原兒茶酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎的作用機(jī)制研究

張玉珠，于 超，鄭慧華，唐欣悅，黃榮磊，謝光洪

（吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,長春 130062）

子宮內(nèi)膜炎是一種感染性和炎癥性的子宮內(nèi)膜疾病，嚴(yán)重危害著人類和動(dòng)物的生殖系統(tǒng)[1]。研究表明，在小動(dòng)物臨床中約25%未絕育的母犬在10歲前會(huì)發(fā)生子宮疾?。ㄗ訉m內(nèi)膜炎、子宮蓄膿等）[2]，而大腸桿菌被認(rèn)為是引發(fā)子宮內(nèi)膜炎的最重要因素[3]。如果不治療，母犬可能會(huì)發(fā)展為內(nèi)毒素血癥、敗血癥或敗血性休克，從而危機(jī)生命[4]。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外壁的主要組成成分，一旦進(jìn)入機(jī)體，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生刺激，便會(huì)激活機(jī)體中宿主細(xì)胞細(xì)胞膜表面的Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路，隨后導(dǎo)致其下游介質(zhì)中核因子-κB（NF-κB）的激活,會(huì)釋放炎性細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等），從而導(dǎo)致機(jī)體損傷[5]，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB抑制劑（IκB）蛋白與p65從失活狀態(tài)發(fā)生磷酸化（p-p65和p-IκB），從而啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。髓過氧化物酶（MPO）是一種血紅素蛋白，是中性粒細(xì)胞的主要組成成分，MPO活性越高，說明炎癥反應(yīng)越強(qiáng)烈[7]。上述指標(biāo)均可用于判斷LPS誘導(dǎo)建立的小鼠子宮內(nèi)膜炎模型是否成功。研究表明，抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)子宮內(nèi)膜炎具有保護(hù)作用[8]。因此，尋找一種能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的藥物對(duì)子宮內(nèi)膜炎的治療是非常重要的。

目前，對(duì)子宮內(nèi)膜炎的治療主要依賴抗生素，但抗生素的使用導(dǎo)致耐藥性和藥物殘留增加，已成為小動(dòng)物臨床和養(yǎng)殖業(yè)的一大隱患[9]。因此，亟待尋找一種治療子宮內(nèi)膜炎的新方法。近年來，中藥因其安全性好、毒副作用少、無殘留等優(yōu)點(diǎn)在臨床用藥中越來越受重視，在輔助治療炎癥性疾病方面也越來越受重視，因此中藥及其活性成分的研究與開發(fā)也成為了人們關(guān)注的熱點(diǎn)。原兒茶酸是花青素的酚類化合物，存在于水稻、洋蔥、迷迭香、肉桂、芙蓉、丹參等中[10]，具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗氧化等[11]。研究表明，原兒茶酸可改善LPS刺激引起的仔豬腸道炎癥反應(yīng)[12]；可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路抑制LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[13]；還可以通過調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)[14]，然而原兒茶酸對(duì)子宮內(nèi)膜炎是否具有抑制炎癥反應(yīng)尚不清楚。本試驗(yàn)利用LPS建立小鼠子宮內(nèi)膜炎模型，通過檢測(cè)子宮組織的病理變化、MPO活性、炎性因子含量以及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白來探討原兒茶酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎的作用機(jī)制，以期為將原兒茶酸用于臨床上治療炎癥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)管理

60只健康BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限責(zé)任公司，雌性，6～8周齡，體重18～22 g，于室溫（24±1）℃、相對(duì)濕度55%、12 h循環(huán)光照適應(yīng)1周，將小鼠隨機(jī)分為5籠，每籠各12只，飼喂常規(guī)飼糧，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要試劑

原兒茶酸（純度>98%）購自成都優(yōu)選生物技術(shù)有限公司；LPS購自Sigma公司；MPO測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒均購自Biolegend公司；抗NF-κB p65和IκB抗體均購自Danvers公司；Anti-mouse和Anti-rabbit二抗均購自CST公司；胎牛血清購自CLARK公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自Thermo公司；PBS緩沖液購自Solarbio公司。

原兒茶酸配制：稱取40 mg原兒茶酸溶于1 mL DMSO中配成40 mg/mL溶液，待藥物完全溶解后，分裝到EP管中于-20 ℃保存待用。根據(jù)小鼠具體體重和不同濃度原兒茶酸（20、40、80 mg/kg）組計(jì)算所需劑量，然后用生理鹽水稀釋到400 μL。

LPS配制：以PBS溶解，配成10 mg/mL，-20 ℃保存，使用時(shí)室溫解凍后，稀釋10倍配成濃度為1 mg/mL的LPS溶液。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、LPS+不同濃度原兒茶酸（20、40、80 mg/kg）組共5組，每組各12只。 對(duì)照組小鼠用微量注射器經(jīng)陰道灌注50 μL生理鹽水，LPS組灌注50 μL LPS（1 mg/mL，溶解于無菌PBS中）[8]， 原兒茶酸治療組灌注50 μL LPS前1 h分別腹腔注射20、40、80 mg/kg原兒茶酸，注射24 h后，頸椎脫臼法處死所有小鼠，收集子宮組織，一部分用10%福爾馬林固定，一部分于-80 ℃保存待測(cè)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 組織病理變化檢測(cè) 子宮組織在10%福爾馬林中固定24 h以上，經(jīng)過脫水、組織透明后在石蠟液中浸蠟，制成石蠟組織塊，并用切片機(jī)切成5 μm切片。將切片附在載玻片上，烘干。經(jīng)過脫蠟、沖洗、HE染色后再脫水，透明后封片，鏡檢觀察，采集圖像。

1.4.2 MPO活性檢測(cè) 取小鼠子宮組織，加入PBS于冰上進(jìn)行稱量和研磨，然后按照MPO檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)子宮組織的MPO活性，用分光光度計(jì)測(cè)定D460 nm值。

1.4.3 炎性因子檢測(cè) 采用ELISA法按照TNF-α、IL-6和IL-1β試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值，計(jì)算子宮組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.4.4 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 稱取小鼠子宮組織，與PBS溶液按重量體積比為1∶9加入勻漿器中研磨，將勻漿液收集至EP管中，采用BCA法測(cè)定蛋白的濃度。通過SDS-PAGE進(jìn)行分離后，利用濕轉(zhuǎn)法將這些蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用3%胎牛血清室溫封閉3 h，與一抗（1∶1 000） 4 ℃孵育過夜，二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h。將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯像，采集圖像。用ImageJ 1.48軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 原兒茶酸對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠子宮組織的影響

由圖1可知，對(duì)照組（圖1A）小鼠子宮組織形態(tài)正常，子宮內(nèi)膜上皮結(jié)構(gòu)正常；LPS組小鼠子宮組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤和子宮內(nèi)膜上皮充血及水腫（圖1B）。與LPS組相比，隨著原兒茶酸濃度的增加，小鼠子宮組織中炎性細(xì)胞明顯減少，子宮內(nèi)膜上皮充血水腫情況也明顯得到改善（圖1C～1E）。

A，對(duì)照組；B，LPS組；C，LPS+20 mg/kg原兒茶酸組；D，LPS+40 mg/kg原兒茶酸組；E，LPS+80 mg/kg原兒茶酸組A,Control group;B,LPS group;C,LPS+20 mg/kg protocatechuic acid group;D,LPS+40 mg/kg protocatechuic acid group;E,LPS+80 mg/kg protocatechuic acid group圖1 各組小鼠子宮組織病理變化（100×）Fig.1 Pathological changes of mouse uterus tissues in each group （100×）

2.2 原兒茶酸對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠子宮組織MPO活性的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，LPS組MPO活性極顯著升高（P<0.01）；與LPS組相比，原兒茶酸治療組MPO活性均極顯著降低（P<0.01），并呈劑量依賴性。結(jié)合病理檢測(cè)中對(duì)照組和LPS組病理變化，說明LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎模型構(gòu)建成功。

①1～5，分別代表對(duì)照組、LPS組、LPS+20 mg/kg原兒茶酸組、LPS+40 mg/kg原兒茶酸組、LPS+80 mg/kg原兒茶酸組。②與對(duì)照組相比，#，差異極顯著（P<0.01）。③與LPS組相比，*，差異顯著（P<0.05）；**，差異極顯著（P<0.01）。下同①1-5,Control group,LPS group,LPS+20 mg/kg protocatechuic acid group,LPS+40 mg/kg protocatechuic acid group,LPS+80 mg/kg protocatechuic acid group,respectively.②Compared with control group,#，Extremely significant difference （P<0.01）.③Compared with LPS group,*,Significant difference （P<0.05）,**,Extremely significant difference （P<0.01）.The same as below圖2 各組小鼠子宮組織MPO活性Fig.2 MPO activity of mouse uterus tissues in each group

2.3 原兒茶酸對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠子宮組織炎性因子的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，LPS組小鼠子宮內(nèi)膜組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，原兒茶酸治療組小鼠子宮內(nèi)膜組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均極顯著降低（P<0.01），并呈劑量依賴性。

圖3 各組小鼠子宮組織中炎性細(xì)胞因子含量Fig.3 Contents of inflammatory cytokine in uterine tissues of mice in each group

2.4 原兒茶酸對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠子宮組織NF-κB信號(hào)通路的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，LPS組p-p65和p-IκB蛋白的表達(dá)水平均極顯著升高（P<0.01）。與LPS組相比，原兒茶酸治療組p-p65和p-IκB的表達(dá)水平均極顯著降低（P<0.01），且呈劑量依賴性。

圖4 各組小鼠子宮組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expressions of NF-κB signaling pathway related protein in uterine tissues of mice in each group

3 討 論

子宮內(nèi)膜炎是指子宮黏膜發(fā)生細(xì)菌感染而致的炎癥，是導(dǎo)致動(dòng)物不孕的重要原因之一[15]。在小動(dòng)物臨床，常發(fā)生于未絕育成年母犬，病原微生物感染被認(rèn)為是主要的發(fā)病原因[16]。而LPS是革蘭氏陰性菌外壁的主要組成成分，廣泛用于炎癥相關(guān)領(lǐng)域研究，如急性肺炎[17]、急性肝炎[18]、心肌炎[19]等。原兒茶酸是花青素的主要生物活性代謝產(chǎn)物，存在于杜仲、高寒和冬青等植物體內(nèi)，且具有抗氧化[20]、抗炎作用[21]。本研究中，LPS作用于小鼠子宮引發(fā)子宮內(nèi)膜發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)生嚴(yán)重的病理改變，如嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤和子宮內(nèi)膜上皮充血且水腫。而原兒茶酸的治療組炎性細(xì)胞浸潤減少，子宮內(nèi)膜的充血、水腫減輕，這說明原兒茶酸可以有效改善小鼠子宮內(nèi)膜炎的病理損傷。MPO是中性粒細(xì)胞富含的蛋白質(zhì)[7]，其活性越高，說明炎癥反應(yīng)越劇烈。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜組織中中性粒細(xì)胞增多且MPO活性增高，而經(jīng)原兒茶酸治療后MPO活性顯著降低，說明原兒茶酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎能起到保護(hù)作用，降低炎性反應(yīng)，減少中性粒細(xì)胞的浸潤，且隨著濃度的增高，效果更加顯著。

炎癥是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，而過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。研究表明，許多炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生與疾病發(fā)生過程中的炎癥有關(guān)，而炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6在子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用[22]，這些炎癥因子會(huì)對(duì)子宮和子宮組織造成損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS可誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，而原兒茶酸可顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，表明原兒茶酸可通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。因此，抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能是治療子宮內(nèi)膜炎的一個(gè)靶點(diǎn)。NF-κB是脊椎動(dòng)物的一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、免疫、細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[23]。當(dāng)機(jī)體炎癥升高，會(huì)刺激NF-κB信號(hào)通路活化，從而導(dǎo)致IκB和p65磷酸化表達(dá)增加[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS處理的小鼠子宮內(nèi)膜中p-p65和p-IκB的表達(dá)水平均極顯著增加，原兒茶酸治療極顯著降低了p-p65和p-IκB的表達(dá)，從而抑制NF-κB的活性。因此，原兒茶酸能夠抑制LPS誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜炎中NF-κB信號(hào)通路的激活，從而對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜炎起到保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，原兒茶酸可通過減少LPS處理的小鼠子宮組織中的炎性細(xì)胞，減輕子宮內(nèi)膜的充血、水腫，降低子宮組織MPO活性，抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生及NF-κB信號(hào)通路的激活，從而對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎起到保護(hù)作用。