桑黃中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分提取及其化學(xué)成分鑒定

鄭美瑜，王 璐，2，劉 哲，張文娟，2，高 浦，3，陸勝民，*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江 杭州 310021; 2.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

桑黃()是一種寄生于桑樹、楊樹等闊葉樹腐朽的樹干上的大型珍貴藥用真菌，屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、針層孔屬的真菌。桑黃的藥用最早記載于《本草綱目》，傳統(tǒng)具有化瘀、止血等作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、降血糖等功效，是國際公認的最佳抗癌真菌之一。據(jù)報道桑黃主要的活性成分有小分子的三萜酸和黃酮類物質(zhì)，以及大分子的多糖類物質(zhì)等，也對這些物質(zhì)進行了提取研究。但對提取物的功能活性研究多集中于多糖類成分，對于黃酮類等小分子物質(zhì)的研究還較少。

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性代謝疾病，在全世界發(fā)病率高，更是成為全球三大慢性非傳染疾病之一，官方數(shù)據(jù)顯示，到2025年，全球糖尿病發(fā)病人群將高達3.33億人次。糖尿病的病因是由于受損的胰腺β細胞導(dǎo)致胰島素分泌不足或者胰島素抵抗等所致的糖代謝紊亂，目前常通過修復(fù)受損的β細胞、增加胰島素敏感性、延緩糖類的消化吸收、增加周圍組織對葡萄糖的利用等途徑來干預(yù)，其中延緩糖類的消化吸收是一條重要的途徑。α-葡萄糖苷酶是把碳水化合物水解成正常生理活動所需的葡萄糖的關(guān)鍵酶，抑制α-葡萄糖苷酶活性可以延遲碳水化合物的消化和吸收，從而減緩了血糖的快速升高，增強對胰島素刺激作用的敏感性并減少對胰腺刺激作用，因此目前已經(jīng)開發(fā)了多種α-葡萄糖苷酶抑制劑的藥物。但是合成的藥物具有一定的毒副作用，且價格較昂貴，因此，已經(jīng)開始逐漸從天然產(chǎn)物中篩選。本課題組在篩選桑黃中抑制α-葡萄糖苷酶的成分時發(fā)現(xiàn)，桑黃的水提取成分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性較低，而桑黃的醇提取物的抑制活性很強，表明桑黃中具有強烈抑制α-葡萄糖苷酶的物質(zhì)存在。

因此，本文以α-葡萄糖苷酶抑制活性為引導(dǎo)，通過醇提法從桑黃中提取小分子物質(zhì)，對提取工藝進行優(yōu)化，并對提取物通過超高效液相和高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定了提取物中的主要多酚類、萜類等成分，以期為桑黃在α-葡萄糖苷酶抑制劑及其化學(xué)成分方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃子實體，采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所桑黃種植基地，子實體先曬至半干再在60 ℃烘干，干燥后磨粉并過40目篩備用。

α-葡萄糖苷酶(來自釀酒酵母)購自Sigma公司；pNP-α-Glu(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranosodide)和蘆丁標準品購自上海源葉生物科技有限公司；乙醇、NaCO、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、二甲基亞礬(DMSO)均為分析純。

酶標儀(BLx 800)，美國BioTek儀器公司；其他儀器有水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、凍干機、干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 黃酮標準曲線的繪制

精密稱取30 mg蘆丁用60%乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中，配制成300 mg·L蘆丁溶液，取0、1、2、3、4、5、6 mL于25 mL刻度試管中，加60%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液2.5 mL，用水定容至25 mL，振蕩搖勻后，室溫下放置15 min。以第一管不加樣品的試管調(diào)零，在512 nm波長處測定吸光值。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

在2 mL的離心管中加入pH 6.8的磷酸鉀緩沖液560 μL，加入0.4 U·mL的 α-葡萄糖苷酶 100 μL，再加入不同濃度的樣品溶液各40 μL，混勻，37 ℃恒溫放置15 min，加入5 mmol·L的對硝基苯- α -D-吡喃半乳糖苷(PNPG)100 μL，混勻，37 ℃恒溫反應(yīng) 30 min。最后加入0.2 mol·L的NaCO溶液 400 μL，混勻，把反應(yīng)液200 μL移入96孔的酶標板中，在405nm波長下測值。

1.2.3 α-淀粉酶抑制活性測定

試管內(nèi)加入10 U·mL的α-淀粉酶50 μL，分別加入不同濃度的樣品溶液20 μL，混勻，37 ℃恒溫10 min，加入10 g·L淀粉溶液0.5 mL(或5 g·L淀粉溶液1 mL)，混勻，37 ℃恒溫反應(yīng)3 min，加入1 mL DNS試劑，沸水浴中反應(yīng)5 min，流水冷卻，向試管中加入蒸餾水5 mL，混勻，于540 nm波長下測定各溶液的吸光度。

1.2.4 乙醇體積分數(shù)對桑黃黃酮和糖苷酶抑制率的影響

桑黃適量分別用體積分數(shù)0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇在80 ℃、料液比1∶20提取2 h，測定提取液中的黃酮含量。提取后的渣再提取一次，合并兩次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干，得到不同體積分數(shù)的乙醇提取物。提取物溶于20%的DMSO溶液中，配成濃度為10 g·L的溶液，用于糖苷酶抑制率的測定。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制成分提取工藝優(yōu)化

根據(jù)前面乙醇濃度的試驗結(jié)果，桑黃的醇提物對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制效果，而對α-淀粉酶的抑制較弱，因此對抑制α-葡萄糖苷酶的成分進行提取。結(jié)合文獻報道，選擇影響提取的四個因素乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間，每個因素三個水平，提取次數(shù)為1次，以黃酮提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標進行四因素三水平的正交試驗優(yōu)化，得到優(yōu)化的工藝參數(shù)后，在優(yōu)化條件下再進行提取次數(shù)的試驗。

1.2.6 提取物中化學(xué)成分的鑒定

提取物中化學(xué)成分的鑒定通過Q ExactiveFocus 組合型四極桿 Orbitrap 質(zhì)譜儀(Thermo Electron， Bremen， Germany)并連接戴安Ultimate 3000 UHPLC 系統(tǒng)(ThermoFisher Scientific， California， USA)。提取物適量用甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾。

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)， 流動相0.1%甲酸水溶液(B)和乙腈(A)，進樣室溫度10 ℃，柱溫35 ℃，洗脫梯度( 0～2 min，95%～80% A; 2～5 min，80%～ 70% A; 5～8 min，70%～65% A; 8～10 min，65%～35% A; 10～20 min，35%～2% A; 20～23 min，2%～2% A; 23～23.1 min，2%～95% A; 23.1～26 min，95% A)，流速0. 3 mL·min，進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正，負離子模式下掃描，數(shù)據(jù)采用一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴性前三強二級子離子掃描(Full Scan MS/dd-MS2)，質(zhì)譜掃描范圍: 120～1 500; 一級分辨率為 35 000， 二級分辨率為17 500；隔離窗口為2.0：噴霧電壓(+)為3.5 kV， 噴霧電壓(-)為3.0 kV; 鞘氣壓力為30 arb; 輔助氣壓力為10 arb; 毛細管溫度為320 ℃; S-lens為50；歸一化的碰撞能量為30 %、40%、60%。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇體積分數(shù)對桑黃提取液中黃酮含量和糖苷酶抑制率的影響

桑黃中的活性成分三萜酸、黃酮等具有不同的極性，不同的乙醇體積分數(shù)可以萃取不同極性的活性成分，因此，通過不同體積分數(shù)乙醇對活性成分進行篩選。不同體積分數(shù)乙醇提取桑黃中的黃酮提取率如圖1所示，從圖1可以看出，乙醇體積分數(shù)低和高都不利于黃酮的溶出，適中的乙醇體積分數(shù)黃酮的提取率較高，40%和60%的乙醇黃酮提取率較高。

圖1 乙醇體積分數(shù)對桑黃黃酮提取率的影響

不同乙醇體積分數(shù)的桑黃提取物凍干后，溶于20%的DMSO中配成10 g·L濃度，對于抑制濃度超過100%的用緩沖溶液進行梯度稀釋，測定稀釋液的抑制率，不同體積分數(shù)的乙醇提取物在不同稀釋倍數(shù)下對兩種糖苷酶的抑制率如表1所示。從表1看出，乙醇體積分數(shù)較低時，提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率較低，而乙醇體積分數(shù)提高時，抑制率升高，其中60%乙醇提取物最高，80%的次之，IC分別為0.021 g·L和0.029 g·L。桑黃醇提物對α-淀粉酶的抑制率相比α-葡萄糖苷酶要低很多，10 g·L時的抑制率最高也只有69.2%，但乙醇體積分數(shù)對抑制率的變化規(guī)律與α-葡萄糖苷酶一致，也是乙醇體積分數(shù)為60%的提取物抑制率最高。因此，后續(xù)的提取研究中將提取對α-葡萄糖苷酶的抑制率較高的活性成分。

表1 桑黃不同乙醇提取物對兩種α-糖苷酶的抑制率

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制成分提取工藝優(yōu)化

根據(jù)乙醇體積分數(shù)試驗的結(jié)果，結(jié)合文獻報道，選擇乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比、提取時間，對桑黃中α-葡萄糖苷酶抑制成分的提取工藝進行正交試驗，測定各提取液中的黃酮含量。提取液濃縮干燥所得提取物用20%DMSO配成10 g·L溶液并用pH 6.8的緩沖溶液稀釋200倍，測定稀釋液對α-葡萄糖苷酶的抑制率，試驗結(jié)果如下表2所示，從表可知，影響總黃酮提取率的因素主次順序為料液比>提取溫度>乙醇體積分數(shù)>提取時間，最佳的提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)40%，提取溫度80 ℃，提取時間3 h，料液比1∶30；影響α-葡萄糖苷酶抑制率的因素主次順序為料液比>提取時間>乙醇體積分數(shù)>提取溫度，酶抑制率最高的最佳的提取工藝條件為乙醇濃度60%，提取溫度70 ℃，提取時間3 h，料液比1∶30。綜合桑黃黃酮和-葡萄糖苷酶抑制率的優(yōu)化提取條件，桑黃中降血糖成分較優(yōu)的提取條件定為乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度80 ℃，提取時間3 h，料液比1∶30，在該條件下黃酮的提取率為86.4 mg·g，比乙醇體積分數(shù)試驗中提取率提高近一倍。根據(jù)已有的報道，該提取率要比回晶等、李善姬等的研究中黃酮提取率要高。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制成分提取正交試驗結(jié)果

在該條件下對桑黃進行了提取次數(shù)實驗，測定每次提取液中的黃酮含量，每次的提取液濃縮干燥的提取物用20%DMSO配成10 g·L溶液并用緩沖溶液梯度稀釋，測定各稀釋液對α-葡萄糖苷酶的抑制率，實驗結(jié)果如表3所示，從表中可知提取2次黃酮已經(jīng)基本溶出；對α-葡萄糖苷酶的抑制率第2次提取與第3次相差不大，因此，提取以2次為宜。

表3 提取次數(shù)對黃酮提取率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

2.3 抑制α-葡萄糖苷酶提取物的化學(xué)成分鑒定

提取物通過液質(zhì)聯(lián)用進行成分鑒定，通過參考文獻、數(shù)據(jù)庫和標準品對照，靶向分析了提取物中多酚、黃酮和萜類成分，共鑒定出45種成分，它們的高分辨率提取的總離子流圖如圖2所示，各成分的保留時間、準分子離子峰的質(zhì)荷比、分子式、二級碎片等數(shù)據(jù)如表4所示，可以看出酚類物質(zhì)種類最多，其次是黃酮類物質(zhì)。酚類物質(zhì)的母環(huán)有結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的吡喃酮和苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，如Phelligridins、Phelligridimers、Interfungins、Phellifuropyranone系列化合物，該類化合物含有酚羥基較多，具有較強抗氧化和清除自由基的活性；也有較簡單的單苯環(huán)酚酸類化合物，如原兒茶醛、丁香酸、原兒茶酸、咖啡酸等。

表4 α-葡萄糖苷酶抑制成分的鑒定結(jié)果

續(xù)表4 Continued Table 4

N-A、N-B為負離子模式；P-A、P-B為正離子模式。

3 結(jié)論

本文研究了桑黃對α-葡萄糖苷酶的抑制活性組分，結(jié)果表明，桑黃60%醇提物具有很強的抑制活性，其IC低至0.021 g·L。以α-葡萄糖苷酶的抑制活性和黃酮含量為引導(dǎo)，優(yōu)化了乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間和料液比四個因素，得到了較佳工藝參數(shù)，在優(yōu)化條件下提取2次，黃酮提取率達到159.3 mg·g。通過UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS液質(zhì)聯(lián)用靶向分析了多酚、黃酮和萜類成分，共鑒定出45種成分。

通過本文的研究表明，桑黃中存在具有較強抑制α-葡萄糖苷酶活性的組分，這些成分是小分子的多酚類物質(zhì)。多糖類成分抑制活性較低，它們的降血糖活性可能是通過其它的途徑。為了進一步更精確明晰抑制α-葡萄糖苷酶活性的組分，后續(xù)還需要通過超濾質(zhì)譜，明確真正與酶發(fā)生結(jié)合的組分，以及它們的結(jié)合強度。后續(xù)還需要通過體內(nèi)實驗驗證這些具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的組分在體內(nèi)的降血糖作用及其機制，以便后續(xù)開發(fā)桑黃降血糖的產(chǎn)品。