2種石房蛤毒素完全抗原交聯(lián)方法的比較及多克隆抗體的制備

陳 睿， 高燁宏， 趙學(xué)楠， 楊敏儀， 吳惠娟， 王榮智， 汪世華

生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室， 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

石房蛤毒素(saxitoxin， STX)是一種毒素極強的胍胺類神經(jīng)毒素，為麻痹性貝類毒素(paratic shellfish position)的主要成分之一，該毒素主要來源于海水或淡水中的膝溝藻、海洋甲藻、淡水藍藻等有害浮游生物，通過食物鏈積累于蛤類、貝類以及蟹類等水產(chǎn)中，哺乳動物食用了這些被污染后的水產(chǎn)后，會引發(fā)呼吸麻痹、死亡等一系列中毒反應(yīng)(李淑冰等，2000)。STX對小鼠的半致死劑量LD50為10 μg·kg-1(陳常英等，1994)。STX在世界分布廣泛，在我國的山東、福建、廣東等地均發(fā)生過人類誤食STX污染的水產(chǎn)品后引發(fā)的中毒事件(孔凡洲等，2007)。因此,漁業(yè)生產(chǎn)中亟需一種簡便、快速、靈敏的STX檢測方法。

目前，國際上用于檢測貝類毒素的方法主要為理化分析法和生物測定法。理化分析法包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)、液相色譜(liquid chromatograph-mass spectrometer， LC-MS)、分光光度法、免疫化學(xué)法。其中，較常用的HPLC能精確測定毒素的種類和含量，但樣品前處理較繁瑣且需要昂貴的儀器(馬燕玲，2013)。生物測定法包括小鼠生物測定法(mouse bioassay， MBA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbnent assay， ELISA)、家蠅生物分析法(house-fly biassay)、蝗蟲生物分析法(locust bioassay， LBA)、神經(jīng)細胞生物分析法(neurional bioassay)等。其中,MBA是國際上較通用的方法，該方法方便、快捷且成本低廉，但測定結(jié)果受小鼠個體的影響較大，誤差大、重現(xiàn)性差，不能分析樣品中的具體組分；ELISA簡便、快速、靈敏、成本低，同MBA及HPLC相比，更快速經(jīng)濟，以滿足大批量樣品快速篩查的需要(Zhietal.，2018)。目前，我國對STX的研究較少。本試驗通過2種不同的方法，使用微量的STX制備了多種STX多克隆抗體，并采用酶聯(lián)免疫分析對其效價進行比較，以期為商業(yè)化生產(chǎn)多克隆抗體提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 Balb/c小鼠(雌性6周齡)購買于吳氏實驗動物貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試劑 STX毒素標(biāo)準品由臺灣Algalchem公司提取，雞卵清白蛋白(ovalbumin， OVA)購于源葉生物公司，牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)購于翊圣生物公司，鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin， KLH)、高碘酸鈉和硼氫化鈉購于Macklin公司。弗氏完全佐劑(complete freunds adjuvant， CFA)和弗氏不完全佐劑(incomplete freunds adjuvant， IFA)購于SIGMA公司。N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide， NHS)購于Aladdin公司。1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride， EDC)購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購于Bioss公司。

1.2 方法

1.2.1 完全抗原的制備及分析 EDC法:將0.09 mmol·L-1NHS和0.09 mmol·L-1EDC分別加入裝有450 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)的1.5 mL EP管中，分別制備3管，用移液槍吹打溶解，并用錫紙包裹管身，分別加入50 μL STX標(biāo)準品，固定于25 ℃恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速120 r·min-1混合12 h。取出置于常溫離心機中12000 r·min-1離心10 min，取上清備用。將20 mg的OVA、BSA、KLH蛋白分別溶于10 mL ddH2O中(pH6.5)，并用NaHCO3緩沖液(0.5 mol·L-1，pH9.6)將pH調(diào)至7，最后每種蛋白取5 mL分裝3個10 mL EP管中備用。將上清分別緩慢加入制備好的3種蛋白溶液中，固定于25 ℃恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速120 r·min-1振蕩12 h，取上清，按順序用0.05 mol·L-1的(NH4)2CO3透析4 h，0.01 mol·L-1的(NH4)2CO3透析過夜，再換成新的0.01 mol·L-1的(NH4)2CO3透析4 h，最后ddH2O透析4 h，用PEG20000置于冰上濃縮至1～2 mL，置于-20 ℃保存(Meietal.，2019)。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析。

高碘酸鹽法:將5 mg的OVA、BSA、KLH蛋白分別溶于1 mL ddH2O中，用0.1 mol·L-1的乙酸將pH調(diào)至4.4。將含有6.9 mg高碘酸鈉的0.3 mL ddH2O分別逐滴加入到配置好的蛋白溶液中，避光條件下反應(yīng)1 h，接著用乙酸鈉緩沖液(0.1 mol·L-1，pH4.4)透析，放置備用。將28 μL的STX加入到200 μL乙酸溶液(0.1 mol·L-1)中，混勻，分別制備3管，再分別加入到活化后的蛋白溶液中。用NaHCO3緩沖液(0.5 mol·L-1，pH9.6)將pH調(diào)至7.5。并在20 ℃條件下水浴1 h，分別加入0.1 mL NaBH4(4 mg·mL-1)。最后在4 ℃下孵育20 min，并分別用PBS透析3次，每次4 h，再用ddH2O透析4 h，用PEG20000置于冰上濃縮至1～2 mL，置于-20 ℃保存(Christineetal.，1995)。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分析。

1.2.2 試驗小鼠的免疫 分別以EDC法和高碘酸鹽法制備的STX-BSA、STX-KLH為免疫原，分別免疫6周齡健康的Balb/c雌性小鼠，共免疫3組。首次免疫，將200 μg的免疫原用PBS稀釋至500 μL，與等體積500 μL的弗式完全佐劑混合，并用乳化儀乳化成乳濁液，在小鼠皮下多點注射(劉帥帥等，2011)。之后每隔14 d，將100 μg免疫原用400 μL的PBS稀釋，再與等體積500 μL的弗式不完全佐劑混合，并用乳化儀乳化成乳濁液，在小鼠皮下多點注射。

1.2.3 多克隆血清的獲取 間隔1～2個免疫周期，用扎取小鼠尾部靜脈血管的方法，取小鼠尾部靜脈血進行血清效價測定。待小鼠免疫7次后，摘小鼠眼球取血，取血完畢后脫臼處死(王月英等，2007)。取得的血液置于37 ℃恒溫水浴鍋中30 min，再于4 ℃冷凍離心機中，12000 r·min-1離心30 min。取上層血清，加入體積甘油混勻，置于-20 ℃保存。

1.2.4 ELISA檢測多克隆抗體的效價 分別將EDC法和高碘酸鹽法制備的STX-OVA為檢測原，用包被緩沖液(pH9.6)稀釋到10 mg·mL-1，在高效價的96孔酶標(biāo)板上每孔加入100 μL，37 ℃孵育2 h。取出棄掉殘液，拍干，每孔加入200 μL PBSM封閉液，4 ℃封閉過夜。取出棄掉封閉液，用PBS洗滌3次，拍干，再用PBST洗滌3次，拍干，放置于4 ℃冰箱備用。將多抗血清與PBSM按照1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000的比例稀釋混勻，每孔100 μL按順序加入包有相應(yīng)檢測原的酶標(biāo)孔中，將PBSM加入2孔包有檢測原的酶標(biāo)孔中為陰性對照。37 ℃孵育1 h，取出棄掉殘液，洗板操作同上，再加入稀釋比為1∶8000的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，取出棄掉殘液，洗板操作同上，加入TMB顯色液，37 ℃ 孵育15 min，加入2 mol·L-1的H2SO4終止液，每孔50 μL (Caietal.，2021)。用酶標(biāo)儀測D450 nm的值，收集數(shù)據(jù)并分析。

1.2.5 2種抗原制備方法所制備出的抗原的差異比較 分別將EDC法和高碘酸鹽法制備的STX-OVA用包被緩沖液(pH9.6)稀釋到10 μg·mL-1作為包被原，在高效價的96孔酶標(biāo)板上每孔加入100 μL，其后的操作同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 完全抗原的制備及分析

2.1.1 EDC法制備完全抗原與分析 利用EDC法制備STX-BSA、STX-OVA和STX-KLH。將BSA與STX-BSA完全抗原和OVA與STX-OVA分別進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描分析。在瓊脂糖凝膠電泳中，STX-BSA完全抗原與BSA蛋白相比，由于其分子質(zhì)量更大，遷移率較低，說明成功制備了STX-BSA完全抗原。通過紫外分光光度計檢測STX、BSA和STX-BSA完全抗原的光譜，STX-BSA完全抗原的波峰同BSA和STX的波峰相比，出現(xiàn)紅移，佐證了STX-BSA完全抗原的成功制備(圖1A、B)。圖1C、D中，STX-OVA完全抗原的遷移率比OVA蛋白低，且STX-OVA完全抗原的波峰同OVA和STX的波峰相比，出現(xiàn)紅移，說明STX-OVA成功制備。用同樣的方法也成功制備了STX-KLH的交聯(lián)物。

圖1 EDC法交聯(lián)STX的瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描Fig.1 Agrosegel electrophoresis and UV-vis analysis of STX conjugates by EDC A：泳道1為BSA，泳道2為STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物；B：STX、BSA和STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖; C：泳道3為OVA，泳道4為STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物;D：STX、OVA和STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖。 A: Lane 1 is BSA protein, lane 2 is STX-BSA conjugates; B: UV-vis analysis of STX, BSA and STX-BSA conjugate； C: Lane 3 is OVA protein, lane 4 is STX-OVA conjugates; D: UV-vis analysis of STX, OVA and STX-OVA conjugate.

2.1.2 高碘酸鹽法制備完全抗原與分析 利用高碘酸鹽法制備STX-BSA、STX-OVA和STX-KLH。將BSA與STX-BSA完全抗原分別和OVA與STX-OVA進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描分析。在瓊脂糖凝膠電泳中，STX-BSA完全抗原與BSA蛋白相比,遷移率較低，說明成功制備STX-BSA完全抗原。通過紫外光譜掃描檢測STX、BSA和STX-BSA完全抗原的光譜，STX-BSA完全抗原的波峰同BSA和STX的波峰相比，出現(xiàn)紅移，說明STX-BSA完全抗原的成功制備(圖2A、B)。圖2C、D中，STX-OVA完全抗原的遷移率均比相應(yīng)的蛋白載體低，且波峰均出現(xiàn)紅移，說明STX-OVA完全抗原的成功制備。用同樣方法也成功制備了STX-KLH的交聯(lián)物。

圖2 高碘酸鹽法交聯(lián)STX的瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描Fig.2 Agrosegel electrophoresis and UV-vis analysis of STX conjugates by periodate reaction A：泳道1為BSA，泳道2為STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物；B：STX、BSA和STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖; C：泳道3為OVA，泳道4為STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物;D：STX、OVA和STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖。 A: Lane 1 is BSA protein, lane 2 is STX-BSA conjugates; B: UV-vis analysis of STX, BSA and STX-BSA conjugate； C: Lane 3 is OVA protein.Lane 4 is STX-OVA conjugates; D: UV-vis analysis of STX, OVA and STX-OVA conjugate.

2.2 多克隆抗體的效價測定

2.2.1 EDC法制備的完全抗原的效價測定 以STX-BSA和STX-KLH為免疫原，分別皮下免疫2只小鼠，得到多抗血清，進行ELISA試驗，用酶標(biāo)儀測效價。以STX-BSA為免疫原免疫小鼠，得血清效價圖3A,1號小鼠的效價最為明顯，血清滴度為1∶1000時，D450 nm為3.316；血清滴度為1∶8000時，D450 nm為0.06，獲得較高效價。而2號小鼠在各血清滴度下，D450 nm均為0.050左右，故以EDC法制備的STX-BSA為免疫原進行皮下免疫的2只小鼠中，僅有1號小鼠能發(fā)生特異性免疫應(yīng)答。以STX-KLH為免疫原免疫小鼠得血清效價圖3B，1號小鼠與2號小鼠相比，能顯示出效價梯度，但血清滴度為1∶500時，D450 nm僅為0.596，說明用EDC法制備的STX-KLH的完全抗原的效果并不理想。

圖3 EDC法制備的抗原免疫小鼠血清效價測定Fig.3 The titer assay of anti-serum with EDC method A:以STX-BSA為免疫原;B:以STX-KLH為免疫原。 A: Immunogen is STX-BSA; B: Immunogen is STX-KLH.

2.2.2 高碘酸鹽法制備的完全抗原的效價測定 分別以STX-BSA和STX-KLH為免疫原，皮下免疫3只小鼠，用STX-OVA作為檢測原免疫小鼠得到多抗血清進行ELISA試驗，用酶標(biāo)儀測效價。以STX -BSA為免疫原免疫小鼠可得得血清效價圖4A, 1 號和2號小鼠均隨著血清滴度增加表現(xiàn)出明顯的效價梯度:1號小鼠在血清滴度為1∶500 時,D450 nm為 0.882,獲得 較高效價;2號小鼠在血清滴度為1∶500 時,D450 nm為0.452,血清滴度為1∶8000時，D450 nm為0.284，獲得效價。3號小鼠在各血清滴度下，D450 nm均為0.050左右，說明3號小鼠沒有發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。故以高碘酸鹽法交聯(lián)STX-BSA為免疫原進行皮下免疫的3只小鼠中，1號和2號小鼠均能發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，且1號小鼠多抗血清的效價較高。以STX-KLH為免疫原免疫小鼠得得血清效價圖4B，3只小鼠均隨著血清滴度增加表現(xiàn)出明顯的效價梯度：1號小鼠在血清滴度為 1∶ 500 倍 時，D450 nm為 1.856，獲得較高效價；2 號小鼠在血清 滴度為 1 ∶ 500時，D450 nm為 0.990，獲得效價；3 號小鼠在血清滴度為 1∶ 500 時，D450 nm為 0.488，在血清滴度為1:8000時，D450 nm為0.076，具有效價。故以高碘酸鹽法交聯(lián)STX-KLH為免疫原進行皮下免疫的3只小鼠中，3只小鼠都發(fā)生特異性免疫應(yīng)答,其中1號小鼠多抗血清的效價較高。

圖4 高碘酸鹽法制備的抗原免疫小鼠血清效價測定Fig.4 The titer assay of anti-serum with periodate reaction A:以STX-BSA為免疫原;B:以STX-KLH為免疫原。 A: Immunogen is STX-BSA; B: Immunogen is STX-KLH.

2.2.3 2種制備方法所制備出的免疫原的差異 由上述試驗結(jié)果可知，EDC法和高碘酸鹽法交聯(lián)的STX-BSA和STX-KLH完全抗原均可作為免疫原引起小鼠的特異性免疫應(yīng)答。比較這2種方法制備的完全抗原免疫小鼠后得到的多克隆抗體血清的效價差異，結(jié)果見表1。表中為免疫不同完全抗原后的4組小鼠與不同方法制備出的檢測原進行ELISA試驗，選取效價最高的1只進行分析，比對D450 nm為1時的多克隆抗體血清的稀釋度。用EDC法交聯(lián)的STX-BSA免疫小鼠獲得多克隆抗體血清，與用EDC法交聯(lián)的STX-OVA為檢測原進行間接ELISA試驗，測得D450 nm為1時的抗體稀釋度最高，為4×103。此外，多克隆抗體血清對于不同交聯(lián)方法制備出的檢測原STX-OVA對多克隆抗體血清的檢測效果相似，證明EDC法和高碘酸鹽法制備出的STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物可作為通用的檢測原混用，同時證明這2種方法均能保留STX的主要結(jié)構(gòu)。

表1 不同的多克隆抗體對于檢測原的效價比較Table 1 Comparison of different polyclonal antibodies to titer of detective antigen

3 討論

STX為小分子半抗原，分子質(zhì)量為299 ku，在免疫反應(yīng)中沒有免疫原性，需要與分子質(zhì)量大的載體蛋白交聯(lián)制備成完全抗原才能進行免疫。常用的載體蛋白有OVA、BSA和KLH等。本試驗僅用了少量的STX通過2種交聯(lián)方法成功制備了6種STX的完全抗原，并通過免疫小鼠獲得抗STX的多克隆抗體，對其進行了間接ELISA試驗，比較了不同免疫原制備的多克隆抗體的差異。對比2種交聯(lián)方法，EDC法先是通過EDC活化STX上的酰胺基團，接著NHS替換了活化后的酰胺基團，最讓其與蛋白載體產(chǎn)生縮合反應(yīng)，從而交聯(lián)。高碘酸鹽法中高碘酸鈉為氧化劑，先將STX上的惰性羥基氧化為醛基形成中間產(chǎn)物，再通過硼氫化鈉還原劑，除去多余高碘酸鈉的同時，讓中間產(chǎn)物與蛋白交聯(lián)。2種方法的交聯(lián)產(chǎn)物雖然在結(jié)構(gòu)上略有差別，但制備的完全抗原均具有免疫原性，證明這2種交聯(lián)方法并未影響STX的結(jié)構(gòu)。通過對比交聯(lián)出的免疫原所制備出的多克隆抗血清的效價發(fā)現(xiàn)，EDC法更具優(yōu)勢。

對比不同的蛋白載體，BSA來源于牛血清，為一種可溶性良好且穩(wěn)定的一種蛋白載體。KLH來源于軟體動物，與哺乳動物的親緣性較遠，試驗發(fā)現(xiàn)，2種交聯(lián)方法均能讓STX與BSA載體蛋白交聯(lián)，從而使免疫小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但是從免疫效果來看，與BSA交聯(lián)的完全抗原能產(chǎn)生更高的效價，因此，BSA更適合作為STX的蛋白載體。

本試驗的結(jié)果表明，在石房蛤毒素完全抗原的制備中，在交聯(lián)方法的選擇上，EDC法較高碘酸鹽法更具優(yōu)勢；而在免疫原的選擇上，STX-BSA完全抗原效果最好。該結(jié)果可為商業(yè)化批量生產(chǎn)STX多克隆抗體提供一定的數(shù)據(jù)支撐。