梁美丹,肖 劍,勞嘉倩,林秀敏,陳 楷,蔣佳希
(廣州市食品檢驗(yàn)所,廣東廣州 511400)
植物蛋白飲料是以植物果仁、果肉及大豆為原料(如花生、杏仁、核桃仁和椰子等),經(jīng)加工、調(diào)配后,再經(jīng)高壓殺菌和無(wú)菌包裝制得的乳狀飲料,其不含或含較少的膽固醇,富含蛋白質(zhì)、氨基酸及適量的不飽和脂肪酸,營(yíng)養(yǎng)成分較全面,深受消費(fèi)者歡迎,已成為飲料市場(chǎng)上不可或缺的產(chǎn)品[1]。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2007年以來(lái)各飲料子行業(yè)增速最快的是植物蛋白飲料,2016年植物蛋白飲料行業(yè)收入為1 217.2億元,2020年植物蛋白飲料市場(chǎng)高速發(fā)展,增速高達(dá)800%,購(gòu)買人數(shù)上升900%,銷量增速遠(yuǎn)超其他飲料品類,在飲料市場(chǎng)中成長(zhǎng)貢獻(xiàn)15.5%,排名第3。隨著植物蛋白質(zhì)飲料原料價(jià)格的上漲,部分生產(chǎn)企業(yè)為降低生產(chǎn)成本,在飲料中摻入廉價(jià)的植物蛋白粉,或摻入成本低廉的非產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的植物原料,如央視在2018年“3·15”晚會(huì)中,曝光了多家企業(yè)在生產(chǎn)核桃露時(shí)未使用核桃漿,而使用成本遠(yuǎn)低于核桃漿的花生醬或核桃香精代替,上述行為嚴(yán)重?cái)_亂社會(huì)市場(chǎng)秩序,損害消費(fèi)者的合法權(quán)益。目前,植物蛋白飲料市場(chǎng)摻雜使假情況比較嚴(yán)重,群眾關(guān)注度高,有研究表明市場(chǎng)上35%蛋白質(zhì)飲料標(biāo)識(shí)的植物源性成分未檢出,存在與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)成分及含量嚴(yán)重不符的情況[2]。因此,對(duì)于植物蛋白飲料摻假鑒別技術(shù)研究有重要的實(shí)際意義。
目前,植物蛋白飲料檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)落后及不全面,采用定性檢測(cè)的方法無(wú)法對(duì)植物蛋白飲料的成分進(jìn)行高通量快速鑒定及品質(zhì)的準(zhǔn)確定量,監(jiān)管部門不能準(zhǔn)確、快速認(rèn)定產(chǎn)品是否具有摻假行為,給人們的生活質(zhì)量和安全帶來(lái)不穩(wěn)定的因素。目前,針對(duì)植物蛋白飲料中源性成分鑒偽的研究相對(duì)較少,主要集中于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、色譜和質(zhì)譜技術(shù)、電泳技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)。
賴心田等[3]用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)核桃制品中核桃含量的測(cè)定。方娟[4]建立了ELISA定量檢測(cè)核桃蛋白的方法并成功組裝了一款檢測(cè)試劑盒?;诳乖贵w免疫原理的ELISA,由于過(guò)敏原蛋白之間存在一定程度的同源性而極易出現(xiàn)交叉反應(yīng),加熱等加工工序會(huì)對(duì)植物蛋白飲料蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成很大的影響,從而導(dǎo)致無(wú)法被抗體正確識(shí)別而出現(xiàn)假陰性,檢測(cè)結(jié)果易受植物蛋白飲料工業(yè)化加工流程的影響,同時(shí)存在操作較為煩瑣、檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn),不適合應(yīng)用于大批量樣品的檢測(cè)。
張敬敬[5]用氣相色譜法建立了核桃乳脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,對(duì)核桃乳質(zhì)量進(jìn)行控制,并對(duì)核桃乳進(jìn)行相似度分析,建立核桃乳摻假模型,定性鑒別核桃乳摻假。張淑霞等[6]采用高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生源性成分,并初步建立了平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Parallel Reaction Monitoring,PRM)檢測(cè)核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生特征肽段的方法。以蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)為檢測(cè)對(duì)象的色譜和質(zhì)譜技術(shù)雖然可在一定程度上檢測(cè)目標(biāo)源性成分,但其檢測(cè)結(jié)果易受植物蛋白飲料工業(yè)化加工流程的影響,同時(shí)存在操作較為煩瑣、儀器設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。
王斌等[7]利用高效毛細(xì)管電泳技術(shù)獲得杏仁和巴旦木特征遷移峰,以特征峰相對(duì)遷移時(shí)間結(jié)合特征峰相對(duì)強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)了杏仁露中巴旦木摻假的半定量分析,半定量限為10%。孫克江等[8]建立十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定核桃、杏仁、花生和大豆中的蛋白成分,通過(guò)分析不同物種的蛋白質(zhì),確定核桃、花生、黃豆和杏仁的特征條帶,從而達(dá)到對(duì)食品中植物源性成分的鑒定。由于上述方法是以蛋白質(zhì)為檢測(cè)對(duì)象,檢測(cè)結(jié)果易受到蛋白飲料深度加工的影響。
植物蛋白飲料實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)常要進(jìn)行一系列的高溫處理,會(huì)破壞蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的結(jié)構(gòu),而經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間高溫高壓的處理后,植物DNA仍能保持完整。因此,在植物蛋白飲料源性成分檢測(cè)中,基因水平檢測(cè)方法較蛋白及脂質(zhì)檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)。目前,應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)等。常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好,DNA條形碼技術(shù)成本低、快速可靠,均被廣泛應(yīng)用于食品中的定性檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度低、檢測(cè)成本低及所需的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),適用于致病菌、動(dòng)植物源性成分等領(lǐng)域的定性分析。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)不僅可用于定性檢測(cè),還可測(cè)定循環(huán)閾值和初始DNA模板濃度進(jìn)行相對(duì)定量。這些技術(shù)各有其優(yōu)點(diǎn),但卻無(wú)法滿足精準(zhǔn)定量分析的需求,尤其是對(duì)于經(jīng)深加工、目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)豐度較低的植物蛋白飲料類終端類產(chǎn)品。數(shù)字PCR技術(shù)和微流控芯片技術(shù)是近年來(lái)應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的新技術(shù),可以彌補(bǔ)或解決以上技術(shù)問題。
1.4.1 微滴數(shù)字PCR
近年來(lái),微滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(Dropletdigital Polymerase Chain Reaction,ddPCR)是繼常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR之后的第3代PCR技術(shù),是基于單分子目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增的絕對(duì)定量技術(shù),可以直接計(jì)數(shù)樣品中靶分子和參考DNA分子的絕對(duì)數(shù)量,不依賴于檢測(cè)效率或外部校準(zhǔn)設(shè)備。該技術(shù)具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高、無(wú)需任何校準(zhǔn)物質(zhì)以及可對(duì)樣品核酸進(jìn)行絕對(duì)定量等優(yōu)勢(shì),目前已在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、微生物豐度檢測(cè)、病毒載量的絕對(duì)定量和食品中內(nèi)源性成分鑒定等方面得到較廣泛的研究與應(yīng)用[9-12]。ddPCR技術(shù)在植物源性食品真?zhèn)舞b別領(lǐng)域研究相對(duì)較少,郭楠楠等[13]建立了杏仁露中杏仁、花生源性成分ddPCR定量檢測(cè)體系,并對(duì)12個(gè)市售的杏仁露進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在著不同程度的摻假現(xiàn)象。目前,ddPCR技術(shù)在市場(chǎng)上并未形成完善的檢測(cè)體系,在動(dòng)植物源性成分鑒定方面的應(yīng)用相對(duì)較少。
1.4.2 微流控芯片
微流控芯片技術(shù)源于20世紀(jì)90年代MANZ等[14]提出的微型全分析系統(tǒng)的概念,主要是指采用微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)在方寸大小的芯片上加工微米至納米尺度的微通道網(wǎng)絡(luò),通過(guò)微尺度下流體的精確操控,在芯片上實(shí)現(xiàn)樣品引入、前處理、混合、化學(xué)反應(yīng)、分離和檢測(cè)等功能,其系統(tǒng)具有微量、高效、成本低、微型化、集成化、高通量和自動(dòng)化等特點(diǎn)。隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的檢測(cè)手段能夠與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合,尤其是在生命科學(xué)領(lǐng)域,微流控芯片技術(shù)在核酸檢測(cè)方面得到了廣泛應(yīng)用。以微流控環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)技術(shù)及微流控液滴技術(shù)為代表的微流控PCR技術(shù)在微生物分離篩查、致病菌檢測(cè)、病毒檢測(cè)等方面的研究是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)之一,但在動(dòng)植物成分鑒定、蛋白質(zhì)飲料源性成分鑒定方面的研究較少[15-16]。微流控技術(shù)用于源性成分檢測(cè)將有助于實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中的高通量操作,進(jìn)一步提高與分子生物學(xué)交叉的多學(xué)科研究成果用于食品檢測(cè)中的應(yīng)用水平。
鑒于目前植物蛋白飲料摻雜使假檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀,急需建立植物蛋白飲料高通量定性檢測(cè)特征性植物源性成分及絕對(duì)定量一體化的檢測(cè)體系,實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)飲料目標(biāo)成分高通量的快速檢測(cè),對(duì)產(chǎn)品標(biāo)明的成分含量實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的檢測(cè)。依據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)特點(diǎn)和檢測(cè)需求,可重點(diǎn)考慮微滴數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)、微流控芯片技術(shù)的研究應(yīng)用,通過(guò)這兩種技術(shù)手段構(gòu)建一套成熟的特異性強(qiáng)、靈敏度高、絕對(duì)定量的蛋白飲料中植物源性成分高通量檢測(cè)體系,為植物蛋白飲料行業(yè)中摻雜使假等問題提供有效的鑒別手段,為國(guó)家食品安全監(jiān)管監(jiān)測(cè)及突發(fā)事件應(yīng)急提供精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)支撐。