油茶籽粉中茶皂素高效液相色譜測定方法研究

江勛 楊學(xué)軍 鄧小紅 周峰 楊婷

【摘要】目的：建立測定油茶籽粉中茶皂素的高效液相色譜法。方法：色譜柱為Shimadzu Shim-packVP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-水（B）等度洗脫（35：65，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為265 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL，理論板數(shù)按茶皂素3個色譜峰計均不低于3000。結(jié)果：茶皂素質(zhì)量濃度在390.0～3900.4 μg/mL（r=1.0000）范圍內(nèi)與其3個色譜峰面積和線性關(guān)系良好，平均回收率為100.57%，RSD為0.73%（n=9），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗結(jié)果的RSD分別為0.05%、0.40%、0.33%。結(jié)論：所建立的方法專屬性強、準(zhǔn)確度高，可用于油茶籽粉中茶皂素的含量測定。市售不同產(chǎn)地、不同廠家的油茶籽粉中茶皂素含量差異較大，可能導(dǎo)致其洗滌效果差異顯著。

【關(guān)鍵詞】油茶籽粉;茶皂素;高效液相色譜;含量測定

【DOI 編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2022.02.010

Determination of Tea Saponin in Camellia Oleifera Seed Powder by HPLC

JIANG Xun，YANG Xue-Jun，DENG Xiao-hong，ZHOUFeng，YANG Ting

（Inspection and Testing Center，Hengyang Market Supervision，Hengyang China 421001）

Abstract：Objective：To establish a high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of tea saponin in Camellia oleifera seed powder. Methods：The chromatographic column was Shimadzu Shim-pack VP-ODS C18 column（250 mmx4.6 mm，5μm）. The mobile phase was methanol （A）- water （B）isocratic elution （35：65，V/V），the flow rate was 1.0 ml/ min，the detection wavelength was 265 nm，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 10 μL. The number of theoretical plates shall not be less than 3000 according to the three chromatographic peaks of tea saponin. Results：There was a good linear relationship between the mass concentration of tea saponin and its three chromatographic peak areas in the range of 390.0～3900.4 μg/ mL（r=1.0000）. The average recovery was 100.57%，RSD was 0.73%（n=9），and the RSDs of precision，stability and repeatability were 0.05%，0.40% and 0.33% respectively. Conclusion：The established method has strong specificity and high accuracy，and can be used for the determination of tea saponin in Camellia oleifera seed powder. The content of tea saponin in Camellia oleifera seed powder sold in different places and manufacturers may lead to significant differences in washing effect.

Key words：Camellia oleifera seed powder;tea saponin;HPLC;content determination

市場銷售的油茶籽粉產(chǎn)品也主要作為一種天然清潔去污產(chǎn)品進(jìn)行銷售，各廠家同時也將其作為潔膚、洗發(fā)產(chǎn)品按化妝品用途作為宣傳。國家現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)GB/T 35131—2017《油茶籽餅、粕》對此產(chǎn)品的質(zhì)量要求包含色澤、氣味、水分、含油量、總灰分、雜質(zhì)、茶皂素含量的檢測[1]，其茶皂素的含量按照SN/T 1852—2006《出口茶皂素皂甘含量的測定》[2]進(jìn)行測定，但此標(biāo)準(zhǔn)方法處于已經(jīng)廢止?fàn)顟B(tài)，茶皂素含量作為評價油茶籽粉洗滌效果的關(guān)鍵物質(zhì)，缺乏相應(yīng)現(xiàn)行有效、專屬性強、準(zhǔn)確度高的控制方法及控制指標(biāo)。本研究建立一種專屬性強、準(zhǔn)確度高、操作簡便的液相色譜法，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試藥

1.1儀器

Shimadzu LC-20AT型液相色譜儀，SPD-M20A型檢測器，均購自日本島津公司;AE240S型電子分析天平（瑞士梅特勒- 托利多集團(tuán)公司，精度為十萬分之一）;DK-615HT型超聲波清洗儀（深圳市得康洗凈電器有限公司，功率為360 W，頻率為40k Hz）。

1.2試藥及樣品

茶皂素對照品（批號：CT224206，純度為98.87%，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）;茶籽粉（北京博揚信科技有限公司，批號20210511;浙江寧波佰拉幕貿(mào)易有限公司，批號20210425;湖南婁底天之原有限公司，批號20200800;江西宜春芊盛農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，批號20210816;江西永豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，批號20210905）;甲醇（色譜純，美國Honey Well公司，批號V4EG1H）;水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Shimadzu Shim-packVP-ODS C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-水（B），等度洗脫（35：65，V/ V）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：265 nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按茶皂素3個色譜峰計均不低于3000。在此色譜條件下，茶皂素的三個色譜峰均與各組分均能達(dá)到基線分離。

2.2溶液制備

取茶皂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含茶皂素3900.4 μg/mL的對照品溶液。精密稱定樣品1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率為300 W，頻率為40 kHz）處理40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

2.3方法學(xué)考察

精密取2.2項下對照品溶液、樣品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。理論塔板數(shù)以茶皂素三個色譜峰記，均大于3000，茶皂素三個色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，基線分離良好。

標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性方程：用75%乙醇稀釋2.2項下對照品溶液，制成質(zhì)量濃度分別為3900.4、3120.3、1950.2、780.1、390.0、0 μg/mL的系列對照品溶液，按2.1項下色譜條件各進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖。以茶皂素峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 1611.2X-6565.5。

結(jié)果表明茶皂素質(zhì)量濃度均在390.0～3900.4 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N=3）計算茶皂素的檢測限，以信噪比（S/N=10）計算茶皂素的定量限，結(jié)果見表1。

精密度試驗：分別取對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果茶皂素峰面積RSD為0.05%，（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品適量（浙江寧波佰拉幕貿(mào)易有限公司，批號20210425）按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、4、8、12、18、24h時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄3個色譜峰面積和。結(jié)果RSD為0.40%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品適量（浙江寧波佰拉幕貿(mào)易有限公司，批號20210425），分別按2.2項下方法制備供試品溶液，平行六份，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。六份含量平均值為249.24 mg/g，RSD為0.33%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知茶皂素含量的同一批樣品（浙江寧波佰拉幕貿(mào)易有限公司，批號20210425）九份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的茶皂素對照品適量，依法制備樣品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算茶皂素含量及回收率。結(jié)果見表2。

2.4樣品含量測定

取樣品約1.0 g，精密稱定，依法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和樣品溶液各10 uL，注入液相色譜儀，平行測定2次，以茶皂素三個色譜峰面積之和計算茶皂素含量，結(jié)果見表3。

3討論

3.1流動相選擇

預(yù)試驗中，流動相考察了甲醇，甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水，采取甲醇作為流動相時各色譜峰分離度不佳，甲醇-0.1% 磷酸作為流動相時與甲醇-水洗脫效果相仿，但甲醇-水作為流動相配制、操作更為簡便，且對色譜柱的保護(hù)效果更好，分離出的茶皂素三個色譜峰分離效果均良好，且流動相本身干擾小、穩(wěn)定、可靠，故選擇甲醇-水等度洗脫。

3.2測定波長選擇

對照品和樣品三個色譜峰全波長掃描光譜圖（見圖1）均在198 nm、265 nm、348 nm波長處呈現(xiàn)最大吸收峰，選取265 nm波長作為吸收色譜計算峰面積。

3.3提取方法選擇

茶皂素又稱茶皂甘，熔點約為224℃，平均分子式為C₅₇H₉₀O₂₆，相對分子質(zhì)量約為1200～2800，是一種天然的糖昔化合物[4]，同時也具備這一類物質(zhì)的通性——易溶于乙醇和甲醇，但難溶于無水甲醇和無水乙醇，不溶于石油醚、苯等有機試劑[5]。國內(nèi)外提取茶皂素的方法主要有醇提法和水提法，由于水提法所得茶皂素純度較低，不利于液相色譜的定量測定[6-7];采用乙醇-水混合溶劑浸提茶籽粉中茶皂素，既可以有效排除油茶籽粉中殘油的干擾，又可得到高純度茶皂素[8]，本文選擇以75%乙醇為溶劑進(jìn)行超聲提取，方法簡便，所得提取液中茶皂素純度高、效果佳、干擾少，故選擇75%乙醇作為提取溶劑，分別考察了提取時間30 min、40 min、50 min時茶皂素的含量，結(jié)果超聲處理40 min可保證茶皂素得到充分的提取。

3.4樣品分析

對收集到的5批不同廠家的油茶籽粉樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中茶皂素含量差異較大，最高者為266.06 mg/g，最低者為95.25 mg/g，其百分比含量為9.5%～26.6%，考慮到不同廠家生產(chǎn)的油茶籽粉中茶皂素含量差異可能與不同品種、不同產(chǎn)地、似但不如本法操作簡便，本研究在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上開發(fā)一種以甲醇-水（35：65，V/V）為流動相，專屬性強、準(zhǔn)確度高、操作簡便的高效液相色譜法，為評價油茶籽粉中茶皂素的含量提供可靠依據(jù)。

3.5方法評價與討論

茶皂素是天然表面活性劑，易于生物降解且不污染環(huán)境，是日用化工行業(yè)難得的表面活性劑原料。民間自古有用茶籽粉泡水洗衣、洗發(fā)的習(xí)俗，即茶皂素去污洗滌性能的具體應(yīng)用。茶皂素性能柔和，其水溶液呈微酸性，以茶皂素為表面活性劑配成的洗滌劑，其起泡力優(yōu)于肥皂或合成洗滌劑[11]，在日用化學(xué)品中常用于配制、生產(chǎn)高檔洗發(fā)香波，具有洗發(fā)、護(hù)發(fā)雙重功效，洗滌后頭發(fā)光亮，手感爽滑、松軟，易于梳理，對皮膚無毒害、無致敏作用，還可用于開發(fā)茶皂素洗滌劑，既能洗頭、洗浴，又兼具養(yǎng)發(fā)、護(hù)膚功能，特別是使用后頭發(fā)的伸長彈性和摩擦系數(shù)均優(yōu)于其他合成洗滌類產(chǎn)品[12]。茶皂素還可作為頭發(fā)生長促進(jìn)劑，每天口服劑量20 mg，長期服用可使頭發(fā)茂盛，并具有白發(fā)變黑的功效[13]?？梢姴柙硭乜勺鳛橛筒枳逊鄣闹笜?biāo)成分用以評價其質(zhì)量和品質(zhì)。

不同栽培技術(shù)、不同采收季節(jié)的油茶樹籽及榨油工藝有關(guān)[9]，目前，茶皂素含量檢測多采用分光光度法，其專屬性不高，也有采用液相色譜法的其色譜峰分離效果不佳[10]，或選取甲醇- 0.1%磷酸為流動相進(jìn)行液相色譜洗脫的其效果與本法效果相

油茶是世界四大木本油料，也是中國所特有的油料物種，有著兩千多年栽培和利用歷史。全球油茶產(chǎn)量95%以上來自中國，主要分布在華南、華中和西南14個省（自治區(qū)，直轄市），湖南、江西、廣西、廣東、福建、湖北、浙江、貴州、安徽、云南為重點栽培省份[14]，中國油茶將近一半來自湖南，形成了“世界油茶看中國，中國油茶看湖南”總體趨勢。我國各類茶籽資源十分豐富，利用潛力巨大，油茶產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ某柈a(chǎn)業(yè)，其經(jīng)濟(jì)、社會、生態(tài)效益極高，開發(fā)油茶籽粉中茶皂素的應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義和十分廣闊的前景，可廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[15]。根據(jù)國家林業(yè)和草原局公布數(shù)據(jù)，目前我國茶油年產(chǎn)量約100萬噸，經(jīng)壓榨過后的油茶籽餅約60萬噸[16-17]，將油茶籽餅加工成油茶籽粉是一條理想的油茶工業(yè)副產(chǎn)品開發(fā)利用途徑。隨著人民生活水平的日益提高，油茶籽粉這類無添加的天然洗潔粉將得到越來越廣泛的重視。以茶皂素作為油茶籽粉的指標(biāo)成分，采用本研究建立的液相色譜法進(jìn)行質(zhì)量控制，方法簡便、準(zhǔn)確，為油茶工業(yè)副產(chǎn)品的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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