辣蓼黃酮提取物的急性毒性和亞慢性毒性研究

張 文，覃志彪，成 靜，于美玲，韋英益，黎 江，胡庭俊

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

辣蓼來(lái)源于蓼科蓼屬植物辣蓼及水蓼的全草，廣泛分布于廣西、廣東、四川等地[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼富含有機(jī)酸、黃酮類(lèi)和萜類(lèi)等化學(xué)成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等功效[4-7]。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物能有效增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能，將辣蓼黃酮作為飼料添加劑應(yīng)用于畜牧水產(chǎn)方面對(duì)其疾病防控和健康生態(tài)養(yǎng)殖具有十分重要的意義[8]。大量臨床應(yīng)用表明，辣蓼具有抗癌和抗腫瘤、鎮(zhèn)痛止血等多種生物活性[9-11],且隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)辣蓼除了上述活性之外，還有許多值得進(jìn)一步研究的功效。

為了將辣蓼黃酮提取物作為一種新型飼料添加劑，保證其安全性,本研究采取灌胃給藥的方式進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)，對(duì)辣蓼黃酮提取物的毒性進(jìn)行初步判斷。通過(guò)其試驗(yàn)結(jié)果篩選出不同濃度的辣蓼黃酮提取物添加到飼料中，監(jiān)測(cè)大鼠的臨床體征、飲水量、采食量、體重、血常規(guī)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)及病理組織學(xué)變化以考察辣蓼黃酮提取物是否具有明顯或潛在的毒副作用，評(píng)價(jià)其安全性，旨在為辣蓼黃酮提取物臨床使用劑量及更廣泛的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

辣蓼黃酮提取物由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院制備。辣蓼黃酮的含量為65.37 mg/g，其中蘆丁含量為12.91 mg/g，槲皮苷含量為52.46 mg/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體重為 18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002；4周齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重為（100±20） g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （桂）2019-0003。

1.3 主要儀器

生物組織石蠟包埋機(jī)（YB-6LF）和生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（ZT-12M）均購(gòu)自孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；分析天平（EL204）購(gòu)自Metteler-TOledo公司；全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi-7180）和全自動(dòng)血液分析儀（Sysmex-2100）均購(gòu)自希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司；電熱恒溫干燥箱（DHG-9071A）購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2245）購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.4 急性毒性試驗(yàn)

1.4.1 急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn) 依據(jù)《獸藥急性毒性試驗(yàn)（LD50測(cè)定）指導(dǎo)原則》，將20只SPF級(jí)昆明系小鼠隨機(jī)分為5組，每組4只，雌、雄各半。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)給予辣蓼黃酮5 g/kg BW未見(jiàn)小鼠死亡，故設(shè)5個(gè)劑量組，按照5 g/kg BW的4、2、1、0.5和0.25倍設(shè)計(jì)給藥劑量，則每組小鼠分別給予辣蓼黃銅提取物20、10、5、2.5和1.25 g/kg BW，隔夜空腹灌胃，24 h內(nèi)分2次等容積灌胃給藥，合并為單日一次劑量計(jì)算。試驗(yàn)期間，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)、采食、飲水、健康狀況等，給藥后第8天，剖檢觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢、睪丸、胃和腸等是否存在異常。

1.4.2 最大給藥量試驗(yàn) 根據(jù)急性毒性試驗(yàn)確定最大給藥試驗(yàn)的劑量為30 g/kg BW，灌胃前禁食12 h，每日灌胃3次，每次每只小鼠0.2 g/1.0 mL。試驗(yàn)期間，觀察并記錄小鼠死亡數(shù)、采食、飲水、健康狀況等，給藥后第8天，剖檢觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢/睪丸、胃和腸等是否存在異常。

1.5 亞慢性毒性試驗(yàn)

1.5.1 試驗(yàn)分組及給藥 80只SPF級(jí)SD大鼠，喂養(yǎng)觀察 7 d并稱(chēng)重。利用Excel軟件進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組分組方法分為4組，每組 20 只，雌雄各半，雌雄分籠飼養(yǎng)，共8個(gè)籠。設(shè)高、中、低劑量辣蓼黃酮組（20、10和5 g/kg BW）和對(duì)照組（0 g/kg BW）。大鼠全價(jià)飼料用粉碎機(jī)粉碎，將辣蓼黃酮用藥劑量按大鼠每日飼料攝入量為體重的 10% 折算后，分別按照高、中、低劑量組混入飼料,充分混勻后加適量雙蒸水揉搓擠壓成條狀，55 ℃ 烘箱烘干；對(duì)照組飼料除不添加辣蓼黃酮外，與其他劑量組處理方式相同。連續(xù)給藥 30 d 后停藥，其后每組剩余大鼠喂普通全價(jià)飼料觀察 7 d。

1.5.2 臨床觀察及檢測(cè) 試驗(yàn)期間每天觀察大鼠的一般行為表現(xiàn)、中毒及死亡情況，并記錄大鼠的體重、攝食量和飲水量，每周稱(chēng)量一次體重，血常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目包括白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYMPH）、中間細(xì)胞（MID）、中性粒細(xì)胞（GRA）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）；生化指標(biāo)檢測(cè)包括白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、總蛋白（TP）；采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢、睪丸、胃和腸等臟器稱(chēng)重，計(jì)算臟器系數(shù)，制作切片進(jìn)行病理學(xué)檢查。

臟器系數(shù)=臟器重量/體重

增重率（%）=（終末重-初始重）/初始重×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA方差齊性分析，如方差分析結(jié)果P>0.05則進(jìn)行單因素方差分析，如P<0.05則進(jìn)行Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)觀察期間，未見(jiàn)中毒癥狀且小鼠全部存活，試驗(yàn)期間小鼠采食、排便、日常行為等未見(jiàn)異常。試驗(yàn)第 8天，剖檢觀察小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢/睪丸、胃、腸等均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常情況，無(wú)法測(cè)出辣蓼黃酮提取物的半數(shù)致死量（LD50），說(shuō)明藥物安全性較高。

2.1.2 急性毒性試驗(yàn)最大給藥量試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)期間，小鼠未出現(xiàn)中毒或死亡情況。小鼠采食、飲水、排便及日?；顒?dòng)無(wú)異常情況，被毛、可視黏膜未見(jiàn)異常，剖檢后觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、卵巢/睪丸、胃和腸等主要臟器無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。

2.2 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 一般觀察 試驗(yàn)期間，各組大鼠未見(jiàn)死亡情況。大鼠被毛順滑有光澤，可視黏膜顏色正常，呼吸狀態(tài)良好，飲水、攝食未見(jiàn)異常，排泄物形態(tài)正常，分泌物未見(jiàn)異常增加，未出現(xiàn)行為異常情況。

2.2.2 飲水量 給藥第7、21天及停藥后7 d各劑量組大鼠的每日飲水量差異不明顯；給藥第14天，與對(duì)照組雌性大鼠相比，中劑量組雌性大鼠飲水量極顯著增加（P<0.01）；給藥第28天，與對(duì)照組雄性大鼠相比，低劑量組中雄性大鼠飲水量極顯著增加（P<0.01）（表1）。

表1 大鼠每日每只平均飲水量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results of average daily drinking water consumption of each rat mL

2.2.3 采食量 給藥第14天高、中劑量組雌性大鼠的采食量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；自給藥21 d起各組大鼠的采食量差異不顯著（P>0.05）（表2）。

表2 大鼠每日每只平均采食量變化結(jié)果Table 2 The change of average daily intake of each rat g

2.2.4 體重變化 給藥第7天，中劑量組雄性大鼠體重顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；給藥第14天高、中劑量組雌性大鼠體重顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；自給藥第21天起各組體重差異不顯著（P>0.05）；各給藥組大鼠增重率與對(duì)照組相比差異均不顯著（P>0.05）（表3）。

2.2.5 血常規(guī)指標(biāo) 給藥30 d后對(duì)部分大鼠進(jìn)行血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)，與對(duì)照組雌性大鼠相比，中劑量組雌性大鼠白細(xì)胞指標(biāo)顯著下降（P<0.05）。與對(duì)照組雄性大鼠相比，高、中劑量組雄性大鼠白細(xì)胞指標(biāo)顯著或極顯著下降（P<0.05；P<0.01）；高劑量組雄性大鼠淋巴細(xì)胞指標(biāo)顯著下降（P<0.05）；高劑量組雄性大鼠中性粒細(xì)胞指標(biāo)顯著上升（P<0.05）。其余各組之間各指標(biāo)差異均不顯著（P>0.05），停藥7 d后，各組之間無(wú)顯著差異（P>0.05）（表4、5）。

2.2.6 血液生化指標(biāo) 給藥30 d 后，與對(duì)照組雌性大鼠相比，高劑量雌性大鼠血液中TG水平顯著上升（P<0.05）；中劑量組雌性大鼠BUN水平顯著下降（P<0.05），CREA水平顯著上升（P<0.05）；低劑量組雌性大鼠ALT、TG水平均顯著上升（P<0.05）。與對(duì)照組雄性大鼠相比，高劑量組雄性大鼠BUN、CREA和TBIL水平均顯著下降（P<0.05）；中、低劑量組雄性大鼠BUN水平顯著下降（P<0.05）；其余各組之間各指標(biāo)差異均不顯著（P>0.05）（表6）。

停藥7 d后，與對(duì)照組雌性大鼠相比，高劑量組雌性大鼠AST、TG水平均顯著降低（P<0.05），CREA、TP水平均顯著升高（P<0.05）；低劑量組雌性大鼠GLB水平顯著升高（P<0.05），TG水平顯著降低（P<0.05）。與對(duì)照組雄性大鼠相比，高劑量組雄性大鼠GLU、TBIL水平均顯著降低（P<0.05），TP含量水平顯著升高（P<0.05）；中劑量組雄性大鼠GLU水平顯著降低（P<0.05）；低劑量組雄性大鼠ALT水平顯著降低（P<0.05）。其余各組之間各指標(biāo)差異均不顯著（P>0.05）（表7）。

2.2.7 臟器系數(shù) 給藥30 d后，與對(duì)照組雌性大鼠相比，高劑量組雌性大鼠胸腺指數(shù)顯著下降（P<0.05），其余各組之間各指數(shù)差異均不顯著（P>0.05）（表8）。

停藥7 d后，與對(duì)照組雌性大鼠相比，雌性大鼠各組各臟器系數(shù)均無(wú)顯著差異（P>0.05）。與對(duì)照組雄性大鼠相比，高劑量組雄性大鼠心臟指數(shù)顯著降低（P<0.05），低劑量組雄性大鼠腎臟指數(shù)顯著升高（P<0.05），中劑量組雄性大鼠胸腺指數(shù)顯著降低（P<0.05），其余各組各臟器指數(shù)均無(wú)顯著差異 （P>0.05）（表9）。

2.2.8 組織病理學(xué)檢查 對(duì)各組大鼠進(jìn)行大體剖檢發(fā)現(xiàn)，辣蓼黃酮提取物高、中、低劑量組和對(duì)照組大鼠主要臟器均未見(jiàn)明顯病變。對(duì)大鼠進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各藥物組與對(duì)照組大鼠均未見(jiàn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性，細(xì)胞之間無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核、質(zhì)清晰；肝細(xì)胞核大且圓，核膜清楚；脾臟髓、質(zhì)清晰，未見(jiàn)結(jié)締組織增生；肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞核、質(zhì)清晰，肺泡腔清晰飽滿(mǎn)；腎小球未見(jiàn)明顯增大、萎縮或變性等；腸絨毛完整，排列整齊，絨毛外覆一層單層柱狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞呈空泡狀，腸腺結(jié)構(gòu)完整清晰；卵泡細(xì)胞間出現(xiàn)大小不同的腔隙，皮質(zhì)層內(nèi)可觀察到處于不同發(fā)育階段的卵泡，以原始卵泡居多；曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)清晰，睪丸間質(zhì)未見(jiàn)出血壞死等，睪丸間質(zhì)細(xì)胞、肌樣細(xì)胞、精原細(xì)胞、支持細(xì)胞、各級(jí)精母細(xì)胞及精子結(jié)構(gòu)清晰完整（圖1、2）。

A～I(xiàn)，高劑量組心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、十二指腸、卵巢、睪丸；A′～I(xiàn)′，對(duì)照組心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、十二指腸、卵巢、睪丸。下同A-I,Heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovary and testis of high dose group；A′-I′,Heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovary and testis of control group.The same as below圖1 給藥30 d后大鼠各臟器組織病理學(xué)觀察（HE,400×）Fig.1 Histopathological observation on the organs of rats 30 days after the administration （HE,400×）

圖2 停藥 7 d后大鼠各臟器組織病理學(xué)觀察（HE,400×）Fig.2 Histopathological observation on the organs of rats after 7 days of drug withdrawal （HE,400×）

綜上所述，各藥物組與對(duì)照組大鼠的主要器官病理切片未見(jiàn)特征性病變。

3 討 論

辣蓼是中國(guó)傳統(tǒng)中藥之一，《本草綱目》、《別錄》、《唐本草》、《嶺南采藥錄》等多部中國(guó)古代醫(yī)書(shū)中均有對(duì)辣蓼的功效應(yīng)用的記載。辣蓼在中國(guó)常用于防治痢疾、腹瀉、胃腸炎、子宮出血、跌打腫痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛及寄生蟲(chóng)疾病等，外用治療毒蛇咬傷、皮膚濕疹時(shí)，具有良好療效[12]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中，辣蓼與青蒿、蒼耳、赤小豆、苦杏仁等中藥混合，加以面粉、麩皮混合發(fā)酵制成六神曲，具有健脾利胃、消食化中等功效[13-14]。辣蓼配合牛耳楓使用，是海南黎藥的代表之一，水提濃縮制成的復(fù)方牛耳楓片對(duì)急性腸胃炎和消化不良患者的療效顯著[15]。周世明等[16]發(fā)現(xiàn)，采用新鮮辣蓼莖葉粉碎后加5倍質(zhì)量的水放置12 h后濾過(guò)的原液3倍稀釋后，可用于農(nóng)作物種植中防治蚜蟲(chóng)、茶毛蟲(chóng)、稻飛虱地老虎等多種昆蟲(chóng)。肖祝華等[17]研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼對(duì)大腸埃希菌性腹瀉有良好的治療作用，其作用機(jī)制可能與減少腸組織炎癥因子釋放、改善腸道黏膜屏障、干預(yù) TGF-β/Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Devesh等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮可造成Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4,TLR4）下調(diào)及AP-1和p-JNK蛋白水平的下降，且TLR4途徑的阻斷及Sirtuin1/Nrf2途徑的增加，誘導(dǎo)抗氧化劑防御，減少了炎癥和氧化應(yīng)激。但鮮見(jiàn)有關(guān)其毒理學(xué)的研究，故為揭示辣蓼黃酮提取物在中毒過(guò)程中所出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，本研究對(duì)辣蓼黃酮提取物進(jìn)行了安全性研究。

急性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物安全性的重要指標(biāo)，其結(jié)果可為后續(xù)的亞急性、慢性毒性試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)[19]。急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)中，辣蓼黃酮提取物的給藥劑量達(dá)到20 g/kg BW時(shí)，未出現(xiàn)小鼠中毒癥狀或死亡；最大給藥量試驗(yàn)中，藥物劑量達(dá)到30 g/kg BW，未出現(xiàn)小鼠中毒或死亡的情況。大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果中，各劑量組大鼠在給藥期間和停藥期間被毛順滑有光澤，可視黏膜顏色正常，發(fā)育良好。這與李洋等[20]研究發(fā)現(xiàn)主要有效成分為黃酮的叉分蓼在劑量范圍內(nèi)屬于安全無(wú)毒的結(jié)果一致，也與賴(lài)偉勇[21]對(duì)辣蓼等的急性毒性研究結(jié)果一致。同期同性別大鼠各組之間飲水量略有差異，但差異并不明顯，雌性大鼠的增重趨勢(shì)低于雄性大鼠，這與大鼠的生長(zhǎng)趨勢(shì)相符合[22]。

血常規(guī)和血液生化指標(biāo)中，停藥7 d后，各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組相比差異不顯著；ALT、AST是反應(yīng)肝臟實(shí)質(zhì)損害的指標(biāo)，BUN和CREA是反映腎功能的指標(biāo)[19]。本試驗(yàn)中連續(xù)給藥30 d后，中劑量組雌性大鼠BUN和CREA、各給藥組雄性大鼠BUN、高劑量組雄性大鼠CREA與對(duì)照組相比顯著降低，說(shuō)明該藥物對(duì)大鼠腎臟有一定的影響，但其變化在正常范圍內(nèi)。

臟器系數(shù)可在一定程度上體現(xiàn)藥物對(duì)機(jī)體的毒性，且能直觀的觀察到臟器的變化，可作為判斷藥物在體內(nèi)毒性累積的指標(biāo)之一[23]。在停藥7 d后，低劑量雄性大鼠腎臟指數(shù)明顯高于其他組,表明辣蓼黃酮提取物給藥后會(huì)對(duì)大鼠腎臟有輕度損傷。各藥物組雌性、雄性大鼠胸腺指數(shù)較對(duì)照組均有下降，胸腺是大鼠的免疫器官，其具有先發(fā)育后退化的特征[24]。根據(jù)本研究結(jié)果分析，辣蓼黃酮提取物長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)對(duì)大鼠胸腺造成輕微的影響。

病理組織學(xué)診斷是目前臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的一種診斷方式[25]，對(duì)辣蓼黃酮提取物各劑量組與對(duì)照組的大鼠進(jìn)行病理組織學(xué)切片觀察后發(fā)現(xiàn)，各組的主要臟器結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，未見(jiàn)炎性浸潤(rùn)、增生、變性等異常情況，未出現(xiàn)特征性病理變化。綜上所述，辣蓼黃酮提取物在5 g/kg BW以下連續(xù)應(yīng)用30 d不會(huì)對(duì)大鼠造成毒性損害，為辣蓼黃酮的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)論證，有助于促進(jìn)辣蓼黃酮提取物的推廣。

4 結(jié) 論

急性毒性試驗(yàn)測(cè)得辣蓼黃酮提取物口服給藥的最大給藥量為30 g/kg BW；亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，辣蓼黃酮提取物以5 g/kg BW或以下對(duì)大鼠口服給藥后30 d，大鼠血液學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)未見(jiàn)明顯變化，表明辣蓼黃酮提取物在5 g/kg BW及以下劑量對(duì)大鼠無(wú)毒副作用，安全性好。