香辛料中去甲烏藥堿含量分析

鄭小敏，尤曉惠，王 瑋，王美鋒，向鵬宇

（重慶市涪陵食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 408000）

去甲烏藥堿（Higenamine，HG）屬于芐基異喹啉類生物堿，是一種β受體激動(dòng)劑類藥物，它能夠增加動(dòng)物心肌收縮力，改善收縮和舒張功能，并具有興奮心肌細(xì)胞、刺激β-腎上腺素受體、舒張血管的作用，因此在臨床上可被用作強(qiáng)心劑[1-4]。自2017年起，去甲烏藥堿就被國(guó)際反興奮劑組織（World Anti-Doping Agency，WADA）列為S3類（β-2激動(dòng)劑類）違禁物質(zhì)[5]。去甲烏藥堿主要存在于細(xì)辛、黃柏、地膚子[6]、花椒、胡椒、桂皮[7-8]等天然植物中，這些植物正是中藥材或日常食用香辛料中的組成部分。因此，運(yùn)動(dòng)員極有可能在日常飲食中攝入去甲烏藥堿而造成興奮劑檢測(cè)陽(yáng)性檢出。本文通過(guò)各大香辛料批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、中藥材市場(chǎng)、商超及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行采樣，采用液色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行不同品種的香辛料中去甲烏藥堿的含量分析[8]。

1 材料與方法

1.1 采樣

以《天然香辛料 分類》（GB/T 21725—2017）為依據(jù)制定采樣方案，對(duì)重慶市各大香辛料批發(fā)市場(chǎng)、中藥材批發(fā)市場(chǎng)及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行采樣，共采集花椒、辣椒、白胡椒、桂皮、八角、孜然、多香果、草果、高良姜、月桂葉、丁香、蓽撥、三奈、香茅草、茴香、芫荽、甘草、砂仁、姜黃、白豆蔻、肉豆蔻、香豆蔻、百里香、芝麻、大蒜、白歐芥、調(diào)料九里香、香椿、芒果、楊桃、細(xì)葉芹、葫蘆巴、留蘭香、迷迭香、香莢蘭、羅晃子、歐芹、菖蒲、甘牛至、石榴、薄荷、辣根、洋蔥、姜、木姜子、小蔥、大蔥、甜羅勒、蒔蘿籽、葛縷子、小豆蔻、芹菜籽、龍蒿、牛至、藏紅花及大清桂56種香辛料。進(jìn)行樣本分類，每個(gè)品種采樣量不少于200 g，每種樣品不少于3批次；并對(duì)含有去甲烏藥堿香辛料進(jìn)行大量采集，覆蓋主要產(chǎn)地。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1290-AB 4500 高效液相色譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB 公司）；XPE204電子分析天平（梅特勒-托利多），VORTEX3渦旋儀（德國(guó)IKA公司），SR-2DS強(qiáng)力振蕩器（日本TAITEC公司），Multifuge XIR冷凍離心機(jī)（德國(guó)ThermoFisher公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó) Millipore 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

準(zhǔn)確稱取去甲烏藥堿對(duì)照品10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；用甲醇逐步稀釋成濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液；于-18 ℃冷凍保存。

稱取去甲烏藥堿-D4對(duì)照品1 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；精密吸取甲烏藥堿-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成1 μg/mL去甲烏藥堿-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液；于-18 ℃冷凍保存。

1.3.2 樣品前處理

本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。樣品粉碎均勻，過(guò)60目篩，稱取試樣1.0 g（精確到0.001 g）于50 mL離心管中，加入去甲烏藥堿-D4標(biāo)準(zhǔn)使用 液 100 μL（1 μg/mL）， 加 入 19 mL 0.5% 甲 酸 乙醇/水（80+20）溶液，振蕩30 min，8 000 r/min離心5 min；提取液轉(zhuǎn)移至20 mL比色管中，用5%氨水調(diào)節(jié)pH值至8.5±0.5，加水定容至20 mL，混勻。

PBA固相萃取小柱依次用3 mL乙腈、3 mL 0.5%甲酸水、3 mL 0.2 mol/L乙酸銨（pH為8.5）活化。取5 mL上述提取溶液，上柱，依次用3 mL 0.2mol/L乙酸銨（pH為8.5）淋洗、3 mL水淋洗；2 mL 0.5%甲酸甲醇洗脫，抽干小柱，收集洗脫液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 0.5%甲酸水復(fù)溶，0.22 μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法經(jīng)Waters CSH C18柱（100 mm×2.0 mm，1.7 μm）分離，電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

（1）液相條件。柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；霧化氣壓力（GS1）：55 psi；輔助氣壓力（GS2）：55 psi；氣簾氣壓力（CUR）：35 psi；碰撞氣體（CAD）：Medium；離子源溫度（TEM）：550 ℃。

去甲烏藥堿定量離子對(duì)：272.0/107.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：26 V；去甲烏藥堿定性離子對(duì)：272.0/255.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：20 V；去甲烏藥堿-D4離子對(duì)：276.0/259.0，去簇電壓：40 V，碰撞能量：21 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限和定量限的測(cè)定

將去甲烏藥堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至一定濃度，再分別取適量于10 mL容量瓶中，分別加入適量去甲烏藥堿-D4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，甲醇稀釋成一定梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.3儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以去甲烏藥堿的濃度與去甲烏藥堿-D4濃度比值作為橫坐標(biāo)，以去甲烏藥堿定量離子峰面積與去甲烏藥堿-D4峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，去甲烏藥堿濃度在0.25～100.00 ng/mL關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r大于0.999。當(dāng)S/N≥3作為方法的檢出限；S/N≥10作為方法的定量限。各品種方法檢出限為1 μg/kg，定量限為 3 μg/kg。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)香辛料的使用部位不同，將香辛料分為葉類、果實(shí)類、根莖類及花類等，選取甘草、甘牛至、茴香、桂皮、芝麻、丁香及芹菜籽等7種有代表性的不同類型樣品進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，并分別添加3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)置6個(gè)平行樣，以考察方法的精密度和回收率，以試劑溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。如表2所示，平均回收率范圍為92.8%～108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.9%～5.6%。

表2 8個(gè)不同品種的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.3 檢測(cè)結(jié)果

由檢測(cè)結(jié)果可知，花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子等6種香辛料中檢出了去甲烏藥堿，其中，木姜子和月桂葉中去甲烏藥堿含量偏高，見表3。

表3 6種香辛料中去甲烏藥堿含量范圍（單位：μg/kg）

2.4 花椒中去甲烏藥堿的含量分析

本研究中檢出去甲烏藥堿的其他5個(gè)品種產(chǎn)地比較集中，且產(chǎn)量少；而花椒是生活中最常見的食物，是我國(guó)主要香辛料之一，也是我國(guó)優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)產(chǎn)品，產(chǎn)量大，使用范圍廣，在我國(guó)大部分地區(qū)都有種植，因此本研究對(duì)陜西、四川、重慶、云南和甘肅產(chǎn)地花椒進(jìn)行采樣，共采集樣品52批次，分析結(jié)果見表4。

表4 同一品種不同產(chǎn)地香辛料中去甲烏藥堿含量范圍（單位：μg/kg）

各產(chǎn)區(qū)主產(chǎn)品種分別是四川（紅花椒）、陜西（紅花椒）、重慶（青花椒）、云南（青花椒）。通過(guò)Excel分別對(duì)去甲烏藥堿含量進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明，青花椒和紅花椒中去甲烏藥堿的含量具有顯著性差異，紅花椒中去甲烏藥堿的含量明顯高于青花椒。

3 討論

對(duì)56種香辛料中去甲烏藥堿進(jìn)行篩查，其花椒、桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子6種香辛料中檢出去甲烏藥堿，月桂葉和木姜子中含量較高。其中桂皮、蓽撥、月桂葉、白胡椒及木姜子在我國(guó)的產(chǎn)地相對(duì)比較集中。而花椒作為主要的香辛料之一，在我國(guó)被廣泛種植，各產(chǎn)區(qū)主產(chǎn)品種又各不相同，通過(guò)采樣分析，紅花椒的含量明顯高于青花椒。

香辛料中去甲烏藥堿的篩查和含量測(cè)定，對(duì)56種香辛料中去甲烏藥堿含量有了一個(gè)初步了解，本次分析主要針對(duì)重慶市各大香辛料批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、中藥材市場(chǎng)、商超及網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行采樣，對(duì)香辛料進(jìn)行摸底，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量分析測(cè)定。其中，6種常用香辛料中檢出去甲烏藥堿，其余均未檢出，提示運(yùn)動(dòng)員和心血管患者需特別慎用。