基于人工智能與全球上市藥物數(shù)據(jù)探尋抗垂體腺瘤藥物及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

呂婷婷, 張子睿, 李尚, 孫嵐, 杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物篩選中心,北京 100050)

垂體腺瘤約占所有顱內(nèi)腫瘤的15%～25%,其發(fā)病率在顱內(nèi)腫瘤中排名第二[1-2]。垂體腺瘤是一種罕見(jiàn)病,缺乏有效的治療藥物,因此目前的一線治療方式是手術(shù)切除。然而高達(dá)20%的垂體腺瘤,尤其是巨腺瘤在術(shù)后會(huì)出現(xiàn)腫瘤快速生長(zhǎng)及腫瘤復(fù)發(fā)[3-4]。更嚴(yán)重的是,0.2%的垂體腺瘤很有可能發(fā)展為垂體癌[5]。Almutairi等[6]報(bào)道,垂體腺瘤的完全切除率僅為66%～78%。高復(fù)發(fā)率和低生存率成為垂體惡性腫瘤治療的主要障礙[5]。

目前已上市的垂體腺瘤治療藥物只能緩解激素異常分泌引起的部分癥狀,而不能抑制腫瘤生長(zhǎng),只能作為手術(shù)的輔助用藥或需長(zhǎng)期服藥,對(duì)患者的生理和心理都造成極大的負(fù)擔(dān)。因此,本研究希望尋找可以在抑制激素分泌的同時(shí)能夠控制腫瘤生長(zhǎng)甚至能殺滅腫瘤的藥物。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子6(signal transducer and activator of transcription 6, STAT6)是轉(zhuǎn)錄因子家族,涉及多種生物過(guò)程,如免疫反應(yīng)、細(xì)胞存活和細(xì)胞生長(zhǎng),且與多種癌癥的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)[7]。STAT6蛋白高度參與了與致癌作用相關(guān)的炎癥過(guò)程的調(diào)節(jié)[8],例如,STAT6調(diào)節(jié)精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受體C型1(Mrc1)、Retnla(Fizz1)和chil3(Ym1)等巨噬細(xì)胞M2樣相關(guān)特定基因的表達(dá)[9-10]。STAT6在前列腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中也起著關(guān)鍵作用[11]。此外,對(duì)68例垂體腺瘤患者的全基因組DNA甲基化和mRNA微陣列分析表明,STAT6的表達(dá)和甲基化與垂體腺瘤的侵襲性相關(guān)[12]。研究提示STAT6可能是垂體腺瘤的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。創(chuàng)新藥物的研發(fā)周期長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)投入大、風(fēng)險(xiǎn)高[13]。藥物重定位是指在現(xiàn)有藥物的原始醫(yī)學(xué)適應(yīng)范圍之外尋找其新用途的過(guò)程,能夠大幅度降低藥物的總體開(kāi)發(fā)成本,縮短研發(fā)周期[14]。因此,本研究聯(lián)合人工智能技術(shù)與基于STAT6靶點(diǎn)的藥物重定位策略,從全球上市藥物數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找垂體腺瘤治療藥物,旨為垂體腺瘤的治療研究提供有力證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

小鼠垂體腺瘤AtT-20細(xì)胞、大鼠垂體腺瘤GH3細(xì)胞均保存在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所篩選中心。AtT-20細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清,1%青鏈霉素(100 kU/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中；GH3細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)15%馬血清,2.5%胎牛血清,1%青鏈霉素(100 kU/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素)的Ham′s F-12K培養(yǎng)基中,均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 主要藥品與試劑

他莫昔芬、吉非替尼購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK8)、Annexin V-EGFP 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司。促腎上腺皮質(zhì)激素(adreno corticotropic hormone, ACTH)和生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)的ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自莫納生物公司, qRT-PCR試劑盒購(gòu)自Vazyme公司。qRT-PCR引物合成自北京奧科鼎盛生物科技有限公司,引物序列如下,β-肌動(dòng)蛋白引物:上游5′-TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTA-3′,下游5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′；STAT6引物:上游5′-TTCTGCCAAAGACCTGTCCAT-3′,下游5′-CTGTCCTCTACCATAGTCACA-3′。RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化-PI3K、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化-AKT、p53蛋白、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)等抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司(英國(guó)Abcam公司)。

1.3 微陣列數(shù)據(jù)的獲取及分析

在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)中通過(guò)檢索“pituitary adenoma”獲取垂體腺瘤相關(guān)基因表達(dá)譜,采用GEO2R在線分析工具對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行分析,篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs),篩選條件為|log2(fold change,FC)|>1,校正后P值<0.05。運(yùn)用R語(yǔ)言實(shí)現(xiàn)垂體腺瘤基因表達(dá)譜的可視化。而后運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(the database for annotation, visualization and integrated discovery)對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體(Genome ontology, GO)及京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信號(hào)通路富集分析,P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(search tool for the retrieval of interacting genes)對(duì)DEGs進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)分析,相互作用得分(interaction score)>0.4為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 Hub基因的篩選與驗(yàn)證

通過(guò)cyto-Hubba插件中的MCC算法篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的前10個(gè)Hub基因,并運(yùn)用qRT-PCR通過(guò)mRNA表達(dá)水平驗(yàn)證Hub基因在巨腺瘤與微腺瘤組織中的差異表達(dá)。垂體腺瘤模型為本課題組前期構(gòu)建,待腫瘤直徑達(dá)3～5 mm后,將模型動(dòng)物隨機(jī)分為巨腺瘤與微腺瘤組。巨腺瘤組灌胃給予0.5% 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),微腺瘤組灌胃給予治療藥物蓓薩羅丁,給藥21 d后獲取瘤組織。

1.5 上市藥物的富集及相互作用驗(yàn)證

1.5.1 基于靶點(diǎn)的藥物重定位 針對(duì)垂體腺瘤靶點(diǎn)的全球上市藥物從Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.Drugbank.ca/)和國(guó)家人口與健康科學(xué)數(shù)據(jù)共享平臺(tái)藥學(xué)數(shù)據(jù)中心的全球上市藥物數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pharmdata. ncmi. cn/globaldrugs/index. asp)中富集。

1.5.2 基于人工智能平臺(tái)反向找靶 通過(guò)Pubchem化合物數(shù)據(jù)庫(kù)下載他莫昔芬(CAS:10540-29-1)的三維結(jié)構(gòu),并上傳至SwissTargetPrediction、TargetNet、PharmMapper、ChEMBL等多個(gè)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)人工智能算法識(shí)別、預(yù)測(cè)可與他莫昔芬結(jié)合的蛋白靶點(diǎn)。

1.5.3 分子對(duì)接驗(yàn)證 將美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的靶向“STAT6”的藥物他莫昔芬通過(guò)CDOCKER的分子對(duì)接分析得到確證。靶點(diǎn)蛋白STAT6的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自PDB數(shù)據(jù)庫(kù),為了保證分子對(duì)接的可靠性,選擇分辨率<2.5 ?且具有配體復(fù)合物的蛋白晶體結(jié)構(gòu)(ID: 3ZEP)建立分子對(duì)接模型。對(duì)接程序使用Discovery Studio 2018(美國(guó)BIOVIA),化合物和靶點(diǎn)蛋白的制備均由小分子配體模塊完成。首先去除PDB結(jié)構(gòu)中的水分子,對(duì)接的活性口袋由原始配體分子進(jìn)行定義。設(shè)置對(duì)接參數(shù)后,將晶體結(jié)構(gòu)中的配體分子抽取出來(lái)并重新對(duì)接至預(yù)先定義好的活性口袋,同時(shí)計(jì)算對(duì)接后的配體分子構(gòu)象與晶體結(jié)構(gòu)中的初始構(gòu)象之間的均方根差值(root-mean square deviation, RMSD),若RMSD值<2.5,則認(rèn)為分子對(duì)接結(jié)果可靠。

1.6 垂體腺瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1 CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AtT-20細(xì)胞、GH3細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種至96孔板,37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后,用完全培養(yǎng)基稀釋他莫昔芬母液至1、4、8、12、15、20和30 μmol/L并分別加至各孔,并設(shè)置0.1%的二甲基亞砜為對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將AtT-20細(xì)胞、GH3細(xì)胞在含有0、5、10和15 μmol/L他莫昔芬的6孔板中培養(yǎng)24 h后,與Annexin V-EGFP和PI染液在室溫下孵育30 min。然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6.3 ELISA檢測(cè)GH和ACTH的分泌 GH3和AtT-20細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中,并與不同濃度(1、5、10 μmol/L)的他莫昔芬或10 μmol/L吉非替尼共同培養(yǎng)24 h。使用ELISA特定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中GH和ACTH的水平。

1.6.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白 收集并提取吉非替尼或不同濃度他莫昔芬(1、5、10 μmol/L)處理24 h后的AtT-20細(xì)胞、GH3細(xì)胞中的蛋白,加入上樣緩沖液后,100 ℃處理10 min進(jìn)行變性。采用SDS-PAGE電泳,電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,室溫封閉2 h。分別加入特異性的一抗(PI3K 1 ∶1 000,p-PI3K 1 ∶500,AKT 1 ∶1 000,p-AKT 1 ∶500,p53 1 ∶1 000,Bax 1 ∶1 000,Bcl-2 1 ∶1 000,GAPDH 1 ∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜后,TBST洗膜4～5次,再加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h,洗膜。ECL顯色,顯影,定量,使用Image J軟件分析蛋白條帶,以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 垂體腺瘤基因表達(dá)譜分析

檢索得到垂體腺瘤數(shù)據(jù)集GSE 93825(GPL18281, Illumina HumanHT-12 WG-DASL V4.0 R2 expression beadchip),該數(shù)據(jù)集中共收集11例巨腺瘤患者和29例微腺瘤患者的新鮮神經(jīng)內(nèi)分泌組織標(biāo)本。通過(guò)GEO2R在線工具篩選得到96個(gè)DEGs,其中,表達(dá)上調(diào)的基因25個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因71個(gè)。垂體腺瘤數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)火山圖、熱圖如圖1所示。DEGs的GO功能和KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果見(jiàn)圖2,其主要富集于調(diào)節(jié)酶催化活性、調(diào)節(jié)磷酸化和磷酸鹽代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生物合成和大分子代謝作用等相關(guān)的生物過(guò)程。此外,DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3所示。

圖1 巨腺瘤和微腺瘤差異表達(dá)基因的火山圖(A)和熱圖(B)

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析

圖3 差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 STAT6是垂體腺瘤的潛在治療靶點(diǎn)

基于cyto-Hubba的MCC算法篩選出前10個(gè)Hub基因LEP、PTGS2、STAT6、CXCL12、ITPKB、CCR7、LPAR2、CXCR5、ADCY3和TAS2R14(表1),通過(guò)文獻(xiàn)檢索選擇其中已報(bào)道的6個(gè)癌癥相關(guān)基因并根據(jù)校正P值和log2(FC)進(jìn)行排序(表2)。最終選擇差異倍數(shù)最大的STAT6基因進(jìn)行進(jìn)一步的mRNA表達(dá)水平量化驗(yàn)證。結(jié)果表明(圖4),STAT6的表達(dá)水平與垂體腺瘤的大小相關(guān),其可能成為垂體腺瘤的潛在治療靶點(diǎn)。

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)中的前10位Hub基因

表2 基于校正P值和 log2(FC)值的基因排名

a: P<0.01,與巨腺瘤組比較

2.3 他莫昔芬是垂體腺瘤治療的候選藥物

將關(guān)鍵蛋白“STAT6”通過(guò)全球上市藥物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行藥物富集,如表3所示,他莫昔芬是STAT6的抑制劑,杜匹魯單抗是STAT6的拮抗劑。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),他莫昔芬目前用于乳腺癌、卵巢癌、胰腺導(dǎo)管腺癌等多種激素依賴性癌癥的治療,而杜匹魯單抗目前僅用于治療中重度特應(yīng)性皮炎。因此,選取他莫昔芬作為候選藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表3 批準(zhǔn)的靶向STAT6的化合物

2.4 他莫昔芬靶向STAT6的驗(yàn)證

分子對(duì)接預(yù)測(cè)相互作用:首先,計(jì)算對(duì)接后配體—他莫昔芬與晶體中的原配體的空間坐標(biāo)的RMSD值為0.319 9,小于2.5,表明此次分子對(duì)接計(jì)算結(jié)果可靠。其次,用CDOCKER精準(zhǔn)分子對(duì)接方法驗(yàn)證他莫昔芬與STAT6靶點(diǎn)蛋白的相互作用,CDOCKER energy指示配體與靶點(diǎn)蛋白間的結(jié)合能力,其值越高提示結(jié)合能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示,他莫昔芬的CDOCKER energy值為14.392 1,原始配體的CDOCKER energy值為6.938 7,說(shuō)明他莫昔芬與STAT6的結(jié)合能力超過(guò)該靶點(diǎn)蛋白的原配體。他莫昔芬可以通過(guò)氫鍵、Pi鍵、離子間的引力等多種方式與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合(圖5),證明了他莫昔芬與STAT6靶點(diǎn)蛋白相互作用預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

A:他莫昔芬與STAT6相互結(jié)合；B:他莫昔芬與STAT6的相互作用方式

人工智能反向找靶:通過(guò)人工智能平臺(tái)對(duì)409個(gè)蛋白與他莫昔芬的結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)評(píng)分達(dá)到99.9分以上的靶點(diǎn)蛋白有19個(gè)(表4),其中STAT6排在第12位。因此,初步認(rèn)為他莫昔芬通過(guò)靶向STAT6而發(fā)揮垂體腺瘤治療作用。

表4 預(yù)測(cè)的與他莫昔芬相互作用的前19個(gè)蛋白

2.5 他莫昔芬對(duì)垂體腺瘤細(xì)胞的作用

2.5.1 他莫昔芬抑制垂體腺瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡 CCK8檢測(cè)結(jié)果表明,他莫昔芬在培養(yǎng)24 h后能夠抑制垂體腺瘤細(xì)胞GH3和AtT-20的增殖(圖6)。流式分析結(jié)果表明,他莫昔芬劑量依賴性增加了GH3和AtT-20細(xì)胞的凋亡率(圖7)。

圖6 CCK8法測(cè)定他莫昔芬處理后AtT-20和GH3細(xì)胞的存活率

圖7 流式細(xì)胞術(shù)分析他莫昔芬處理后GH3和AtT-20細(xì)胞的凋亡率

2.5.2 他莫昔芬抑制垂體腺瘤細(xì)胞分泌ACTH和GH ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,他莫昔芬處理后顯著降低了分別由垂體腺瘤細(xì)胞GH3和AtT-20分泌的GH和ACTH的水平(圖8),但吉非替尼治療并未顯著影響激素分泌。

a: P<0.05, b:P<0.001,與對(duì)照組比較

2.5.3 他莫昔芬對(duì)垂體腺瘤細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白的影響 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,與未處理的對(duì)照組相比,他莫昔芬處理垂體腺瘤

GH3和AtT-20細(xì)胞24 h后,可以下調(diào)p-PI3K、p-AKT的活性,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),并上調(diào)促凋亡蛋白p53和Bax的表達(dá)(圖9)。而吉非替尼能下調(diào)AtT-20細(xì)胞中p-PI3K的活性,增加Bax蛋白的表達(dá),并能降低GH3和AtT-20細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)；對(duì)兩種細(xì)胞中其他凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。

a:P<0.05, b:P<0.01, c:P<0.001,與對(duì)照組比較

3 討論

雖然垂體腺瘤被定義為罕見(jiàn)病,但在中國(guó)人口基數(shù)龐大的情況下,我國(guó)每年確診的垂體腺瘤患者數(shù)量實(shí)際上并不少。然而,隨著確診人數(shù)的增多,不能接受手術(shù)或手術(shù)失敗的病例也逐漸增多。研究人員希望藥物不僅能起輔助作用,也能夠“獨(dú)當(dāng)一面”成為一線治療方式,讓患者擺脫手術(shù)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)和精神壓力,同時(shí)也減輕垂體腺瘤對(duì)患者、家庭以及社會(huì)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了節(jié)約藥物研發(fā)的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本,本研究選擇通過(guò)藥物重定位策略來(lái)尋找已上市藥物中有垂體腺瘤治療潛力的藥物,并對(duì)其進(jìn)行藥效驗(yàn)證以及機(jī)制的初步探索。

本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)工具分析垂體腺瘤巨腺瘤與微腺瘤之間的差異基因表達(dá)譜,共篩選得到96個(gè)DEGs,包括25個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因和71個(gè)下調(diào)基因。然后從DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出得分最高的前10個(gè)Hub基因,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研以及l(fā)og2(FC)值,最終選擇表達(dá)倍數(shù)變化最大的STAT6基因進(jìn)行mRNA水平驗(yàn)證。qRT-PCR結(jié)果表明,STAT6的mRNA表達(dá)水平與垂體腺瘤的大小相關(guān),其可能成為診斷和治療垂體腺瘤的潛在新靶點(diǎn)。

a:P<0.05, b:P<0.01, 與對(duì)照組比較

在藥物重定位中,基于網(wǎng)絡(luò)的重定位是最常用的方法之一,常用的網(wǎng)絡(luò)分為DTI (drug target interaction) 網(wǎng)絡(luò)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、代謝網(wǎng)絡(luò)等[15],其中的集合包括PPI、藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)、藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)、疾病-基因網(wǎng)絡(luò)、疾病-蛋白質(zhì)-基因網(wǎng)絡(luò)等[16]。本研究通過(guò)全球上市藥物數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)垂體腺瘤靶點(diǎn)“STAT6”進(jìn)行藥物富集得到垂體腺瘤的潛在治療藥物他莫昔芬。他莫昔芬由英國(guó)的ICI制藥公司研制,在1977年由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于晚期乳腺癌的治療。目前他莫昔芬已用于膠質(zhì)瘤、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥的臨床試驗(yàn)[17]。他莫昔芬不僅抑制細(xì)胞增殖,還能促進(jìn)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和抗血管生成[18]。值得注意的是,他莫昔芬也是一種具有免疫刺激特性的抗增殖藥物。例如,他莫昔芬通過(guò)阻斷M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化和增強(qiáng)免疫功能來(lái)抑制雌激素受體缺陷型乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移[19]。研究還發(fā)現(xiàn)他莫昔芬減少了胰腺導(dǎo)管腺癌組織的纖維化,其作為炎癥和免疫反應(yīng)的潛在調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化[20]。近日有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道他莫昔芬能夠抑制GH3細(xì)胞的增殖,但其作用靶點(diǎn)是雌激素受體[21]。然而本研究的分析結(jié)果表明STAT6可能是調(diào)控垂體腺瘤生長(zhǎng)的潛在靶點(diǎn),為了證實(shí)STAT6是他莫昔芬的作用靶點(diǎn)或靶點(diǎn)之一,本研究對(duì)STAT6對(duì)他莫昔芬功能的介導(dǎo)作用進(jìn)行了驗(yàn)證。

首先利用分子對(duì)接方法,驗(yàn)證他莫昔芬與靶點(diǎn)蛋白STAT6的結(jié)合情況,從CDOCKER對(duì)接的結(jié)果來(lái)看,STAT6可與他莫昔芬結(jié)合,且STAT6蛋白與他莫昔芬結(jié)合的得分值超過(guò)了蛋白的原配體。然后,基于包含409個(gè)蛋白的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)人工智能算法將可與他莫昔芬結(jié)合的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行排序,發(fā)現(xiàn)STAT6是他莫昔芬的高評(píng)分結(jié)合位點(diǎn)。最后體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,他莫昔芬能夠抑制垂體腺瘤細(xì)胞的增殖和激素分泌,蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示他莫昔芬可抑制垂體腺瘤細(xì)胞中PI3K-AKT的活性,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),并上調(diào)促凋亡蛋白p53和Bax的表達(dá),誘導(dǎo)垂體腺瘤細(xì)胞凋亡。PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞中廣泛存在,并在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等過(guò)程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn),在許多類型的癌癥中PI3K/AKT信號(hào)通路異常激活[22-23]。AKT是PI3K下游的關(guān)鍵信號(hào)分子,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,AKT的磷酸化可以促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移,并調(diào)節(jié)其下游靶基因p21、p27、Bax和Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[22,24]。腫瘤抑制因子p53是一種轉(zhuǎn)錄因子,AKT也可以磷酸化p53結(jié)合蛋白鼠雙微粒體2(murine double minute 2,MDM2),從而影響p53的活性[24]。

綜上所述,本研究通過(guò)人工智能技術(shù)和藥物重定位在全球上市藥物中尋找有垂體腺瘤治療潛力的候選藥物,并驗(yàn)證了他莫昔芬在體外對(duì)垂體腺瘤細(xì)胞增殖和激素分泌有抑制作用,為垂體腺瘤的新藥研發(fā)與臨床用藥提供了新思路,也為其他上市藥物的重定位提供借鑒。