L H2O2，1 h)預處理，再進行熱脅迫(54 ℃，1 h)處理；分別測定處理前后的活菌數(shù)[6]。

1.4.5 氧化脅迫存活率測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到9支0P MRS和MRS培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜置培養(yǎng)至OD600值達到0.5。然后3支直接進行氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)處理；3支先經(jīng)溫和熱脅迫(46 ℃，1 h)預處理，再進行氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)；3支先經(jīng)溫和氧化脅迫(0.5 mmol/L H2O2，1 h)預處理，再進行氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)；分別測定處理前后的活菌數(shù)[6]。

1.4.6 不同生長階段耐熱和耐氧化脅迫能力的測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量分別轉(zhuǎn)接到0P MRS和 MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至OD600值達到0.5、1.0、2.0、3.0、4.0，然后每個階段分別進行熱脅迫(54 ℃，1 h)和氧化脅迫(1.6 mmol/L H2O2，1 h)處理，并測定每個階段經(jīng)熱脅迫和氧化脅迫后的活菌數(shù)。

1.4.7 菌株對模擬胃腸道環(huán)境耐受能力的測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達到2.0左右，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0 mL的菌懸液接種至9.0 mL的pH 2.5人工胃液，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0和3 h利用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復3次。

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達到2.0左右，離心收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液將菌體洗滌2次后懸浮，取1.0 mL的菌懸液接種至9.0 mL的0.1%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，分別在0和3 h用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復3次。

1.4.8 菌株對高滲透壓和低溫脅迫的耐受能力的測定

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達到2.0左右，離心收集菌體，用添加80 g/L NaCl的MRS培養(yǎng)基重懸，37 ℃培養(yǎng)4 h，分別在0和4 h用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復3次。

將活化好的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301按2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值達到2.0左右，取1 mL菌液凍存于-20 ℃，分別在0和24 h用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，計算其存活率(%)。每組重復3次。

1.4.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源條件下的生長能力

使用鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的菌株鑒定引物對活化菌株的DNA進行擴增，獲得的擴增圖譜與母株擴增圖譜一致(圖1-A、圖1-B)[10]，表明純化獲得的菌株即為鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301，實驗數(shù)據(jù)可與前期數(shù)據(jù)進行對比。

低氮源環(huán)境下培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌具有更強的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力[7]，但是氮源濃度同時會影響鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的生長能力。菌株在4種培養(yǎng)基中，OD600值均能在4 h達到1.0；在OD600值達到2.0之前，氮源濃度對鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的生長速度影響不大。隨著菌體的繼續(xù)生長，氮源開始成為限制因素，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的OD600值在0P MRS中達到3.0和4.0的時間均顯著晚于MRS培養(yǎng)基(超過1 h)(圖1-C)。值得注意的是，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的OD600值在0P MRS中最先到達0.5，在2P MRS中最遲到達 2.0，表明高濃度氮源能夠抑制菌株生長。在實際生產(chǎn)中應隨生長時期調(diào)整氮源濃度，以促進菌株的生長。

A-特異性引物對實驗菌株的擴增圖譜(H1～H4為鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301的特異性擴增引物對)；B-特異性引物對鼠 李糖乳桿菌hsryfm 1301母株的擴增圖譜；C-鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301在不同濃度氮源培養(yǎng)基中生長至特定濃度的時間圖1 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在不同濃度氮源培養(yǎng)基中的 生長情況Fig.1 Growth of L.rhamnosus hsryfm 1301 in media containing different concentrations of tryptone peptone 注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源培養(yǎng)下的熱脅迫-氧化脅迫交叉適應

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在MRS中對熱脅迫和氧化脅迫存在顯著的交叉適應[6]。同種脅迫預處理能夠?qū)⒕甑拿{迫耐受能力提高至將近90%以上；氧化預處理能夠?qū)⒕甑臒崦{迫存活率從1%提高至46%(圖2-A)，而熱預處理能夠?qū)⒕甑难趸{迫存活率從2%提高至20%(圖2-B)。這一特性有助于菌株耐受噴霧干燥等生產(chǎn)過程中的脅迫環(huán)境。

在0P MRS中，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301對熱脅迫和氧化脅迫的適應能力大幅提升，分別達到39%和35%；同種脅迫預處理能夠?qū)⒕甑拿{迫耐受能力進一步提升至80%以上(圖2-C～圖2-D)。而且氧化預處理使熱脅迫的耐受能力提高至96%(圖2-C)，熱預處理使氧化脅迫的耐受能力提高至69%(圖2-D)。因此，熱-氧化脅迫交叉適應仍然存在，雖然由于基礎耐受能力的上升導致了脅迫耐受提升倍數(shù)的下降，但是交叉適應獲得的脅迫耐受絕對值進一步提升。表明，氮源降低是實現(xiàn)熱-氧化脅迫交叉適應的重要原因，但不是唯一原因；在實際生產(chǎn)中可以通過脅迫預處理和氮源調(diào)整進一步提高鼠李糖乳桿菌的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。

A-MRS中熱預處理(46 ℃，1 h)和氧化預處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株熱脅迫(54 ℃，1 h)耐受能力的影響；B-MRS中熱預處理 (46 ℃，1 h)和氧化預處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)耐受能力的影響；C-0P MRS中 熱預處理(46 ℃，1 h)和氧化預處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株熱脅迫(54 ℃，1 h)耐受能力的影響；D-0P MRS中熱預處理 (46 ℃，1 h)和氧化預處理(0.5 mmol/L H2O2，1 h)對菌株氧化脅迫(2.0 mmol/L H2O2，1 h)耐受能力的影響圖2 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在MRS和0P MRS中的熱-氧化脅迫交叉適應Fig.2 The heat-oxidative stress cross adaptation of L.rhamnosus hsryfm 1301 in MRS and 0P MRS

2.3 低氮源環(huán)境下生長時期對菌株熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的影響

前期研究在OD600=0.5的條件下發(fā)現(xiàn)了鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的熱-氧化脅迫交叉適應現(xiàn)象，并通過轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)了降低氮源對熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的提升作用[6-7]，但是低氮源在其他生長時期的影響作用尚不清晰。將鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301分別在MRS和0P MRS中培養(yǎng)至OD600值達到0.5、1.0、2.0、3.0和4.0，并檢測菌體的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。

如圖3所示，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在不同生長階段表現(xiàn)出不同的耐熱能力。當菌株生長至OD600值為0.5、1.0、2.0和3.0時，0P MRS菌體的熱脅迫存活率均高于正常MRS組。尤其當OD600值達到2.0時，0P MRS組的存活率為73.7%，而MRS為0.57%，低氮源培養(yǎng)(0P MRS)后的存活率提高了129倍(圖3-A)。這表明在菌株的生長前期低氮源濃度培養(yǎng)有利于提高其耐熱能力。當OD600值達到4.0時，對照組的存活率與0P MRS組無顯著性差異。

A-熱脅迫(54 ℃，1 h)；B-氧化脅迫(1.6 mmol/L H2O2，1 h)圖3 氮源對不同生長時期鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301 熱脅迫和氧化脅迫耐受能力的影響Fig.3 Thermotolerance and aerotolerance of L.rhamnosus hsryfm 1301 during different growth stages in MRS and 0P MRS

同樣鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在不同的氮源濃度下各生長階段的氧化脅迫存活率所呈現(xiàn)出的規(guī)律和熱脅迫相似。在OD600值為0.5、1.0、2.0和3.0時，正常MRS培養(yǎng)后菌株的存活率顯著低于0P MRS。其中當OD600值為2.0時這種現(xiàn)象最為明顯，在這個生長時期低氮源培養(yǎng)(0P MRS)的存活率比正常MRS組提高了40倍(圖3-B)；而在OD600值為4.0時，低氮源組和正常組無顯著差異。這說明高濃度胰蛋白胨培養(yǎng)不利于菌株抗氧化。

因此，在工業(yè)生產(chǎn)中較為重要的指數(shù)期和穩(wěn)定前期，低氮源濃度環(huán)境下的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301有更強的耐熱和耐氧化能力；而且菌株在低氮源環(huán)境中生長至OD600值為2.0時，其耐熱能力和耐氧化能力最佳。

2.4 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在低氮源培養(yǎng)下的常見脅迫耐受能力

在指數(shù)期，低氮源濃度環(huán)境對鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的耐熱和耐氧化強化效果最佳。但是已有文獻表明，氮源對乳酸菌的脅迫耐受往往發(fā)揮積極作用。在高滲環(huán)境下，嗜酸乳桿菌會在胞內(nèi)累積脯氨酸[11]；半胱氨酸作為氧化還原酶的核心位點，有助于發(fā)酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌抵御氧化脅迫[12-13]。此外，唾液乳桿菌會利用蛋白水解系統(tǒng)產(chǎn)生更多的氨基酸來耐受膽鹽脅迫[14]。

因此，低氮源培養(yǎng)對鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301其他脅迫耐受能力的影響不可忽視。酸脅迫和膽鹽脅迫是益生菌研究中最為重要的脅迫種類，低氮源培養(yǎng)和正常培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301的酸脅迫存活率分別為8.9%和9.7%，差異不顯著，膽鹽脅迫存活率也未受到明顯影響，表明低氮源培養(yǎng)獲得的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301菌體不會在胃腸道環(huán)境耐受中處于劣勢。此外，冷凍脅迫和滲透壓脅迫也是乳酸菌產(chǎn)品加工及貯藏過程中常見的脅迫，低氮源培養(yǎng)及正常MRS培養(yǎng)獲得的鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301菌體對-20 ℃的冷凍脅迫和8% NaCl的滲透壓脅迫的耐受能力也沒有差異(表2)。表明低氮源培養(yǎng)菌體在氧化脅迫和熱脅迫耐受能力獲得強化的同時，常見脅迫的耐受能力未受影響。

表2 氮源對鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301常見脅迫耐受能力的影響Table 2 Tolerance of L.rhamnosus hsryfm 1301 to common stresses in MRS and 0P MRS

3 結(jié)論

減少培養(yǎng)基中蛋白胨的含量，鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301在穩(wěn)定前期以前的生長速度未受到顯著影響，交叉適應和低氮源配合進一步提高了菌株的熱脅迫和氧化脅迫耐受能力。指數(shù)期菌體在熱脅迫和氧化脅迫下的存活率大幅上升，而且酸脅迫、膽鹽脅迫、冷凍脅迫和滲透壓脅迫的耐受能力未受影響。低氮源培養(yǎng)和交叉適應配合將有利于提高菌株在噴霧干燥等造成熱脅迫和氧化脅迫的生產(chǎn)過程中的存活率。