穿王消炎粉對LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的治療作用

王 璐，胡盼盼，程 佳，孫盼盼，孫 娜，范闊海，尹 偉，李宏全，孫耀貴

（中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

穿王消炎粉是山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室依據(jù)國家藥品標準[1]收載的“穿王消炎片”（標準號為:WS-10487（ZD-0487）-2002，主要功效為消炎解毒，用于痰熱咳喘，腹痛，以及急慢性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎，急性腸胃炎、急性菌痢見以上癥狀者），按照《中獸藥、天然藥物分類及注冊資料要求》[2]屬第三類下第2項“現(xiàn)代中獸藥復(fù)方制劑”要求，將穿心蓮和了哥王兩味中藥經(jīng)提取制備而成，以為畜禽呼吸道和消化道感染性疾病的防治提供新的治療藥物，且滿足在飼料中添加解決畜禽群體給藥的需要。穿心蓮是爵床科植物穿心蓮（Andrographispaniculata（Burm.f.） Nees）的干燥地上部分[3]，性寒，味苦，歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)，主要功效為清熱解毒、涼血、消腫，藥用活性成分主要為二萜內(nèi)酯類、黃酮類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類等，具有抗菌、抗病毒、抗炎、解熱、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗心血管疾病等作用[4-5]，臨床上主要用于治療呼吸道和消化道感染等疾病[6]。 了哥王（Wikstroemiaindica）是瑞香科蕘花屬植物南嶺蕘花的干燥根或根皮[7]，性寒，味苦、微辛，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結(jié)、消腫止痛、通經(jīng)利水等功效，主要活性成分為香豆素類、黃酮類和木脂素類[8]，具有消炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[9]，主要用于治療支氣管炎、肺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。

病原微生物感染引發(fā)的呼吸道疾病對畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了嚴重的危害，其引起的急性肺損傷（ALI）是造成畜禽呼吸衰竭乃至死亡的重要原因[10]。研發(fā)安全、有效的用于防治ALI的新獸藥已成為研究熱點，對于降低畜禽呼吸道感染性疾病的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。以脂多糖（LPS）為代表的生物因素誘導(dǎo)的ALI模型是評價篩選防治ALI藥物的最常用的方法[11]。研究表明，穿心蓮活性成分穿心蓮內(nèi)酯能夠緩解LPS誘導(dǎo)的ALI[12]。有關(guān)了哥王對ALI的治療作用的研究鮮見報道。本試驗通過LPS誘導(dǎo)的ALI模型，開展穿王消炎粉對ALI的治療作用研究，以為其后續(xù)臨床試驗研究、新獸藥注冊申報及在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 60只體重160～200 g的SD雄性大鼠，購自北京斯貝福公司，飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物管理中心（溫度23～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光/暗周期），以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 藥物與試劑 穿王消炎粉制備：穿心蓮和了哥王生藥購自河北省安國市祁源中藥材有限公司。按處方配比（3∶2）分別稱取穿心蓮和了哥王，將穿心蓮粉碎成粗粉，用85%的乙醇熱浸2次，每次2 h，合并提取液，靜置并過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，濃縮成浸膏備用；了哥王水煎2次，每次5 h，混合煎液并過濾。將了哥王濾液與穿心蓮濃縮液混合，濃縮成稠膏，低溫烘干后粉碎、過篩成細粉。分別稱量2、4、8 g穿王消炎粉干粉于20 mL CMC-Na溶液中，混合均勻。鹽酸左氧氟沙星藥液配制：稱取14 mg鹽酸左氧氟沙星藥粉（鹽酸左氧氟沙星膠囊，國藥準字H19990051，購自揚子江藥業(yè)集團有限公司）溶于20 mL CMC-Na溶液中，混合均勻。LPS（大腸桿菌055∶B5，貨號L8880，純度≥99%）購自Solarbio公司；白細胞介素-1β（IL-1β） ELISA試劑盒（貨號：E02I0010）、IL-6 ELISA試劑盒（貨號：E02I0006）均購自上海藍基生物科技有限公司；TRIzol和兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；RIPA buffer和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸酶抑制劑購自Bimake公司；蛋白酶抑制劑購于Solarbio公司；蛋白Marker購自Thermo公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β抗體（貨號:bs-0812R）、IL-6抗體（貨號:bs-0782R）和GAPDH抗體（貨號:bs-10900R）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG（貨號:CW0103S）購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機（Leica公司）；高速低溫離心機（Eppendorf公司）；倒置顯微鏡（Leica公司）；7500定量PCR儀（Bio-Rad公司）；多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司）；電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.2 試驗處理

將SD大鼠隨機分為6組，具體為：空白組（Control）、左氧氟沙星陽性藥物對照組（Levofloxacin）、LPS模型組（Model）、穿王消炎粉低劑量組（Low，1 g/kg體重）、穿王消炎粉中劑量組（Mid，2 g/kg體重）、穿王消炎粉高劑量組（High，4 g/kg 體重）。采用滴鼻LPS的方法制備大鼠ALI模型[13]。除空白組外,其余試驗組大鼠均滴鼻LPS（3 mg/kg體重），24 h后穿王消炎粉給藥組每日灌服相應(yīng)濃度的穿王消炎粉溶液，陽性藥物對照組灌胃左氧氟沙星溶液（7 mg/kg體重），空白組及模型組灌胃相同體積的生理鹽水。每天16:00灌胃，在治療的第4天處死，并剖檢大鼠，采集肺臟樣本。

1.3 觀察和檢測指標

1.3.1 臨床癥狀觀察 每日灌胃前觀察各組大鼠的精神狀態(tài)，飲食以及呼吸情況。

1.3.2 肺臟組織濕/干重比 從剖檢的肺臟中收集右肺右上葉和右中葉，除去脂肪后立即稱重。將稱重后的肺臟組織放在60 ℃烘箱中干燥72 h，72 h后從烘箱中取出肺臟組織再次稱重，并計算大鼠肺臟組織的濕/干重比。

1.3.3 肺臟組織病理學(xué)觀察 取右肺右下葉和右后葉，除去肺臟組織表面的脂肪，用濾紙吸干表面液體，固定于Bouin’s液中24 h，將固定好的組織用70%酒精浸泡3次以上，每次6 h，脫水、透明、石蠟包埋，切厚度為5 μm的切片，通過梯度乙醇將切片脫水，然后進行蘇木精-伊紅（HE）染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝組織病理學(xué)變化。

1.3.4 血清中IL-1β、IL-6含量 采用ELISA方法測定。將96孔酶標包被板各孔編號并記錄，按照說明書依次在標準孔中加入不同濃度的標準品50 μL，空白孔加入50 μL樣本稀釋液，待測樣品孔加入40 μL樣本稀釋液和10 μL待測樣本，并設(shè)置3個平行，除空白孔外其余各孔均加入100 μL酶標試劑。用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育1 h，洗板5次，后加入顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15 min，加終止液50 μL，測定450 nm各孔吸光度，繪制標準曲線，計算樣品實際蛋白濃度。

1.3.5 肺臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA表達水平 取凍存的左肺組織放到裝有液氮的研缽中，充分研磨后，稱取0.2 g加入1 mL TRIzol，按步驟提取總RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。 在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找目的基因序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由西安擎科澤西生物公司合成，引物序列見表1。以GAPDH為管家基因，采用實時熒光定量PCR檢測IL-1β和IL-6基因的表達，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.6 肺臟組織中IL-1β和IL-6蛋白表達量 將凍存的肺臟組織研磨后，每個樣品用1 mL含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA Buffer進行裂解，在冰上靜置40 min，每隔10 min振蕩1次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分層后的上清即為肺臟組織的總蛋白。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度后將蛋白變性（95 ℃，10 min）。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入IL-1β抗體、IL-6抗體和GAPDH抗體,4 ℃搖床過夜孵育，后用TBST洗3次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。內(nèi)參對照為GAPDH，使用Image J軟件通過掃描光密度測定法分析蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計分析軟件中單因素方差分析（One-Way ANOVA）和多重比較（LSD）分析各組大鼠各觀測指標之間的差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般狀況

建模期間，空白組大鼠表現(xiàn)正常，反應(yīng)靈活，行動敏捷；其余5組以滴鼻法給予LPS后，食欲下降，被毛豎立，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，蜷縮抱團。用藥4 d后，各給藥組大鼠與LPS模型組大鼠相比，食欲增加，活動量增多，精神狀態(tài)均比模型組大鼠好。

2.2 肺臟組織的濕/干重比

由圖1可知，與空白組相比，LPS模型組大鼠肺臟組織的濕/干重比極顯著增加（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉組和左氧氟沙星組大鼠肺臟濕/干重比均不同程度降低（P<0.01），有劑量依賴性的趨勢，其中穿王消炎粉中劑量組肺臟組織濕/干重比與低劑量組存在顯著差異（P<0.05），高劑量組與中劑量組差異極顯著（P<0.01），高劑量組與左氧氟沙星組無顯著差異（P>0.05）。

肩標不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；肩標不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著（P>0.05）。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference （P<0.05）;And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference （P<0.01）;While with the same or no letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）.The same as below圖1 各組大鼠肺臟組織濕/干重比Fig.1 Rat wet/dry weight ratio in lung tissues of different groups

2.3 肺臟組織病理學(xué)變化

由圖2可知，空白組無水腫無炎性細胞浸潤，肺泡間隙清晰。LPS模型組中，觀察到肺泡壁水腫和出血，肺泡間質(zhì)增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤和其他明顯的肺損傷。與LPS模型組相比，穿王消炎粉各劑量組上述變化依次減輕，穿王消炎粉高劑量組肺臟組織間隙中性粒細胞和紅細胞滲出明顯減少，肺泡腔炎性細胞數(shù)量明顯減少。

A,空白組;B,左氧氟沙星陽性藥物對照組;C,LPS模型組;D,穿王消炎粉低劑量組;E,穿王消炎粉中劑量組;F,穿王消炎粉高劑量組A,Blank group;B,Levofloxacin-positive drug group;C,LPS model group;D,Chuanwang Xiaoyan powder low-dose group;E,Chuanwang Xiaoyan powder medium-dose group;F,Chuanwang Xiaoyan powder high-dose group圖2 各組大鼠肺臟組織切片（HE染色）病理學(xué)變化（400×）Fig.2 Pathological changes of lung tissue sections （HE staining） in different groups （400×）

2.4 血清中IL-1β、IL-6的含量

由圖3可知，與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉中和高劑量組的IL-1β、IL-6含量均極顯著降低（P<0.01），其中高劑量組IL-1β、IL-6含量與空白組無顯著差異（P>0.05）。

圖3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6含量Fig.3 Serum IL-1β and IL-6 contents of rats in different groups

2.5 肺臟組織中IL-1β和IL-6 mRNA表達量

由圖4可知，與空白組相比，LPS模型組大鼠肺臟組織中炎性因子IL-1β和IL-6 mRNA表達量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉和左氧氟沙星處理均可極顯著降低IL-1β和IL-6的mRNA表達量（P<0.01），其中穿王消炎粉高劑量組IL-1β和IL-6 mRNA表達量均與左氧氟沙星組均差異不顯著（P>0.05）。

圖4 各組大鼠肺臟組織中IL-1β、IL-6 mRNA表達量Fig.4 The mRNA expression levels of IL-1β and IL-6 in lung tissues of rats in different groups

2.6 肺臟組織中IL-1β和IL-6蛋白表達量

由圖5可知，與空白組相比，LPS模型組IL-1β和IL-6蛋白表達量均極顯著升高（P<0.01）。與LPS模型組相比，穿王消炎粉各組IL-1β和IL-6蛋白表達量隨穿王消炎粉劑量增加呈降低趨勢，高劑量組IL-1β和IL-6蛋白表達量和左氧氟沙星組均無顯著差異（P>0.05）。

A,Western blotting條帶圖;B、C，分別為IL-1β和IL-6蛋白表達量A,Western blotting strip chart；B and C,Protein expression levels of IL-1β and IL-6,respectively圖5 各組大鼠肺臟組織中IL-1β、IL-6蛋白表達量Fig.5 Protein expression levels of IL-1β and IL-6 in lung tissues of rats in different groups

3 討 論

LPS建立ALI模型是目前最常見的呼吸系統(tǒng)疾病模型，通常用LPS誘導(dǎo)建立，給藥途徑有腹腔注射法、尾部靜脈注射法、氣管內(nèi)給藥法、滴鼻吸入法[14-16]。腹腔注射法和尾部靜脈注射法均易引起全身炎癥反應(yīng)，劑量過大時還易導(dǎo)致試驗動物死亡；氣管內(nèi)給藥法對操作要求較高，切口處極易被微生物感染而出現(xiàn)炎癥，影響試驗結(jié)果；而滴鼻吸入法操作簡便，且誘導(dǎo)急性肺部炎癥較明顯[14]。肖亞強等[17]通過滴鼻吸入法建立了大鼠ALI模型，模型大鼠表現(xiàn)為肺臟組織結(jié)構(gòu)受損、水腫、肺泡及間質(zhì)有炎性細胞浸潤。水腫和出血是肺部炎性損傷的主要特征[18]。本研究通過滴鼻吸入LPS構(gòu)建大鼠肺損傷模型，與空白組相比，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，肺組織濕/干重比升高，病理組織切片觀察到肺泡壁出血、水腫，間質(zhì)增厚，表明模型構(gòu)建成功。

研究表明，炎性因子含量急劇升高是急性炎癥的共同表現(xiàn)[19-20]。LPS通過改變炎癥相關(guān)蛋白的表達水平來誘導(dǎo)急性炎癥[21-22]，在此過程中大量的炎性細胞被激活，產(chǎn)生炎癥因子，最終造成肺損傷。研究顯示，IL-1β和IL-6的分泌水平大幅上升會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，引起器官組織細胞損傷，對動物機體會產(chǎn)生傷害[23]。IL-1β作為炎癥反應(yīng)的早期物質(zhì)，在炎癥形成過程中起到了積極作用，可以促進其他促炎因子釋放，維持炎癥誘導(dǎo)反應(yīng)，是IL-6表達的主要激活劑。IL-6主要由活化的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，其表達水平的高低可以指征炎癥的輕重，可作為內(nèi)毒素所致肺損傷模型中急性炎癥的標志[24]，其作為促炎細胞因子，在宿主防御中起重要作用[25]。本試驗結(jié)果表明，模型組大鼠的肺臟組織中肺泡間質(zhì)增厚，出現(xiàn)積液，這可能是炎癥因子大量釋放所導(dǎo)致。穿心蓮的主要成分是穿心蓮內(nèi)酯[26]，李學(xué)勤等[27]發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可以減少促炎因子IL-1β、IL-6分泌，進而減輕肺部損傷程度，對肺臟組織具有保護作用；張婕斐等[28]和柯雪紅等[29]研究發(fā)現(xiàn)了哥王對急性炎癥具有良好治療效果；楊振宇等[30]發(fā)現(xiàn)了哥王水提物無毒性，同時對細菌也具有抑制作用。本試驗用穿王消炎粉對ALI大鼠進行治療，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺臟的炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達水平和蛋白表達量均顯著高于空白組，穿王消炎粉處理組中以高劑量組（4 g/kg體重）IL-1β和IL-6水平降低最顯著，說明穿王消炎粉可以通過降低IL-1β和IL-6的分泌水平對ALI起到治療作用。

綜上所述，穿王消炎粉（4 g/kg體重）可以明顯改善LPS誘導(dǎo)的ALI和炎癥程度，效果與陽性藥左氧氟沙星相似。目前穿王消炎粉緩解肺損傷的機制尚不明確，后續(xù)將對其作進一步研究。

4 結(jié) 論

穿王消炎粉（4 g/kg體重）可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺部損傷和炎癥程度，減少炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌，對ALI有治療作用。