犬貓皮膚病細菌性病原分離鑒定及天然產(chǎn)物抑菌效果分析

趙天睿，邵錦華,王朝好，嚴 蕊，雷鎰妃，劉曉雅，胡長敏

（1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.廣州海關隸屬廣州會展中心海關，廣州 510335）

犬貓皮膚病是臨床上常見疾病之一，具有發(fā)病率高且易復發(fā)的特點。犬貓皮膚病會導致一系列癥狀，如原發(fā)性感染引發(fā)的表皮紅腫、瘙癢、皰疹和繼發(fā)性感染引發(fā)的膿腫。同時，皮膚病易導致動物抓撓等異常行為[1]，導致動物福利受損。細菌性皮膚病是由細菌性病原感染引起的皮膚病理變化，為皮膚病中最重要的一種。常見的細菌性皮膚病病原有金黃色葡萄球菌、貓葡萄球菌、中間型葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、鏈球菌、奇異變形桿菌、化膿性棒狀桿菌及假單胞菌等[2]。據(jù)報道，人畜共患病原中，有30～40種病原來自犬貓[3]。由于許多犬貓皮膚病病原具有人畜共患的特性，易造成病原在動物與人之間的傳播并引發(fā)公共衛(wèi)生問題。

犬貓細菌性皮膚病的臨床診斷可通過病史、癥狀進行初步判定，隨后開展皮膚抹片鏡檢、細菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗等實驗室檢查[4-5]。目前,臨床上常見的皮膚病治療用藥一般為抗生素，而抗生素的濫用也導致了耐藥性等一系列問題[6]。因此，許多研究者開始關注植物類產(chǎn)物[7]，并從中篩選到多種具有活性的化學物質(zhì)。這些天然活性產(chǎn)物具有低毒、安全、環(huán)境友好的特點，其中多種天然活性產(chǎn)物兼具抑菌作用，既可作為傳統(tǒng)抗菌藥物的替代物[8]，也可與抗生素聯(lián)用以降低耐藥菌的抗藥性，如白花丹中提取的白花丹素可抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantStaphylococcusaureus,MRSA）的增殖[9]，血根堿可抑制大腸桿菌[10]，芫荽中的芳樟醇可與苯唑西林、慶大霉素等聯(lián)用抑制MRSA及銅綠芽孢桿菌的活性[11]。除此以外，部分天然活性產(chǎn)物還具有免疫調(diào)節(jié)機能[12]，顯著促進患有細菌性皮膚病犬貓的康復。

研究顯示，藤黃酸（gambogic acid,GA）具有抑制腫瘤細胞增殖[13]及神經(jīng)保護[14]等作用，6-溴靛玉紅-3’-肟（6-bromoindirubin-3’-oxime,BIO）有抑癌[15]、延緩心肌細胞衰老[16]等功效。本實驗室前期研究證實了BIO及GA有較好的抑制炎癥的功效[17-18]。本研究擬對武漢市患皮膚病的犬貓開展細菌性病原分離鑒定，并探索其對傳統(tǒng)抗菌藥物與天然活性產(chǎn)物GA及BIO的敏感性，以期為臨床上犬貓皮膚病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及菌株 病例來自武漢市部分犬舍、貓舍及某動物醫(yī)院的患皮膚病犬貓。5周齡體重20 g左右的雌性SPF級昆明小鼠購自華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌 ATCC 25923與ATCC 29213及大腸桿菌 ATCC 25922均購自溫州市康泰生物科技有限公司康泰菌株保藏中心。

1.1.2 主要試劑 GA標準品、BIO標準品及頭孢西丁標準品均購自上海源葉生物科技有限公司；培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自南京建成科技有限公司；TaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 Plus DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自Thermo Fisher Scientific公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌生化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 藥物配制與保存 將GA及BIO標準品溶于DMSO分別配制成1 000和2 000 mg/L溶液并于4 ℃避光保存，試驗前將其分別稀釋25倍，以保證DMSO終濃度<1%。頭孢西丁標準品用水配制成1 000 mg/L的溶液。藥物濃度見表1。

表1 藥物濃度Table 1 Drug concentration mg/L

1.2 方法

1.2.1 采樣 無菌生理鹽水清潔病變處，用一次性無菌棉拭子進行采樣并將棉拭子頭保存于2 mL EP管中。

1.2.2 樣品處理 將棉拭子于TSA平板一區(qū)進行劃線，再用接種環(huán)進行余下三區(qū)劃線。37 ℃倒置培養(yǎng)12～24 h，觀察分辨平板上的絕對優(yōu)勢菌落并挑取單菌落，接種于 TSB 培養(yǎng)基。

1.2.3 菌種保藏 取800 μL甘油及等體積菌液存于2 mL EP管中，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 生長特性觀察 將菌種按1%濃度接種于TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～20 h；復蘇后挑取一環(huán)菌液，于TSA 平板上四區(qū)劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)16～20 h后，觀察菌落形態(tài)。

1.2.4.2 革蘭氏染色鏡檢及生化鑒定 制作細菌抹片，利用革蘭氏染色試劑盒進行染色并鏡檢。生化鑒定：將菌液接種至細菌生化鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.2.4.3 分子生物學鑒定 以煮沸法提取各菌株DNA，以提取的基因組 DNA 為模板，用細菌16S rRNA通用引物（27F/1492R）進行PCR，擴增目的片段，用葡萄球菌屬特異性引物（Staph 756F/Staph 750R）[19]、變形桿菌屬特異性引物（TUF F/TUF R）[20]、鏈球菌特異性引物（EF-TU F/EF-TU R）[21]分別擴增疑似菌株。16S rRNA PCR反應體系25 μL：上、下游引物各 1 μL，2×TaqMaster Mix 12 μL，DNA模板 2 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL。16S rRNA PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。葡萄球菌[22]、變形桿菌[23]、鏈球菌[24]的PCR反應條件按照文獻方法進行。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳驗證。擴增后出現(xiàn)與目的條帶大小相近的條帶，則判為PCR擴增陽性并送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，測序結果在 BLAST進行相似性比對，以確定分離菌株種屬。

1.2.5 皮膚感染模型復制 為驗證分離菌株的致病性，對其進行皮膚感染模型復制試驗。選取體重20 g以上的SPF 昆明小鼠20只，每組2只,共計10組，將1～9組設為試驗組,10組設為對照組。在其背部皮膚選取一處進行剃毛，并將皮膚用刮刀刮至皮下出血且皮膚無破損，用棉拭子蘸取菌液涂抹于試驗組小鼠受試部位，對照組涂布TSB培養(yǎng)基，連續(xù)3 d。每組小鼠分籠飼養(yǎng)于SPF動物房，3 d后觀察受試部位病變情況，并對病變位置重新進行取樣、分離及鑒定。

1.2.6 臨床分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥的耐藥性測定 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）給出的參考，選擇能在該標準中查詢到具體抑菌圈數(shù)據(jù)的對應藥物，采用K-B紙片法進行分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性測定。選擇大腸桿菌ATCC 25922及金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為質(zhì)控菌株。

1.2.7 天然活性產(chǎn)物的MIC試驗 通過肉湯稀釋法測定天然活性產(chǎn)物GA及BIO對各臨床菌株的最小抑菌濃度（MIC）值，并設置大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 29213為質(zhì)控菌株，頭孢西丁為質(zhì)控藥物。

2 結 果

2.1 病原菌分離鑒定結果

2.1.1 生長特性 采樣后對樣品進行分離純化，最終獲得9株細菌。將臨床分離的9株菌依次編號為F1、F2、C3、C4、F5、C6、C7、C8和F9,分別接種至TSA平板，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)16～20 h后，F(xiàn)2、C4、F5（圖1A）和F9（圖1B）形成表面光滑、濕潤、直徑為1～2 mm的黃白色圓形菌落；C6、C7、C8（圖1C）成表面光滑、濕潤、直徑1 mm左右的白色圓形菌落；C3出現(xiàn)表面粗糙、邊緣不平滑、直徑1 mm左右的白色圓形菌落（圖1D）；F1形成表面光滑、濕潤、直徑0.5～1 mm的灰白色圓形菌落（圖1E）。

A，F(xiàn)5;B，F(xiàn)9;C，C8;D，C3;E，F(xiàn)1圖1 犬貓皮膚病病原在TSA平板上的生長特性Fig.1 Growth characteristics of skin pathogenic bacteria from dogs and cats on TSA plates

2.1.2 革蘭氏染色結果 在鏡下，F(xiàn)2、F4、F5、C6、C7、C8、F9呈藍紫色，為革蘭氏陽性，球形或稍呈橢圓形，直徑1.0 μm左右，排列成葡萄狀（圖2A～2C）；C3呈紅色，為革蘭氏陰性，長約1.0～3.0 μm，兩端鈍圓（圖2D）；F1呈革蘭氏陽性，球形或卵圓形，直徑0.6～1.0 μm，大多為鏈狀排列（圖2E）。

A，F(xiàn)5;B，F(xiàn)9;C，C8;D，C3;E，F(xiàn)1圖2 革蘭氏染色結果（1 000×）Fig.2 Gram staining results （1 000×）

2.1.3 生化鑒定 由表2可知，F(xiàn)2、F9、C4、F5、C6、C7、C8對乳糖、甘露糖等均呈現(xiàn)陽性，C4和F5 V-P實驗、硝酸鹽還原實驗呈陽性，其他5株V-P實驗、硝酸鹽還原實驗為陰性。

表2 F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification results of F2,C4,F5,C6,C7,C8 and F9

另外，F(xiàn)1對PYR、精氨酸、MAG、TMZ、蕈糖、蔗糖表現(xiàn)為陽性，對V-P、GPP、七葉苷、山梨醇表現(xiàn)為陰性。C3對V-P、苯丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、枸櫞酸鹽、尿素、硫化氫、磷酸酶、β-半乳糖苷、棉籽糖、戊糖、山梨醇、二磷酸酶表現(xiàn)為陽性，對靛基質(zhì)、側(cè)金盞花醇表現(xiàn)為陰性。

2.1.4 PCR檢測16S rRNA及屬特異性基因的結果 提取分離得到的9株細菌的DNA，用細菌通用引物（27F/1492R）擴增細菌的16S rRNA基因序列，由圖3可知，9株菌均擴增出了1 500 bp左右的條帶，陰性對照無條帶。

M,DL2000 Plus DNA Marker；N,ddH2O；1～9,依次為F1、F2、C3、C4、F5、C6、C7、C8和F9M,DL2000 Plus DNA Marker;N,ddH2O;1-9,F1,F2,C3,C4,F5,C6,C7,C8 and F9,respectively圖3 病原菌16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of 16S rRNA PCR products of pathogenic bacteria

葡萄球菌屬特異性引物擴增后，F(xiàn)2、C4、F5、C6、C7、C8、F9均出現(xiàn)756 bp條帶，說明該7株菌均為葡萄球菌（圖4A）；變形桿菌屬特異性引物擴增后，C3出現(xiàn)541 bp 條帶（圖4B）；鏈球菌屬特異性引物擴增后，F(xiàn)1出現(xiàn) 197 bp 條帶（圖4C）。對擴增結果進行測序及BLAST比對，確定F2、F9為貓葡萄球菌，C4、F5為金黃色葡萄球菌，C6、C7、C8為偽中間型葡萄球菌，C3為奇異變形桿菌，F(xiàn)1為犬鏈球菌。

①A,葡萄球菌；B,變形桿菌；C,鏈球菌。②M，DL2000 Plus DNA Marker；N，ddH2O；1～9，分別為F2、C4、F5、C6、C7、C8、F9、C3和F1①A,Staphylococcus;B，Proteus;C，Streptococcus.②M,DL2000 Plus DNA Marker；N,ddH2O；1-9,F2,C4,F5,C6,C7,C8,F9,C3 and F1,respectively圖4 菌屬特異性引物擴增病原菌對應基因片段的PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.4 Electrophoresis results of PCR products of corresponding gene fragment amplified by specific bacterial primers

2.2 臨床分離菌株皮膚感染模型復制結果

在連續(xù)對試驗組SPF小鼠受試部位涂抹菌液3 d、對照組SPF小鼠涂抹TSB培養(yǎng)基3 d后觀察，試驗組小鼠受試部位出現(xiàn)病變，對照組未見病變，說明各臨床菌株均具有致病性。涂抹偽中間型葡萄球菌小鼠，其受試部位出現(xiàn)3 mm×7 mm的病變，并形成較厚、表面粗糙的黑紅色血痂（圖5A）；涂抹犬鏈球菌菌液的小鼠于受試部位形成一處略凹陷、表面粗糙的暗紅色病變（圖5B）；涂抹貓葡萄球菌菌液的小鼠于受試部位出現(xiàn)6 mm×3 mm的病變，并形成紅褐色痂皮（圖5C）；涂抹金黃色葡萄球菌菌液的小鼠于受試部位出現(xiàn)明顯的起皮、掉屑，并在病灶中心形成淡黃色痂皮（圖5D）；涂抹奇異變形桿菌菌液的小鼠于受試部位出現(xiàn)一處較小的表面較厚的血痂（圖5E）；對照組小鼠在3 d后背部經(jīng)刮刀刮出的滲血在逐漸消退，于皮下留下淡紅色痕跡（圖5F）。

A，偽中間型葡萄球菌;B，犬鏈球菌;C，貓葡萄球菌;D，金黃色葡萄球菌;E，奇異變形桿菌;F，對照組A，Staphylococcus pseudintermedius;B， Streptococcus canis;C，Staphylococcus felinae;D，Staphylococcus aureus;E，Proteus mirabilis;F，Control group圖5 小鼠受試部位病變情況Fig.5 Pathological changes in the tested parts of mice

2.3 分離菌株耐藥性結果

2.3.1 分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物的耐藥性 根據(jù)臨床菌株的類別，開展分離菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物的耐藥性測定，即葡萄球菌組、犬鏈球菌組及奇異變形桿菌組對抗生素的耐藥情況。由表3可知，貓葡萄球菌F2、偽中間型葡萄球菌C6對復方新諾明、青霉素、苯唑西林等10種抗菌藥均敏感，金黃色葡萄球菌C4對青霉素耐藥，金黃色葡萄球菌F5對復方新諾明、青霉素、氯霉素、紅霉素耐藥，偽中間型葡萄球菌C7對復方新諾明、青霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素耐藥，貓葡萄球菌F9、偽中間型葡萄球菌C8對復方新諾明、青霉素、苯唑西林、氯霉素、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星耐藥。由表4可知，犬鏈球菌F1對萬古霉素、利福平等8種抗菌藥均敏感。由表5可知，奇異變形桿菌C3對呋喃妥因、氨芐西林等6種抗菌藥均敏感。

表3 7株葡萄球菌對10種抗菌藥的耐藥情況Table 3 Resistance of 7 strains of Staphylococcus to 10 traditional antibiotics

表4 1株犬鏈球菌對8種抗菌藥的耐藥情況Table 4 Resistance of 1 strain of Streptococcus to 8 traditional antibiotics

表5 1株奇異變形桿菌對6種抗生素的耐藥情況Table 5 Resistance of 1 strain of Proteus to 6 traditional antibiotics

2.3.2 天然產(chǎn)物GA及BIO的MIC結果 天然活性產(chǎn)物GA和BIO對臨床分離菌株的MIC結果顯示，GA及BIO對各臨床分離菌株均具有較強的抑菌活性，其中GA對臨床分離株的MIC在0.625～2.5 mg/L,BIO的MIC在2.5～5 mg/L（表6）。且在本試驗中，除金黃色葡萄球菌F5外，GA的MIC值均小于BIO。

表6 2種天然活性產(chǎn)物對各菌株的MICTable 6 MIC of 2 natural active products to each strain mg/L

3 討 論

細菌性皮膚病是由細菌性病原感染引起的皮膚病理變化，是最常見的一種犬貓皮膚病。免疫缺陷、內(nèi)分泌功能障礙、皮膚創(chuàng)傷、真菌感染、特應性皮炎等病因?qū)е缕つw菌群生態(tài)平衡失調(diào)[25]、皮膚抑制細菌滋生能力下降，進而引發(fā)細菌性感染。細菌性皮膚病不僅導致患病動物皮膚局部病變，嚴重時可能誘發(fā)全身感染?？股厥桥R床上治療細菌性皮膚病的常見手段，但存在療效不確定、個體差異大、容易復發(fā)等問題[26]，且抗生素濫用導致的細菌耐藥性問題也愈發(fā)嚴峻，影響了其治療效果。從植物中提取的天然產(chǎn)物低毒且安全，其中有許多天然產(chǎn)物有一定的抑菌活性，具有作為替代抗生素成為犬貓皮膚病治療藥物的潛力，如植物提取物W16P57被證實對耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌有抑制作用[27]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，GA可抑制促炎因子白介素-1β（IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α） mRNA表達量及TLR4-NF-κB/MAPKs信號通路來抑制乳腺炎[18]，靛玉紅也可下調(diào)上述炎性因子來達到抑炎效果[17]。

本研究首先對臨床病樣進行收集，并進行病原菌的分離與鑒定，共分離到9株細菌。在所分離病原中，葡萄球菌是犬貓最常見的皮膚病致病菌；犬鏈球菌是一種感染多種動物的致病菌，Pesavento等[28]報道證實了其單獨感染也可導致貓皮膚病；亦有研究表明奇異變形桿菌對皮膚有致病性[29-30]。本研究使用SPF小鼠對臨床分離株進行了皮膚病模型復制，為防止小鼠間撕咬、打斗、交配等行為影響試驗結果，本試驗中選擇的均為雌性小鼠。最終成功復制了皮膚病模型，不僅說明犬貓源菌株在小鼠進行皮膚感染模型復制的可行性[31]，并且驗證了臨床分離株對皮膚的致病性。

本研究分離得到菌株對傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性表現(xiàn)較大差異，其中1株犬鏈球菌及1株奇異變形桿菌在對傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥性的試驗中表現(xiàn)為對受試藥物全敏感；葡萄球菌中2株對受試藥物全敏感（貓葡萄球菌F2、偽中間型葡萄球菌C6），1株對1種藥物耐藥（金黃色葡萄球菌C4），1株對4種藥物耐藥（金黃色葡萄球菌F5），1株對5種藥物耐藥（偽中間型葡萄球菌C7），2株對8種藥物耐藥（貓葡萄球菌F9、偽中間型葡萄球菌C8）。Be?a等[32]從動物、獸醫(yī)專業(yè)人員和臨床獸醫(yī)環(huán)境中分離到12株偽中間葡萄球菌，其中有4例為耐甲氧西林偽中間葡萄球菌。同時，對獸醫(yī)專業(yè)人員手部進行采樣，約有20%的樣本可分離得到耐甲氧西林偽中間葡萄球菌,該研究表明葡萄球菌的耐藥問題已較為突出。多重耐藥菌株更對臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)[33]。在本研究中，葡萄球菌對傳統(tǒng)抗菌藥的耐藥性也明顯高于鏈球菌和變形桿菌。張文皓[34]報道的耐藥性分析結果表明，葡萄球菌對氨基糖苷類（慶大霉素）及氟喹諾酮類（左氧氟沙星）敏感性較高，與本研究部分結果相符。

本研究進一步對天然活性產(chǎn)物GA及BIO的抑菌效果開展了評價，GA及BIO對犬貓皮膚病源菌株均有較好的抑菌效果。有研究表明GA對MRSA有抑菌效果[35]。王丹等[36]在關于GA的牛津杯試驗中，觀察到其濃度在20和2 mg/mL時均對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌圈，對大腸桿菌均無抑菌圈。本研究中GA對于金黃色葡萄球菌的效果與王丹等[36]的試驗結果相符。本研究中也檢測到了GA對大腸桿菌ATCC 25922的抑菌作用，且GA對于該大腸桿菌菌株的MIC值大于所有受試葡萄球菌菌株，其差異原因可能為藥敏試驗方法的區(qū)別；其次，在本研究中應用的大腸桿菌為非臨床菌株。

Czelen等[37]研究發(fā)現(xiàn),靛玉紅可通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶和 DNA 聚合酶來影響細菌生長。林健等[38]驗證了靛玉紅對MRSA的抑菌活性。在本研究中，選取了靛玉紅的衍生物BIO進行試驗，發(fā)現(xiàn)其對受試菌株均有抑菌活性;同時除金黃色葡萄球菌F5外，GA的MIC值均小于BIO，說明GA對于本次分離得到的菌株抑菌效果更強。

4 結 論

本研究從武漢市部分皮膚病患病犬貓分離得到共計5種、9株臨床菌株，并通過小鼠皮膚感染模型驗證了其對皮膚的致病性。上述部分臨床分離株對傳統(tǒng)抗菌藥產(chǎn)生不同程度的耐藥性，而GA和BIO對犬貓皮膚病源分離菌株均有明顯抑菌活性，顯示其可作為潛在高效防控犬貓細菌性皮膚病的藥物，為臨床上犬貓細菌性皮膚病的治療提供新思路。