刷格痛風(fēng)膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

哈馬莫支阿木 張英秀 張雪梅 馮維國 張志鋒

【摘 要】 目的：建立刷格痛風(fēng)膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用 TLC 法鑒別刷格痛風(fēng)膏中的黃連、大黃、黃柏;采用 HPLC 法測定鹽酸小檗堿的含量;色譜柱為 Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm Column，5 μm）;以乙腈-0.1 %磷酸水溶液（28∶[KG-*3/5]72）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，流速1 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，檢測波長265 nm，柱溫25 ℃。結(jié)果：薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾;鹽酸小檗堿在 0.004～0.1 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.9998），平均回收率為99.45%，RSD 為1.70%（n=6）。結(jié)論：該方法具有可行性，方法準(zhǔn)確可靠，操作簡單，重復(fù)性好，可作為刷格痛風(fēng)膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

【關(guān)鍵詞】 刷格痛風(fēng)膏;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);含量測定;鹽酸小檗堿

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）06-0058-05

Studies on Quality Specification for Shuage Tongfeng Gao

HAMA Mozhiamu1 ZHANG Yingxiu1 ZHANG Xuemei2 FENG Weiguo2 ZHANG Zhifeng1，3*

1.School of Pharmacy， Southwest Minzu University，Chengdu 610225，China

2.Traditional Chinese and Qiang? Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County，Beichuang 622750，China

3.Sichuan Provincial Qiang-Yi Medicinal Resources Protection and Utilization Technology Engineering Laboratory，Chengdu 610225，China

Abstract：Objective To establish the quality standard of Shuage Tongfeng Gao. Methods Rhizoma Coptidis、Rhei Radix et Rhizoma and cortex phellodendri were identified by TLC method.The content of Berberine Hydrochloride was determined by HPLC.The chromatographic separation was performed on a Inertsil ODS-3 Column（4.6×250 mm，5 μm）.The mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid（28∶[KG-*3/5]72） with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1，and the injection volume was 2 μL.The detection wavelength was 265 nm. The Column temperature was at 25 ℃. Results The spots in TLC were clear without any interferences. Berberine Hydrochloride showed a good linear relationship within the range of 0.004～0.1 μg（r=0.9998），the average recovery rate was 99.45%，and the RSD was 1.7% （n=6 ）.Conclusion The established qualitative and quantitative methods are simple，reliable and accurate，which can be used for the quality control of Shuage Tongfeng Gao.

Key words：Shuage Tongfeng Gao;Quality Control;Content Determination;Berberine Hydrochloride

痛風(fēng)與嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，以關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛、功能障礙等為主要臨床表現(xiàn)，是長期無癥狀高尿酸血癥的結(jié)果[1-2]。羌醫(yī)認(rèn)為嚕唔依基（痛風(fēng)）是因?yàn)轱L(fēng)吹過多而痛，又名“火燒樣石頭堵塞樣痛”，屬羌醫(yī)“堵塞病”范疇。羌醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)病位在四肢，特別腳拇趾掌關(guān)節(jié)好發(fā)，與脾胃和肝腎器官功能失調(diào)密切相關(guān)。脾胃和肝腎功能紊亂后產(chǎn)生火毒石，火毒石不在體內(nèi)正常運(yùn)轉(zhuǎn)排泄，而是不斷堆積在血管和內(nèi)臟器官里，堵塞了正常運(yùn)行的管道，從而使血液異常[3-4]。刷格痛風(fēng)膏是北川羌族自治縣中羌醫(yī)醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)方，由大黃、黃連、黃柏、綿馬貫眾、威靈仙、白芷等組成，主要起消腫止痛、軟堅(jiān)散結(jié)、化石通管、益肺健脾健腎、利水祛毒作用，在羌族地區(qū)有上百年的用藥史，臨床療效明確。文獻(xiàn)報(bào)道，中藥黃連、黃柏在體外可以顯著抑制黃嘌呤氧化酶的活性[5-7]，小檗堿是黃連、黃柏中主要的有效成分，具有抗尿酸、治療痛風(fēng)的作用[8-9]。本實(shí)驗(yàn)采用 TLC 法鑒別刷格痛風(fēng)膏中的黃連、大黃、黃柏，并采用HPLC進(jìn)行含量測定，進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)研究，旨在為刷格痛風(fēng)膏的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。本研究中對方中主要藥味進(jìn)行了定性、定量研究，可為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂和臨床安全用藥提供參考，進(jìn)一步推動(dòng)刷格痛風(fēng)膏的發(fā)展和應(yīng)用。810809B7-C3AC-43E1-85FA-04ED8058FCD0

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀（Waters公司）;Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm Column，5 μm）（Waters公司）;METTLER TOLEPO ME55電子天平（梅特斯-托利多儀器（上海）有限公司）;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;LabServ10-100 μL移液槍（上海臻諾生物科技有限公司）。

1.2 試藥 黃連對照藥材（批號20032705，成都康邦生物科技有限公司）;大黃對照藥材（批號20060703，成都康邦生物科技有限公司）;綿馬貫眾對照藥材（批號20081003，成都康邦生物科技有限公司）;鹽酸小檗堿對照品（批號20051903，HPLC>98%，成都康邦生物科技有限公司）;屈臣氏水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）;色譜級甲醇、乙腈（北京迪科馬科技有限公司）;色譜級磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;分析純鹽酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;薄層色譜硅膠G板（批號20170902，青島海洋化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃連 選3個(gè)批次的刷格痛風(fēng)膏，除去裱褙材料，分別稱取膏體2.5 g，剪成小塊，加甲醇25 mL，超聲處理30 min濾過，濾液濃縮至10 mL作為供試品溶液;另取不含黃連的刷格痛風(fēng)膏陰性對照品2.5 g，照供試品溶液制備方法制成缺黃連的陰性對照溶液;稱取黃連對照藥材0.25 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。吸取上述3種溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶[KG-*3/5]6∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]2）為展開劑，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯3個(gè)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果如圖1所示。

2.1.2 大黃 選3個(gè)批次的刷格痛風(fēng)膏，除去背襯層和覆蓋物，分別稱取膏體3 g，剪成小塊，加甲醇25 mL，超聲處理1 h，濾過，將濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取不含大黃的膏體3 g，照供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述3種溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（15∶[KG-*3/5]5∶[KG-*3/5]0.3）為展開劑，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果如圖2所示。

2.1.3 黃柏 選3個(gè)批次的刷格痛風(fēng)膏，除去背襯層和覆蓋物，分別稱取膏體3 g，剪成小塊，加25 mL甲醇超聲1 h，濾液蒸干，加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。稱取不含黃柏的膏體3 g，同法制成陰性對照溶液。稱取黃柏對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。稱取10 mg鹽酸黃柏堿對照品，置100 mL容量瓶中定容至刻度，得到0.1 mg/mL的鹽酸黃柏堿對照品溶液。取供試品溶液、陰性對照溶液和對照藥材溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶[KG-*3/5]6∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，置日光燈下觀察。供試品色譜中，在與對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。結(jié)果如圖3所示。

2.2 鹽酸小檗堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm Column，5 μm）;以乙腈-0.1%磷酸水溶液（28∶[KG-*3/5]72）為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，檢測波長265 nm。

2.2.2 對照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1毫升含0.1 mg鹽酸小檗堿的對照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取膏體2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶[KG-*3/5]1）的混合溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率100 W，頻率40kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-鹽酸（100∶[KG-*3/5]1）的混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用 0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 精密稱取不含鹽酸小檗堿的陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法制成的陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取上述3種溶液各 2 μL，注入液相色譜儀，記錄 HPLC色譜圖，結(jié)果鹽酸小檗堿陰性對照與鹽酸小檗堿對照品色譜峰相應(yīng)位置上無干擾。如圖4所示。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到1 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液。分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液500、200、100、80、50、20 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002 mg/mL不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取各對照品溶液2 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到鹽酸小檗堿的回歸方程y=55900278.40x-27861.07，r=0.9998，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在0.004～0.1 μg 范圍內(nèi)，其進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.30%（n=6），表明儀器精密度良好。810809B7-C3AC-43E1-85FA-04ED8058FCD0

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品 6 份，按 “2.2.4”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，測得鹽酸小檗堿的平均含量為 0.26 mg/g，RSD 為 1.74%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于制備后0、2、4、8、16、24 h按上述色譜條件進(jìn)樣測定，測得鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.74%，表明刷格痛風(fēng)膏供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的樣品適量，分別精密加入對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。結(jié)果6份刷格痛風(fēng)膏中鹽酸小檗堿的平均加樣回收率為99.45%，RSD為1.70%（n=6）。

2.2.11 含量測定 精密稱取6份樣品，按“2.2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

刷格痛風(fēng)膏為傳統(tǒng)膏藥劑型，具有組成復(fù)雜、主藥含量少和基質(zhì)難于去除的特點(diǎn)，基質(zhì)與待測成分分離是刷格痛風(fēng)膏含量測定的關(guān)鍵。因此，本研究依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]并結(jié)合本制劑的特點(diǎn)，在制備供試品溶液時(shí)，考察了不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、60%乙醇、甲醇-鹽酸（100∶[KG-*3/5]1））、不同提取方法（超聲、回流）、不同提取時(shí)間（30 h、1 h、1.5 h、2 h）、不同料液比（1∶[KG-*3/5]10、1∶[KG-*3/5]20、1∶[KG-*3/5]30、1∶[KG-*3/5]40、1∶[KG-*3/5]50）對鹽酸小檗堿含量測定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇-鹽酸（100∶[KG-*3/5]1）超聲30 min，料液比為1∶[KG-*3/5]10時(shí)提取率最高。因此，采用該方法作為鹽酸小檗堿含量測定的供試品溶液制備方法。本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，還考察了不同的色譜條件對刷格痛風(fēng)膏中鹽酸小檗堿含量的影響，最終確定了柱溫為25 ℃，檢測波長為265 nm，流動(dòng)相比例為乙腈-0.1 %磷酸水溶液（28∶[KG-*3/5]72）的HPLC色譜條件。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以大黃、黃連、黃柏薄層色譜鑒別和鹽酸小檗堿含量測定方法準(zhǔn)確、可靠，可以作為刷格痛風(fēng)膏的質(zhì)量控制方法。

參考文獻(xiàn)

[1]成學(xué)飛，王愛華，謝清，等.刺絡(luò)放血療法治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2020，9（11）：69-73.

[2]王海燕，劉智紅.痛風(fēng)綜合診療新進(jìn)展[J].中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2020，37（5）：511-513.

[3]楊福壽，包希福，李紅梅，等.羌醫(yī)石病學(xué)理論指導(dǎo)下治療1570例膝石病的臨床療效報(bào)道[J].中藥與臨床，2011，2（5）：53-55.

[4]楊福美，楊偉欽，李紅梅，等.羌醫(yī)學(xué)病因病機(jī)概述[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2016，22（6）：6-7.

[5]楊福美，楊偉欽，李紅梅，等.羌醫(yī)學(xué)病因病機(jī)概述[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2016，22（6）：6-7.

[6]李嘉誠，吳嵐，蔡同凱，等.黃柏化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2018，36（5）：389-391.

[7]周瑞，項(xiàng)昌培，張晶晶，等.黃連化學(xué)成分及小檗堿藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2020，45（19）：4561-4573.

[8]李孟鉞.高尿酸血癥和痛風(fēng)的流行病學(xué)及影響因素研究[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2019，32（11）：1649-1650.

[9]宋紅萍，陳冠容.小檗堿的藥理作用及臨床新用[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2007（2）：21-22.

[10]熊曉毅，王劍.小兒肝炎顆粒多成分含量測定[J].中國現(xiàn)代中藥，2021，23（3）：542.

[11]吳柯楠，唐志書，梁艷妮，等.白頭翁湯有效成分提取工藝和含量測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：184-186.

[12]吳吉英，散丹，李華，等.HPLC測定蒙藥吉日順-8中鹽酸小檗堿的含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2019，25（12）：33-35.

（收稿日期：2021-08-05 編輯：陶希睿）810809B7-C3AC-43E1-85FA-04ED8058FCD0