麻醉藥物對生物鐘基因的影響及機(jī)制研究進(jìn)展

王燁，晏馥霞，鄧曉明

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院麻醉科，北京100144； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院麻醉科，北京100037)

全身麻醉被認(rèn)為是患者術(shù)后睡眠中斷和疲勞的原因，部分歸因于晝夜節(jié)律的改變[1]。生物鐘基因的發(fā)現(xiàn)具有重要意義，針對鼠的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，睡眠障礙可通過改變生物鐘基因誘發(fā)抑郁及神經(jīng)炎癥[2]。目前關(guān)于全身麻醉暴露對生物鐘基因的影響及機(jī)制研究主要集中于昆蟲、動物等基礎(chǔ)研究，且研究已證實(shí)，全身麻醉對動物生物鐘的影響呈時間依賴性，全身麻醉可調(diào)節(jié)大腦及其他器官(心臟、肝臟、脾和肺)生物鐘相關(guān)基因的表達(dá)[3-5]。其中，在動物活動期進(jìn)行全身麻醉對晝夜節(jié)律的影響最大。全身麻醉可能通過N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)/糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)信號通路抑制核心生物鐘基因PER(period)的表達(dá)[6]。不同的麻醉藥物(如靜脈麻醉藥物與吸入性麻醉藥)的作用靶點(diǎn)不同，且麻醉暴露時段不同、暴露時間長短不同，對生物鐘基因的影響也存在差異?，F(xiàn)就麻醉藥物對生物鐘基因的影響及機(jī)制研究進(jìn)展予以綜述。

1 生物鐘基因概述

1.1生物鐘基因的發(fā)現(xiàn) Hardin等[7]發(fā)現(xiàn)并克隆了首個生物鐘基因PER，并完善了生物鐘基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋調(diào)控TTFL(transcription translation negative feedback loop)模型。還有研究者通過克隆PER和TIM(timeless)基因發(fā)現(xiàn)了基因產(chǎn)物TIM和PER蛋白的作用機(jī)制、光對TIM和生物鐘相位的影響、PER蛋白的磷酸化調(diào)控以及磷酸化PER激酶DBT(doubletime)和酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)[8]。PER基因被克隆后，隱花色素(cryptochrome，CRY)、PAR結(jié)構(gòu)域蛋白1、CLK(clock)、CYC(cycle)等基因也相繼被克隆。

1.2生物鐘基因表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)控模型 動物生物鐘的循環(huán)是一個基因表達(dá)的負(fù)反饋環(huán)路，也是一個基因表達(dá)的振蕩器，CLK-CYC二聚體(作用于DNA促進(jìn)轉(zhuǎn)錄)和PER-TIM二聚體(抑制CLK-CYC轉(zhuǎn)錄功能)蛋白在其中起關(guān)鍵作用。CLK-CYC可促進(jìn)一系列生物鐘相關(guān)基因(包括PER-TIM)的表達(dá)，這些基因的啟動子部位有一段E盒元件的DNA序列，CLK-CYC二聚體作用于E盒元件基因序列可促進(jìn)基因的表達(dá)；表達(dá)后的PER和TIM蛋白首先在細(xì)胞質(zhì)中累積，至夜間累積達(dá)到一定量后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中抑制CLK-CYC的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制CLK-CYC及下游基因的表達(dá)，同時，細(xì)胞質(zhì)中的PER蛋白被逐漸水解，從而構(gòu)成一個以24 h為周期的負(fù)反饋調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的振蕩器TTFL[9]。Vitatema等[10]比較小鼠與果蠅生物鐘基因的突變表型，發(fā)現(xiàn)TTFL模型在哺乳動物及果蠅之間具有共性，見表1。

1.3生物鐘的分子構(gòu)成 在分子水平哺乳動物的生物鐘包括4個核心元件，即腦和肌肉ARNT樣蛋白-1(brain and muscle ARNT-like 1，BMAL1)、CLK、PER(PER1、PER2和PER3)和CRY(CRY1和CRY2)。BMAL1是一種轉(zhuǎn)錄因子，可與CLK、組蛋白乙?；感纬啥垠w，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[11]。BMAL1：CLK可促進(jìn)PER基因和CRY基因轉(zhuǎn)錄，但自動抑制BMAL1表達(dá)；PER和CRY也可形成二聚體，作為BMAL1：CLK轉(zhuǎn)錄活性的抑制劑[12]。

表1 果蠅與小鼠生物鐘基因、突變表型比較

BMAL1是TTFL中必不可少的組件，可與CLK蛋白異源二聚化激活晝夜節(jié)律基因的表達(dá)[13]。哺乳動物的BMAL1被破壞可導(dǎo)致一系列生理功能異常，如晝夜節(jié)律消失、睡眠覺醒周期異常、視網(wǎng)膜功能異常、神經(jīng)變性以及壽命短等[13-16]。敲除BMAL1基因可破壞負(fù)反饋調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的振蕩器TTFL的穩(wěn)定[17]。BMAL1對于24 h行為周期的表達(dá)是必需的，但對于翻譯后蛋白修飾的過程是非必需的[18]。

大多數(shù)生物的行為和生理與地球晝夜周期有關(guān)。晝夜節(jié)律鐘存在于體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞中，可暫時控制細(xì)胞活動[19]。位于哺乳動物下丘腦視上核的一組神經(jīng)元是“主”生物鐘，視上核時鐘可協(xié)調(diào)非視上核組織(外圍時鐘)時鐘的活動，從而在整個生物體水平上控制晝夜節(jié)律[20]。視上核時鐘對外部刺激敏感，可通過自然提示(如光)和人工制劑(如藥物)重置[21]。

2 不同麻醉藥物暴露對生物鐘基因的影響

2.1丙泊酚對生物鐘基因的影響 丙泊酚是全身麻醉常用的鎮(zhèn)靜藥物，以靜脈給藥為主，具有鎮(zhèn)靜效果好、起效快、代謝快、無蓄積等特點(diǎn)，但丙泊酚會引發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙，且具體機(jī)制目前尚未明確[22]。海馬區(qū)是人體相對重要的區(qū)域，與學(xué)習(xí)記憶功能等存在緊密聯(lián)系[23]。丙泊酚可呈劑量依賴性地對老年雄性大鼠認(rèn)知功能產(chǎn)生不同程度的影響，并影響海馬生物鐘基因的表達(dá)水平[24]。

靜脈輸注丙泊酚也會對大腦生物鐘基因產(chǎn)生影響。Yoshida等[25]發(fā)現(xiàn)，靜脈輸注丙泊酚可顯著改變大鼠全腦生物鐘基因的表達(dá)，且停藥后靜脈麻醉的影響會持續(xù)24 h。此外，短期丙泊酚麻醉可導(dǎo)致下丘腦視交叉上核PER1和PER2表達(dá)瞬時下調(diào)[26]。在特定時間段(晚上休息期和早晨活躍期)，丙泊酚麻醉還可使視交叉上核控制的晝夜節(jié)律的相位提前[27]。Challet等[27]報道，丙泊酚給藥30 min可導(dǎo)致處于暗黑周期大鼠的晝夜節(jié)律(活動度和溫度)發(fā)生1 h的變化。

2.2吸入麻醉藥對生物鐘基因的影響 吸入麻醉藥七氟醚、異氟醚、地氟醚均會影響大腦的生物鐘基因，且白天麻醉暴露的影響大于夜晚麻醉暴露，如暴露前即有睡眠剝奪，吸入麻醉藥則會進(jìn)一步加重大腦海馬體記憶、學(xué)習(xí)功能的損傷，因此術(shù)后及時恢復(fù)生物鐘節(jié)律可盡快恢復(fù)機(jī)體正常的生理功能。有研究者通過評估嚙齒類動物麻醉暴露2 h(或更長時間)全腦基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，吸入麻醉藥(七氟醚)后嚙齒動物大腦PER2表達(dá)下調(diào)[28]。Sakamoto等[4]發(fā)現(xiàn)，大鼠吸入麻醉藥七氟醚后，其大腦中的PER2表達(dá)受到抑制，而PER2是晝夜節(jié)律“核心環(huán)”的組成部分。Kobayashi等[28]證實(shí)，大鼠吸入七氟醚2 h或6 h后，全腦晝夜節(jié)律基因表達(dá)均會受到抑制，且這種抑制至少持續(xù)24 h。

此外，白天暴露于七氟醚或異氟醚4～8 h，嚙齒類動物視交叉上核PER2表達(dá)下調(diào)[29-30]。Kadota等[31]通過研究七氟醚對PER2表達(dá)影響的時間依賴性以及七氟醚麻醉與小鼠晝夜節(jié)律/活動節(jié)奏的相互影響發(fā)現(xiàn)，早上麻醉可最大限度地抑制PER2表達(dá)，七氟醚麻醉在明、暗以及恒定黑暗條件下均可抑制PER2的表達(dá)，且光照條件可改變麻醉下的抑制率；行為分析表明，麻醉暴露還可引起休息/活動節(jié)奏的相位延遲，但尚未發(fā)現(xiàn)麻醉對晝夜節(jié)律/活動節(jié)奏的時間依賴作用。

將急性快動眼(rapid eye movement，REM)睡眠剝奪的大鼠暴露于七氟醚后，大鼠的學(xué)習(xí)與記憶功能損傷，這可能與海馬生物鐘基因BMAL1、PER2和早期生長反應(yīng)基因1表達(dá)紊亂有關(guān)，急性REM睡眠剝奪可引起海馬神經(jīng)元損傷，進(jìn)而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元形態(tài)與界線發(fā)生改變，而急性REM睡眠剝奪后行七氟醚麻醉則會加重神經(jīng)元損傷，使海馬CA1神經(jīng)元縮小[32]。認(rèn)知功能障礙是術(shù)后嚴(yán)重并發(fā)癥之一，而睡眠剝奪和吸入麻醉均是其重要促發(fā)因素[33]。哺乳動物晝夜節(jié)律受TTFL調(diào)控，是維持機(jī)體功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)的主要機(jī)制之一[33-34]。睡眠剝奪可致晝夜節(jié)律和生物鐘基因表達(dá)紊亂，并影響正常的機(jī)體功能；生物鐘基因BMAL1和PER2是維持晝夜節(jié)律正常運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵基因，參與海馬區(qū)記憶的形成，早期生長反應(yīng)基因1則參與調(diào)控生物鐘基因的表達(dá)[34]。

REM睡眠剝奪大鼠的晝夜節(jié)律生物鐘基因異常，吸入七氟醚可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，且與海馬損傷導(dǎo)致的記憶障礙相關(guān)；REM睡眠剝奪可加重七氟醚麻醉引起的大鼠海馬依賴性記憶障礙，還可使記憶障礙的恢復(fù)時間延長1周以上；大鼠吸入七氟醚后，睡眠剝奪會抑制其海馬BMAL1和早期生長反應(yīng)基因1表達(dá)超過7 d；海馬PER2表達(dá)水平在吸入七氟醚后降低，但自第3天起PER2水平由于睡眠剝奪而升高，睡眠剝奪可增強(qiáng)海馬白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6等炎癥因子的表達(dá)；此外，七氟醚吸入還可激活血漿S100β和白細(xì)胞介素-6的表達(dá)，尤其是睡眠不足者[32]。以上研究表明，術(shù)前REM睡眠剝奪可加重七氟醚暴露的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)海馬記憶障礙，吸入七氟醚和睡眠剝奪均與海馬生物鐘基因異常有關(guān)。

Cheeseman等[35]通過研究麻醉時間對蜜蜂大腦晝夜節(jié)律基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，白天麻醉暴露可導(dǎo)致蜜蜂生物鐘基因表達(dá)發(fā)生持續(xù)而明顯的偏移，從而引起“時差反應(yīng)”并導(dǎo)致時間知覺受損，而夜間麻醉對生物鐘基因的表達(dá)并無影響。G?kmen等[36]研究證明，白天經(jīng)異氟醚吸入麻醉的大鼠大腦和肝臟的BMAL1、CLK、PER2和CRY2基因的表達(dá)水平均被顯著抑制，而夜間異氟醚吸入麻醉的大鼠基因表達(dá)抑制是暫時的。Mori等[37]研究七氟醚對PER2基因啟動子組蛋白乙?；挠绊?，結(jié)果證實(shí)七氟醚可降低CLK與PER2啟動子E盒元件基因序列結(jié)合，減少組蛋白乙?；⒁种芇ER2表達(dá)。

用7%地氟醚麻醉標(biāo)準(zhǔn)小鼠2 h后，小鼠下丘腦組織生物鐘基因PER2的表達(dá)水平降低，腎臟組織中生物鐘基因PER1的表達(dá)升高，而BMAL1、白蛋白D位點(diǎn)結(jié)合蛋白的表達(dá)降低，肝臟組織生物鐘基因PER1的表達(dá)升高；用7%地氟醚麻醉缺乏PER1和PER2基因的小鼠2 h后，小鼠下丘腦組織生物鐘基因 BMAL1、CLK、白蛋白D位點(diǎn)結(jié)合蛋白的表達(dá)水平降低，同時肝腎組織生物鐘基因CRY1、CLK的表達(dá)水平也降低，表明地氟醚可顯著影響小鼠中樞及外周組織相關(guān)生物鐘基因的表達(dá)，且存在不依賴PER基因的作用途徑[38]。小鼠暴露于地氟醚后，其視交叉上核中的4個主要生物鐘基因(PER2、BMAL1、CLK和CRY1)信使RNA的表達(dá)均下調(diào)[39]?？焖倩謴?fù)晝夜節(jié)律再同步則可改善由異氟醚暴露引起的老年鼠認(rèn)知功能障礙[40]。

3 麻醉藥物暴露影響生物鐘的機(jī)制

3.1麻醉藥通過直接或間接改變分子生物鐘成分表達(dá)發(fā)揮作用 在體和離體實(shí)驗(yàn)均表明，麻醉暴露可直接或間接改變視交叉上核中核心生物鐘成分的表達(dá)，且可使生物鐘相移[25，28-30，35]。針對麻醉對分子生物鐘影響的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給藥的晝夜時間不同，生物鐘基因表達(dá)周期發(fā)生的相移不同[25,30,35]。Kadota等[31]發(fā)現(xiàn)，在上午(8:00～12:00)PER2表達(dá)周期的上升階段行七氟醚麻醉后，PER2信使RNA水平最高。還有研究顯示，七氟醚、右美托咪定和丙泊酚暴露后PER2表達(dá)水平降低，且所有麻醉暴露均在PER2表達(dá)上調(diào)階段，但并未明確PER2表達(dá)發(fā)生相移的可能性[25，28-29]。Ludin等[30]證實(shí)，小鼠暴露于異氟醚6 h后其PER2信使RNA表達(dá)周期的相位延遲。Cheeseman等[35]將蜜蜂暴露于異氟醚6 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白天的全身麻醉可導(dǎo)致持續(xù)且顯著的時鐘偏移，有效地誘發(fā)了“時差”，并導(dǎo)致時間感知受損。可見，麻醉暴露在每個生物鐘基因表達(dá)上升期間或之前進(jìn)行，麻醉后生物鐘基因信使RNA表達(dá)均下調(diào)[30，35]。以上研究表明，麻醉藥(如七氟醚和異氟醚)可短時間抑制生物鐘基因的表達(dá)，并可能導(dǎo)致每個基因表達(dá)的相位延遲。

麻醉暴露對PER2表達(dá)的影響并不只發(fā)生于PER2表達(dá)的上升階段。離體實(shí)驗(yàn)表明，七氟醚對視交叉上核有直接抑制作用，這種抑制可導(dǎo)致PER2表達(dá)的相位延遲，但七氟醚對外周器官沒有這種作用，其抑制作用可能由神經(jīng)元特異性細(xì)胞機(jī)制或神經(jīng)元間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)介導(dǎo)[29]。經(jīng)七氟醚暴露的小鼠視交叉上核PER2啟動子近端區(qū)域組蛋白4(一種與活性基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的表觀遺傳修飾)乙?；斤@著降低，導(dǎo)致PER2的表達(dá)受到抑制[37]。

3.2麻醉藥通過促進(jìn)BMAL1蛋白體降解發(fā)揮作用 Bellet等[41]發(fā)現(xiàn)，在體外阻止CLK：BMAL1復(fù)合物與PER1啟動子結(jié)合可抑制PER1表達(dá)。CLK具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，可乙?；M蛋白3和組蛋白4，同時防止CLK：BMAL1與PER1啟動子結(jié)合，從而導(dǎo)致啟動子區(qū)域乙酰化組蛋白水平降低，而氯胺酮和七氟醚均可抑制CLK：BMAL1啟動子與PER結(jié)合，減少PER1和PER2的表達(dá)，因此氯胺酮介導(dǎo)的PER1轉(zhuǎn)錄抑制可能與七氟醚介導(dǎo)的PER2轉(zhuǎn)錄抑制機(jī)制相似[11]。

此外，通過抑制GSK-3β也可消除氯胺酮對PER1表達(dá)的抑制作用[41]。GSK-3β可直接使BMAL1磷酸化并靶向蛋白酶體降解，氯胺酮可促進(jìn)BMAL1降解，而BMAL1水平降低可能是導(dǎo)致PER1啟動子與CLK：BMAL1結(jié)合降低的原因[42]。此外，異氟醚或短期七氟醚暴露也可導(dǎo)致GSK-3β激活[43-44]，而丙泊酚、戊巴比妥或長期暴露于七氟醚均可抑制GSK-3β激活[43，45-46]。與丙泊酚和戊巴比妥不同，氯胺酮、異氟醚和七氟醚是NMDA受體拮抗劑，NMDA受體拮抗劑可激活GSK-3β[6]。因此推測，作為NMDA受體拮抗劑的麻醉藥可通過激活GSK-3β促進(jìn)BMAL1蛋白體降解。

若麻醉后BMAL1水平降低，其他生物鐘成分的信使RNA水平也會改變。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于異氟醚后，小鼠CRY和視交叉上核中的CRY1發(fā)生相位延遲[30，35]。在蜜蜂中并未觀察到麻醉藥物對生物鐘基因表達(dá)的影響[35]，但在異氟醚暴露小鼠的視交叉上核中記錄了生物鐘基因BMAL1表達(dá)的相位前移[30]。雖然生物鐘表達(dá)的晝夜節(jié)律模式在周圍組織中較普遍，但視交叉上核仍是哺乳動物生物鐘表達(dá)的核心組織，生物鐘基因參與調(diào)節(jié)睡眠、壓力及記憶功能，除了具有產(chǎn)生晝夜節(jié)律的功能還有其他與時間無關(guān)的細(xì)胞功能[20]。

4 小 結(jié)

全身麻醉藥可改變分子生物鐘的成分表達(dá)，還可影響轉(zhuǎn)錄，使表達(dá)周期發(fā)生相移。不同種類的全身麻醉鎮(zhèn)靜藥物對生物鐘基因的影響不同。丙泊酚對鼠認(rèn)知功能的影響呈濃度依賴性，并可對全腦生物鐘基因產(chǎn)生影響。吸入麻醉藥七氟醚、異氟醚、地氟醚均會影響大腦的生物鐘基因，且白天麻醉暴露的影響大于夜晚麻醉暴露，如暴露前即有睡眠剝奪，吸入麻醉藥則會進(jìn)一步加重大腦海馬體記憶、學(xué)習(xí)功能的損傷。麻醉暴露后盡快恢復(fù)生物鐘節(jié)律可保護(hù)機(jī)體正常的生理功能。在動物活動期進(jìn)行全身麻醉對晝夜節(jié)律的影響最大。此外，麻醉藥物還可能通過NMDA/GSK-3β途徑，抑制核心生物鐘基因PER的表達(dá)。因此，未來還應(yīng)進(jìn)一步深入研究如何進(jìn)行全身麻醉對生物鐘基因的影響最小，從而利用麻醉藥物治療睡眠障礙或急性睡眠剝奪的患者。