醋酸棉酚通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

楊洋, 楊夢(mèng)婷, 許瀟

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

腦膠質(zhì)瘤生存率極低,目前主要通過(guò)手術(shù)切除和化療等方法治療；由于其侵襲性較高,且易浸潤(rùn)周?chē)X組織,導(dǎo)致臨床治療效果有限[1]。前期研究發(fā)現(xiàn),醋酸棉酚(gossypol acetate,GAA)可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬和凋亡,有較好的抗腫瘤活性[2]。鐵死亡是鐵依賴(lài)性氧化應(yīng)激的細(xì)胞死亡方式,與多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)[3]。基于GAA的化學(xué)本質(zhì),推測(cè)其可能是一種鐵死亡誘導(dǎo)劑,但對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡的影響尚不清楚。因此,本研究擬探討GAA誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人腦膠質(zhì)瘤U87MG、LN229和U251MG細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。GAA購(gòu)自上海生工生物公司；PBS和高糖DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；澳洲胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coming Incorporated公司；CCK-8試劑、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；兔抗人β-微管蛋白、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；羊抗兔二抗購(gòu)自ABclonal公司；微量還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒(微板法)、丙二醛檢測(cè)試劑盒(TBA法)購(gòu)自南京建成生物公司；特異性鐵死亡挽救劑3-氨基-4-環(huán)己基氨基苯甲酸乙酯(Ferrostatin-1)購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 3種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM,于5%CO2、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%～90%時(shí),用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[4],U87MG、LN229和U251MG細(xì)胞的IC50分別為14.50、9.38和10.39 μmol/L。將3種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞各分為2組:0 μmol/L GAA組和10 μmol/L GAA組,分別予以對(duì)應(yīng)濃度的GAA處理72 h；然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

另將3種人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞各分為4組:0 μmol/L GAA+0 μmol/L Ferrostatin-1組、0 μmol/L GAA+1 μmol/L Ferrostatin-1組、10 μmol/L GAA+0 μmol/L Ferrostatin-1組、10 μmol/L GAA+1 μmol/L Ferrostatin-1組,分別予以對(duì)應(yīng)濃度的GAA和Ferrostatin-1處理72 h。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取“1.2.2”分組細(xì)胞接種于96孔板,每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞,加入100 μL培養(yǎng)基,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在1、2、3、4、5、6 d每孔加入10 μL CCK-8,培養(yǎng)2 h；用酶標(biāo)儀(BioTek 800TS)檢測(cè)每孔450 nm波長(zhǎng)處光密度(D)值。細(xì)胞相對(duì)增殖率(%)=(D加藥-D空白)/(D未加藥-D空白)×100%。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 取“1.2.2”分組細(xì)胞接種于6孔板,每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞,加入2 mL培養(yǎng)基,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每隔4 d更換一次培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)14 d后,在倒置普通光學(xué)顯微鏡可以觀(guān)察到明顯的細(xì)胞集落。用4%多聚甲醛固定30 min；結(jié)晶紫染色15 min；PBS洗滌3遍；拍照并計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GPX4mRNA表達(dá) 取“1.2.2”分組細(xì)胞,按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成模板cDNA,進(jìn)行qRT-PCR體系配置及擴(kuò)增。配置10 μL反應(yīng)體系:cDNA溶液0.5 μL,上、下游引物各0.2 μL,2×SYBR Premix ExTaqTM5 μL、無(wú)RNA酶雙蒸水4.1 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。GPX4mRNA引物序列:上游為5′-CCCATTCCTGAACCTTTCAA-3′,下游為5′-TCATGTCCCCAAAGCACG-3′；β-肌動(dòng)蛋白引物序列:上游為5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,下游為5′-CTTTAGCACGCACTGTAATTCCTC-3′。β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt值計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)GPX4蛋白表達(dá) 取“1.2.2”分組細(xì)胞,分別加入適量上樣緩沖液裂解細(xì)胞,100 ℃水浴10 min；4 ℃行12 000×g離心10 min,取上清液。取10 μL樣品行10% SDS-PAGE,恒壓100 V電泳1 h；300 mA恒流濕轉(zhuǎn)150 min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗(GPX4稀釋比為1 ∶1 000,內(nèi)參β-微管蛋白稀釋比為1 ∶2 500)4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次,每次10 min；加入羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶20 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3次,每次10 min；ECL發(fā)光液顯影；利用凝膠成像儀(Minichemi 610)拍照保存并進(jìn)行分析。

1.2.7 GSH和丙二醛含量測(cè)定 取“1.2.2”分組細(xì)胞,分別加入300 μL預(yù)冷PBS,超聲破碎細(xì)胞；4 ℃行3 500 r/min離心10 min,取上清液。根據(jù)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)405 nm和532 nm波長(zhǎng)處D值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)得的蛋白濃度,計(jì)算GSH和丙二醛相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GAA抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

CCK-8結(jié)果顯示,與 0 μmol/L GAA組比較,10 μmol/L GAA組U87MG、LN229和U251MG腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相對(duì)增殖率從第3～6天均顯著降低(P均<0.05),且隨時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞相對(duì)增殖率差值越來(lái)越大,在第6天時(shí)差異最顯著。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與0 μmol/L GAA組比較,10 μmol/L GAA組3種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成數(shù)均明顯減少(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。由此可見(jiàn),GAA可持續(xù)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

A:CCK-8法檢測(cè)3種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相對(duì)增殖率；B:克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力；*:P<0.05,與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)0 μmol/L GAA組相比；#:P<0.05,與0 μmol/L GAA組相比

2.2 GAA可引起腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞鐵死亡

CCK-8結(jié)果顯示,與10 μmol/L GAA+ 0 μmol/L Ferrostatin-1組相比,10 μmol/L GAA+1 μmol/L Ferrostatin-1組3種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞相對(duì)增殖率明顯升高(P均<0.05),且LN229和U251MG細(xì)胞較U87MG細(xì)胞更為明顯。見(jiàn)圖2。由此表明,特異性鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1可部分挽救GAA引起的細(xì)胞死亡,推測(cè)GAA引起的細(xì)胞死亡可能與細(xì)胞鐵死亡相關(guān),且LN229和U251MG細(xì)胞對(duì)其較為敏感。

*:P<0.05,與0 μmol/L Ferrostatin-1+10 μmol/L GAA組比較

2.3 GAA抑制腦膠質(zhì)瘤中GPX4表達(dá)

結(jié)果顯示(圖3),在U87MG、LN229和U251MG 3種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,與0 μmol/L GAA組相比,10 μmol/L GAA組GPX4mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05),其中U251MG細(xì)胞最明顯。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果也顯示,與0 μmol/L GAA 組比較,10 μmol/L GAA組3種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。由此推測(cè),GAA可以通過(guò)抑制GPX4 mRNA和蛋白表達(dá),誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

*:P<0.05,與0 μmol/L GAA組比較

*:P<0.05,與0 μmol/L GAA組比較

2.4 GAA致腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GSH和丙二醛含量改變

結(jié)果如圖5所示,與0 μmol/L GAA組相比,10 μmol/L GAA組LN229和U251MG細(xì)胞中GSH相對(duì)含量明顯減少(P均<0.05),丙二醛含量明顯增加(P均<0.05)；但是,U87MG細(xì)胞中GSH和丙二醛相對(duì)含量無(wú)顯著變化(P>0.05)。由此提示,GAA可能誘導(dǎo)LN229和U251MG細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,而對(duì)U87MG細(xì)胞作用效應(yīng)不明顯。

*:P<0.05,與0 μmol/L GAA組相比

3 討論

GAA是一種多元酚醛類(lèi)化合物,具有多種藥理活性,包括抗生育能力、抗菌、抗腫瘤和抗氧化等[5],是一種新型抗癌藥物[6]。目前已廣泛用于男性避孕和治療子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等婦科疾病[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn),GAA可能通過(guò)抑制GPX4表達(dá),誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,且其生物學(xué)效應(yīng)具有細(xì)胞特異性。細(xì)胞鐵死亡的實(shí)質(zhì)是由于GPX4失能,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物代謝障礙,在鐵離子作用下,造成膜脂上活性氧自由基堆積,使細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9]；常見(jiàn)的檢測(cè)指標(biāo)包括細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)鐵水平、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物以及細(xì)胞內(nèi)與鐵死亡相關(guān)的因子(GPX4, SLC7A11等)。本研究發(fā)現(xiàn),特異性鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1可以顯著降低GAA引起的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡,并且GAA引起細(xì)胞內(nèi)GSH含量下降、丙二醛含量增加,初步證明GAA誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡進(jìn)而發(fā)揮其抗腦膠質(zhì)瘤的作用,理論上進(jìn)一步補(bǔ)充了GAA的藥理作用機(jī)制。

GPX4是鐵死亡的主要靶點(diǎn),其活性抑制可打破氧化平衡,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),從而激發(fā)細(xì)胞鐵死亡[10]。早期研究發(fā)現(xiàn),GAA處理可導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)簇顯著減少,血紅素加氧酶1顯著上調(diào)[11],介導(dǎo)血紅素中鐵離子釋放及積蓄[12]。因此,推測(cè)GAA可能通過(guò)血紅素加氧酶1而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn),GAA明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GPX4 mRNA和蛋白表達(dá),并且致細(xì)胞內(nèi)還原型GSH含量明顯降低,脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛含量顯著增加,由此表明GAA可以通過(guò)抑制GPX4途徑誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

綜上所述,本研究表明GAA通過(guò)抑制GPX4途徑誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,從而抑制腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng),由于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分型不同,其對(duì)藥物的生物學(xué)效應(yīng)具有細(xì)胞特異性。GAA調(diào)控GPX4通路的具體機(jī)制以及對(duì)不同類(lèi)型腦膠質(zhì)瘤的敏感性差異仍有待進(jìn)一步研究。