基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用機制

王鉞夫，徐 闖，崔一喆

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

奶牛子宮內(nèi)膜炎（cow endometritis）是指以奶牛產(chǎn)后21～26 d奶牛子宮頸>7.5 cm或陰道內(nèi)仍流出膿性液體甚至血液為主要特征的子宮黏膜炎癥[1]。因子宮內(nèi)膜炎導(dǎo)致不孕而淘汰的奶牛在所有奶牛淘汰原因中占比達1/3。子宮內(nèi)膜炎在繁殖障礙性疾病中占比最大，危害最高。在現(xiàn)代臨床獸醫(yī)學(xué)上，奶牛子宮內(nèi)膜炎主要由病原微生物感染導(dǎo)致[2]，在所有的患病奶牛中，以細菌侵入最為常見。致病菌主要為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、變形桿菌及枯草芽孢桿菌等[3]。不同地區(qū)從患病奶牛體內(nèi)分離出的致病菌和所占比率也不相同，但主要有大腸埃希菌、葡萄球菌、鏈球菌[4]。奶牛自身免疫機能下降及飼養(yǎng)環(huán)境污染都會造成致病菌大量繁殖，增加奶牛的發(fā)病幾率。

目前，主要依靠抗生素治療奶牛子宮內(nèi)膜炎，且對發(fā)病奶牛有良好的治療作用，但抗生素使用時間過長會導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性，使用過于頻繁會在奶牛體內(nèi)造成殘留，危害人體健康。近年來，中獸藥治療得到了廣泛的重視，由于中藥成分均來源于草本植物，避免了因抗生素頻繁使用造成的耐藥性增加及藥物殘留造成的危害，同時減少了治療費用，成為了家畜疾病治療研究的熱點。

中獸醫(yī)理論認為，奶牛子宮內(nèi)膜炎屬濕熱帶下性病征，濕邪侵入胞宮,致氣血凝滯而發(fā)病[5]。在治療時應(yīng)以祛瘀、活血、解毒類藥物為主[6]。丹參為寒涼性藥物，具有祛瘀活血、通經(jīng)止痛等功效，屬于活血化瘀類藥物，含有丹參酮Ⅰ、ⅡB、ⅡA和隱丹參酮等大量有效活性成分[7-9]，具有良好的抗菌消炎和抗癌功能，對微管的形成也有一定的抑制作用。益母草與丹參聯(lián)用可增強活血化瘀作用[10]，促進子宮收縮，獸醫(yī)臨床上常用于促進產(chǎn)后惡露排出，對于產(chǎn)后引發(fā)的子宮炎癥也有一定的效果。李健等[11]報道以丹參為主的中藥復(fù)方制劑對奶牛子宮內(nèi)膜炎有良好的治療作用。黃芩、連翹為常見的清熱解毒類藥物，其中藥復(fù)方——雙黃連常用于治療多種疾病引起的炎癥[12]。本研究根據(jù)中藥配伍原則，將丹參、益母草、連翹及黃芩組成中藥復(fù)方，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析該中藥復(fù)方與奶牛子宮內(nèi)膜炎之間的成分-靶點-通路是否存在關(guān)聯(lián)，探究該中藥復(fù)方是否對奶牛子宮內(nèi)膜炎具有治療作用，以期為奶牛子宮內(nèi)膜炎網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的藥物靶點預(yù)測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分靶點的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）對丹參、益母草、黃芩、連翹的活性成分靶點進行檢索，藥劑最終通過機體吸收入血，將口服利用度（OB）及類藥相似度（DL）作為主要篩選條件，以O(shè)B值≥30%、DL>0.18為藥物活性成分靶點的最低標(biāo)準(zhǔn)進行篩選[13]。

1.2 藥物靶點蛋白與geneSymbol的轉(zhuǎn)化

從Uniprot（https:∥www.uniprot.org/）網(wǎng)站上通過UniprotKB（蛋白數(shù)據(jù)庫），以Bostaurus（普通牛）為物種檢索已被Swiss-prot驗證的蛋白數(shù)據(jù)，將藥物的靶點蛋白與已驗證的相關(guān)蛋白一一對應(yīng)，并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的geneSymbol，將轉(zhuǎn)換后靶點上傳至Cytoscape 3.8.2軟件繪制藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 奶牛子宮內(nèi)膜炎靶點的篩選

通過NCBI的gene選項及GeneCard（https:∥www.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https:∥omim.org）、TTD（http:∥db.idrblab.net/ttd）、DrugBank（https:∥www.drugbank.com/）等網(wǎng)站將Bostaurus與endometritis（子宮內(nèi)膜炎）作為檢索項，獲得與奶牛子宮內(nèi)膜炎相關(guān)的基因靶點。

1.4 中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將奶牛子宮內(nèi)膜炎相關(guān)的疾病基因靶點與藥物靶點蛋白進行交互，獲得兩者的交集靶點。將所得的交集靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫（https:∥www.string-db.org/），建立預(yù)測中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并通過Cystoscape 3.8.2軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行整理篩選，通過Degree篩出核心靶點。

1.5 核心靶點網(wǎng)絡(luò)富集分析

將預(yù)測藥物-疾病靶點中的核心靶點上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫（https:∥metascape.org）進行GO功能與KEGG通路富集分析，將得到GO功能與KEGG通路分析的主要通路上傳至Cytoscape 3.8.2軟件，制得靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并通過R語言根據(jù)P值制作主要靶點通路的氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 藥物活性成分靶點的篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩出133個藥物活性成分，其中丹參活性成分65個，以丹參酮（tanshinone）、紫草酸B（lithospermic acid B）、紫丹參萜醚（przewalskinb）等為主要成分（表1）；益母草活性成分9個，以槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、花生四烯酸（arachidonic acid）為主（表2）；連翹活性成分23個，以松脂酚（pinoresinol）、毛果蕓香堿（（+）-pilocarpine）、連翹脂素（（-）-phillygenin）、連翹苷（phillyrin）為主，同時與益母草共有槲皮素與山奈酚（表3）；黃芩活性成分36個，以黃芩苷（baicalin）、黃芩素（baicalein）、漢黃芩素（wogonin）等黃酮類物質(zhì)為主（表4），活性成分漢黃芩素、β-谷甾醇與連翹主要活性成分有交叉。

表1 丹參主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Salvia miltiorrhiza

續(xù)表

表2 益母草主要活性成分Table 2 Main active ingredients of Leonurus heterophyllus

表3 連翹主要活性成分Table 3 Main active ingredients of Forsythia suspensa

表4 黃芩主要活性成分Table 4 Main active ingredients of Scutellaria baicalensis Georgi

2.2 藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

將所有藥物活性成分于與Uniprot蛋白庫進行比對，得到292個基因靶點，通過Cytoscape 3.8.2軟件繪制成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），其中，藥物成分山奈酚、漢黃芩素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、金合歡素、花生四烯酸、紫丹參素B、紫丹參素E、二氫丹參酮Ⅰ、紫丹參萜醚的連接度（Degree）值均>30（表5），為該中藥復(fù)方中的核心作用靶點化合物，所有基因靶點中前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、腎上腺素能受體（ADRA1A）、熱休克蛋白90-1（HSP90-1）、PTGS1、鈉離子通道α亞單位（SCN5A）、β2腎上腺素能受體（ADRB2）和核受體輔激活因子6（NCOA6）的Degree值均>50（表6），為藥物活性成分的主要作用靶點。

圖1 藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Drug composition-target network diagram

表5 Degree>30的藥物活性成分Table 5 Active ingredients with degree greater than 30

表6 Degree>50的基因靶點Table 6 Gene targets with degree greater than 50

2.3 中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎靶點蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在NCBI、GeneCard、geneMap、TTD、DrugBank等網(wǎng)站獲得奶牛子宮內(nèi)膜炎相關(guān)基因靶點130個，與292個藥物活性成分的基因靶點進行交互，并繪制Venn圖，得到25個交集靶點（圖2）。 通過Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物-疾病靶點交互網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），得到25個預(yù)測藥物作用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的交集靶點，將交集靶點上傳至STRING網(wǎng)站，獲得藥物-疾病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），從圖中可知PPI網(wǎng)絡(luò)中包含24個節(jié)點，172條相互作用線，平均節(jié)點度為14.3，局部聚類系數(shù)為0.812。

圖2 藥物活性成分靶點與疾病靶點Venn圖Fig.2 Venn diagram of drug component targets and disease targets

圖3 藥物-疾病靶點交互網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Drug-disease target interaction network diagram

圖4 預(yù)測藥物-疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network for predicting drug-disease targets

2.4 核心靶點的篩選

通過Cytoscape將PPI網(wǎng)絡(luò)得到的結(jié)果根據(jù)Degree值大小對PPI網(wǎng)絡(luò)中的預(yù)測藥物作用于疾病的基因靶點進行篩選，Degree值越大靶點圖標(biāo)越大，顏色越深。由圖5可知，腫瘤壞死因子（TNF）、蛋白激酶（AKT1）、PTGS2、CSC1樣蛋白（CXCL8）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、白細胞介素1β（IL1β）和IL6 7個靶點的圖標(biāo)相對較大，顏色較深，可能為藥物治療奶牛子宮內(nèi)膜炎作用的核心靶點。

2.5 靶點網(wǎng)絡(luò)KEGG通路與GO功能富集分析

2.5.1 GO功能富集分析 將圖5中的24個靶點上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析，得到32個差異顯著條目（P<0.01）,其中生物過程（biological processes，BP）20條，細胞組分（cellular components，CC）6個，分子功能（molecular functions，MF）6個（圖6）。根據(jù)富集分?jǐn)?shù)（enrichment score）大小對差異條目進行排列，富集分?jǐn)?shù)越大，富集條目越顯著。生物過程分析主要包括脂多糖的反應(yīng)、白細胞-細胞黏附的正向調(diào)節(jié)、對無機物的反應(yīng)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng)、對IL-1的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對瘤壞死因子、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)控、白細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附的正向調(diào)節(jié)、僵化、腺體發(fā)育細胞因子介導(dǎo)的信號通路、組織重塑、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、消化系統(tǒng)發(fā)育、上皮細胞遷移的調(diào)節(jié)、對病毒的反應(yīng)、核質(zhì)轉(zhuǎn)運的正向調(diào)節(jié)及干細胞分化的調(diào)控等；細胞組分分析顯示靶點主要作用于細胞膜筏、薄膜側(cè)面、顆粒分泌腔、細胞質(zhì)核周區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膠原細胞外基質(zhì)；分子功能分析得出，靶點功能主要涉及信號受體活性調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄輔激活子的結(jié)合、血紅素結(jié)合、整合素結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活性調(diào)節(jié)。

圖5 根據(jù)Degree值構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network diagram based on degree value

圖6 核心靶點GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis of core target

2.5.2 KEGG通路富集分析 將核心靶點上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，得到9條差異顯著條目（P<0.05）,結(jié)果顯示，靶點主要涉及AGE-RAGE信號、癌癥蛋白聚糖通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、麻疹、膀胱癌、Th17細胞分化通路、小細胞肺癌、白細胞跨內(nèi)皮遷移及自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性通路（圖7）。根據(jù)通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖可知，AGE-RAGE信號通路、癌癥蛋白聚糖通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路及Th17細胞分化通路涉及基因數(shù)較多（圖8）。

圖7 核心靶點KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of core target

圖8 KEGG通路富集分析基因通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis gene pathway-target network diagram

3 討 論

奶牛子宮腔平時處于封閉狀態(tài)，一般情況下沒有外界病原微生物侵入，但在奶牛妊娠期間，尤其是分娩前后，子宮頸口開張，并持續(xù)排出惡露，此狀態(tài)一直持續(xù)21 d左右，在此期間奶牛發(fā)生子宮內(nèi)膜炎的風(fēng)險提高，通常為細菌侵襲感染，細菌內(nèi)毒素脂多糖通過與子宮內(nèi)膜上皮Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4,TLR4）結(jié)合，激活NF-κB信號通路，使p65和IκBα的磷酸化水平升高[14]，造成子宮內(nèi)膜炎。感染后細菌毒素及炎性物質(zhì)會影響卵泡發(fā)育和黃體的生成，從而對卵巢功能造成損害，使排卵期延后甚至停止[15]。中藥復(fù)方中的丹參、黃芩等藥物可抑制NF-κB的核移位及調(diào)控該通路的活化，降低p65和IκBα的磷酸化水平，有效頡頏脂多糖誘導(dǎo)的細胞炎癥[16]。 證明該中藥復(fù)方對奶牛子宮內(nèi)膜炎引起的炎癥癥狀具有緩解作用，從而達到治療的作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥復(fù)方藥物成分進行解析，其中槲皮素、山奈酚、黃芩素、丹參酮ⅡA為主要作用成分。槲皮素與山奈酚大量存在于多種中藥中，屬于黃酮類化合物，是起治療作用的主要成分之一，有抗菌、消炎、抗氧化等作用[17-18]。黃芩素為黃芩中的主要活性成分，經(jīng)體外試驗結(jié)果證明，其抑菌效果較為顯著，對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌作用[19]，丹參酮ⅡA大量存在于丹參中，具有抗炎、抗氧化作用，同時還對冠心病、腦血管疾病和心血管疾病具有改善作用[20]，該物質(zhì)可通過Nrf2通路對高血壓疾病進行自發(fā)性的緩解[21]，對炎癥反應(yīng)中造成的局部血壓升高有良好的治療作用。Fu等[22]報道，丹參酮ⅡA抑制環(huán)氧化酶-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的基因表達，降低脂多糖誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的表達。此外，丹參酮ⅡA抑制丙二醛水平，但可提高過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性，通過試驗證明，丹參酮ⅡA通過激活Nrf2信號通路表現(xiàn)出抗炎和抗氧化作用。本研究結(jié)果與以上結(jié)果基本一致，說明該中藥復(fù)方的藥物活性成分具有抗菌消炎等作用，從而達到治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的目的。

這些中藥活性成分主要作用于TNF、AKT1、CXCL8、TP53、IL-1β、IL-6等關(guān)鍵靶點蛋白。奶牛患有子宮內(nèi)膜炎時TNF、IL-1β與IL-6表達水平均顯著升高[23]，IL-1β與IL-6等促炎因子可通過自身影響細胞組織，使炎癥的級聯(lián)反應(yīng)放大，引起巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞在炎癥局部聚集，并釋放炎癥介質(zhì)，加速炎癥作用的發(fā)生[24]，CXCL8可促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在與中性粒細胞接觸后，會使中性粒細胞游走至作用部位，并釋放可引發(fā)局部炎癥反應(yīng)的活性物質(zhì)，同時發(fā)揮殺菌和損傷細胞的作用[25]；AKT1與TP53均參與細胞凋亡與葡萄糖代謝作用，影響細胞的增殖和生長。PTGS2可通過抑制環(huán)氧活酶（COX）活性來減少前列腺素的產(chǎn)生，從而減輕炎癥作用，達到消炎鎮(zhèn)痛的效果[26]。這些靶點蛋白均與炎癥反應(yīng)的發(fā)生有密切聯(lián)系，因此本研究通過富集分析這些靶點蛋白的功能和通路來探討中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用機制。

根據(jù)Metascape數(shù)據(jù)庫對該中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的核心靶點進行KEGG通路富集分析。結(jié)果表明，癌癥蛋白聚糖、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、麻疹、膀胱癌、Th17細胞分化通路、小細胞肺癌、白細胞跨內(nèi)皮遷移及自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性通路是該病的主要作用通路。AGE是在體內(nèi)脂肪和糖類極高的環(huán)境下形成具有一定毒性的大分子化合物，與RAGE結(jié)合形成通路。通常該通路的發(fā)生與糖尿病等代謝機能障礙性疾病相關(guān)，但在該通路的作用下，組織活性氧自由基大量生成，使機體的抗氧化機制受到影響，多種細胞因子的釋放，造成了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且AGE激活NF-κB通路的傳導(dǎo)[27]，使p65與IκBα磷酸化，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生，而丹參的單體成分可通抑制NF-κB通路的激活，減輕炎癥反應(yīng)[28]。大腸埃希菌感染子宮內(nèi)膜后，內(nèi)膜上皮組織分泌IL-1β、IL-6、TNF-α[29]等炎性因子對炎癥起到了促進的作用，而IL-6的分泌與Th17細胞的分化有直接關(guān)系[30]，黃芩苷為該中藥復(fù)方的主要成分之一，吳峰淼等[31]研究結(jié)果表明,黃芩苷改變對Th17與Treg細胞的免疫平衡，使JAK/STAT3的激活受到抑制，以減輕炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

由丹參、益母草、連翹及黃芩組成得中藥復(fù)方治療奶牛子宮內(nèi)膜炎可能是通過槲皮素、山奈酚、黃芩素、丹參酮ⅡA等藥物活性成分，作用于TNF、AKT1、PTGS2、CXCL8、TP53、IL-1β、IL-6等核心靶點，通過AGE-RAGE信號通路及Th17細胞的分化對奶牛子宮內(nèi)膜炎產(chǎn)生治療作用。該中藥復(fù)方藥物的治療作用仍需進一步試驗驗證，本研究結(jié)果為今后的動物試驗及相關(guān)臨床研究提供了依據(jù)和參考。