基于ISSR的豚草和三裂葉豚草遺傳多樣性研究

王 鈿， 付開赟， 丁新華， 何 江， 吐爾遜·阿合買提， 張國良， 付衛(wèi)東， 文 俊， 加馬力丁·吾拉扎汗， 王 蘭*， 郭文超

1塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300； 2新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部 西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091； 3中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081； 4伊犁州治蝗滅鼠指揮中心，新疆 伊犁 835000； 5新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應(yīng)用研究所，新疆 烏魯木齊 830091

豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.和三裂葉豚草AmbrosiatrifidaL.均是惡性雜草，是世界上公認的有害植物；分別是我國首批和第二批公布的危害嚴重的外來有害生物(萬方浩等，2005)。豚草和三裂葉豚草繁殖力和植株競爭力強，生長中易排斥其他植物，形成優(yōu)勢，成片生長，改變當?shù)卦兄参锓N類和群落類型，導致生物多樣性下降；其侵入農(nóng)田，與作物競爭導致作物產(chǎn)量損失，且其花粉對人體具有高致敏性(Bullocketal.,2012)。豚草別稱艾葉破布草，一年生草本植物，屬菊科，原產(chǎn)北美洲(包穎，2018)。近200年在全球范圍內(nèi)蔓延，已擴散到80多個國家(Montagnanietal.,2017),20世紀30年代首次傳入中國。目前豚草廣泛分布于我國東北、華北、華中、華東等地區(qū)(柳曉燕等，2016； 邵云玲和曹偉，2017； Chenetal.,2007； Qinetal.,2014)。三裂葉豚草別稱大破布草，屬菊科豚草屬植物，原產(chǎn)北美洲，20世紀30年代傳入我國, 入侵我國黑龍江、北京等地(馬麗娟等，2020； 馬倩倩等，2020)。2010年，在新疆伊犁河谷新源縣首次發(fā)現(xiàn)豚草和三裂葉豚草入侵，隨后迅速擴散蔓延，現(xiàn)呈大面積暴發(fā)趨勢，已嚴重威脅到當?shù)剞r(nóng)牧民的生產(chǎn)和生活(何江等，2020； 梁巧玲和陸平，2014)。

簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性(inter-simple sequence repeat， ISSR)是由Zietkiewiczetal.(1994)基于簡單序列重復(simple sequence repeats， SSR)建立的一種分子標記技術(shù)，其在SSR的3′或 5′端加上2～4個錨定核苷酸，以提高反應(yīng)的專一性，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后可獲得遺傳多樣性信息(Fernandez & Figueiras,2002)。ISSR技術(shù)具有操作簡便、重復性好和多態(tài)性高等優(yōu)點，在遺傳多樣性研究中應(yīng)用廣泛(Godwinetal.,2010)。目前ISSR已在多種動植物的親緣關(guān)系、種質(zhì)鑒定等研究方面得到應(yīng)用(王明明等，2007)。本研究采用ISSR技術(shù)對8個豚草居群和7個三裂葉豚草居群的遺傳多樣性與遺傳分化進行分析,旨在揭示新疆伊犁河谷豚草和三裂葉豚草居群的遺傳多樣性水平、居群間和居群內(nèi)的遺傳分化程度以及不同居群間的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

三裂葉豚草居群分別采自新疆新源縣阿勒瑪勒鎮(zhèn)阿克其村(43°31′80″ N，83°17′17″ E，海拔806.6 m)、新疆新源縣則克臺鎮(zhèn)沙哈村(43°32′25″ N，83°17′97″ E，海拔828.2 m)、新疆新源縣鐵熱克阿吾孜村(43°31′29″ N，83°22′50″ E，海拔817.9 m)、新疆新源縣吐爾根農(nóng)場牧業(yè)隊(43°32′24″ N，83°23′36″ E，海拔951.3 m)、新疆新源縣則克臺村(43°31′23″ N，83°20′49″ E，海拔801.6 m)、新疆新源縣那拉提杏花村(43°32′23″ N，83°26′15″ E，海拔1039.5 m)、遼寧沈陽市沈河區(qū)(41°49′45″ N，123°33′26″ E，海拔37.9 m)7個居群。豚草居群分別采自新疆察布查爾縣綽霍爾鎮(zhèn)博孜墩村(43°49′53″ N，81°59′25″ E，海拔553.0 m)、貴州惠水縣龍洞村(26°18′12″ N，106°39′20″ E，海拔973.1 m)、廣西來賓市大灣鎮(zhèn)石山村(23°31′50″ N，109°21′57″ E，海拔69.0 m)、廣西來賓市平陽鎮(zhèn)平陽村(23°22′33″ N，109°13′26″ E，海拔89.0 m)、廣西來賓市武宣縣金雞鄉(xiāng)魚步村(23°32′18″ N，109°21′30″ E，海拔74.0 m)、新疆新源縣鐵木里克村(43°19′45″ N，83°50′23″ E，海拔845.2 m)、新疆新源縣玉什開普臺爾村(43°17′16″ N，83°23′49″ E，海拔832.6 m)、新疆新源縣阿熱勒托別鎮(zhèn)哈拉西克村(43°15′59″ N，83°27′52″ E，海拔815.0 m)8個居群。每個居群采集植物樣品16株，共240個樣品。采樣時，每個居群間隔2 km以上為一樣點；內(nèi)地樣品由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所付衛(wèi)東老師采集提供，疆內(nèi)樣品由新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所采集提供。每個居群內(nèi)采樣時每株間隔在20 m以上的植株為一份樣品，選取健康且長勢相同的植株葉片置于保鮮袋中，帶回實驗室用無菌水清洗，保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取0.10 g葉片放至1.5 mL的標號EP管中，再將EP管放入液氮中15 s；取出后充分研磨至粉末狀，加入800 μL的DNAiso Reagent，靜置2 min；加入200 μL氯仿，漩渦60 s后15000 r·min-1、4 ℃離心10 min；移液槍吸取上清液移至吸附柱中，15000 r·min-1、4 ℃離心1 min，棄下清液；加入300 μL無水乙醇，15000r·min-1、4 ℃離心1 min，棄下清液；加入700 μL 75%酒精，7500 r·min-1、4 ℃離心1 min，棄下清液；加入700 μL 75%酒精，7500 r·min-1、4 ℃離心1 min，棄下清液；空轉(zhuǎn)15000 r·min-1、4 ℃離心2 min；加入30 μL ddH2O(TE buffer)，靜置2 min，15000 r·min-1、4 ℃離心1 min，-20 ℃保存DNA。

1.2.2 ISSR-PCR擴增 依據(jù)不列顛哥倫比亞大學(The University of British Columbia，UBC)公布的100條ISSR通用引物(https:∥wenku.baidu.com/view/62eea8f1fc4ffe473268ab76)，由上海生物工程公司合成。以豚草和三裂葉豚草DNA為模板，用GT9612型96梯度PCR儀進行ISSR通用引物的篩選和體系程序優(yōu)化。選取多態(tài)性高、重復性好的引物，對DNA模板的濃度、引物用量和反應(yīng)溫度等進行優(yōu)化。根據(jù)已優(yōu)化的體系和程序，用篩選得到的引物對所有豚草和三裂葉豚草樣品進行ISSR-PCR擴增。將PCR產(chǎn)物點樣置于2%(瓊脂糖質(zhì)量與TAE緩沖液體積比)瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳檢測；檢測電壓75 V，35 min。在凝膠成像儀中拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以ISSR-PCR照片為依據(jù)，用Excel表統(tǒng)計譜帶數(shù)量有譜帶處標“1”，無譜帶處標“0”，建立 0/1 矩陣；用POPGEN 32軟件計算Nei′s基因多樣性指數(shù)和Shannon′s信息指數(shù)2個遺傳參數(shù)；用NTSYS 2.10軟件對15個居群進行聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀聚類圖；利用經(jīng)緯度計算各居群間的直線距離，用SAS軟件進行地理距離和遺傳距離的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴增結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化獲得最佳反應(yīng)體系(25 μL)：12.5 μL 2×Taq PCR Mix，2 μL引物，2 μL模板DNA，8.5 μL ddH2O。PCR程序設(shè)置：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取部分DNA樣品(4 ℃保存)，將其作為模板進行引物篩選。篩選出13條多態(tài)性高、譜帶清晰且重復性好的引物(表1)。

采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系與程序，用13條引物對240份樣品進行 ISSR-PCR擴增實驗，其中引物UBC884對三裂葉豚草擴增多態(tài)性條帶比率最低，為78.57%；引物UBC815對豚草擴增多態(tài)性比率最低，為87.50%。引物UBC812、 UBC815、 UBC822、UBC823、 UBC841、UBC848、UBC866對三裂葉豚草擴增多態(tài)性條帶比率達到100%；引物UBC823、UBC825、 UBC848、 UBC866、 UBC884、UBC887對豚草擴增多態(tài)性條帶比率達到100%。由于三裂葉豚草在新疆伊犁哈薩克自治州新源縣那拉提杏花村發(fā)生危害嚴重，因此，選取引物UBC841對三裂葉豚草居群的ISSR進行擴增，擴增圖譜如圖1所示。

表1 篩選出的引物基本信息Table 1 Basic information of screened primers

圖1 引物UBC841對三裂葉豚草新疆新源縣杏花村居群的擴增圖譜Fig.1 Amplification map of primer UBC841 on A. trifida populations in Xinghua Village, Xinyuan County, Xinjiang 1～16表示該居群16個樣品的編號，M表示DNA marker DL2000。 1-16 indicates the number of the 16 samples of the population, and M indicates DNA marker DL2000.

2.2 豚草和三裂葉豚草居群遺傳多樣性分析

從表2可以看出，豚草8個居群的多態(tài)位點率平均值為98.68%，其中1、3、5、6、7和8居群的多態(tài)位點率為100%；平均有效等位基因數(shù)為1.7788，其中8居群最高；各居群 Nei′s 基因多樣性指數(shù)介于0.4016～0.4619之間，其變化趨勢與有效等位基因數(shù)的變化趨勢一樣；8個居群的Shannon′s信息指數(shù)平均值為0.6194。6個遺傳多樣性指標的變化表明，豚草在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。三裂葉豚草7個居群的多態(tài)位點率平均值為98.50%，其中10、13和14居群達到100%；平均有效等位基因數(shù)為1.7965，其中15居群最高，13居群最??；各居群Nei′s基因多樣性指數(shù)介于0.4281～0.4478，其變化趨勢與有效等位基因的變化趨勢一樣，7個居群的Shannon′s信息指數(shù)平均值為0.6224。6個遺傳多樣性指標的變化表明，三裂葉豚草在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。

表2 豚草和三裂葉豚草居群遺傳多樣性分析Table 2 Analysis on genetic diversity of A. artemisiifolia and A. trifida populations

2.3 豚草和三裂葉豚草不同居群遺傳分化

由表3可知，豚草總遺傳多樣性為0.4788，居群內(nèi)基因多樣性平均值0.4319；8個居群的基因分化系數(shù)為0.0981，說明總的變異中9.81%的變異來自于居群間，90.19%的變異來自于局群內(nèi);基因流為4.5994，表明豚草居群間基因流具有一定的流動性。三裂葉豚草總遺傳多樣性為0.4670，居群內(nèi)基因多樣性平均值為0.4348；7個居群的基因分化系數(shù)為0.0688，說明遺傳變異中有6.88%的變異來自于居群間，93.12%的變異來自于居群內(nèi);基因流為6.7662,表明三裂葉豚草居群間基因流具有較高的流動性。

表3 豚草和三裂葉豚草的Nei′s基因多樣性分析Table 3 Nei′s genetic diversity analysis of A. artemisiifolia and A. trifida

2.4 UPGMA聚類分析

由圖2可知，系統(tǒng)聚類時遺傳一致度為0.89～0.97。豚草貴州惠水縣龍洞村居群和廣西平陽鎮(zhèn)平陽村居群為一支，廣西大灣鎮(zhèn)石山村居群和廣西金雞鄉(xiāng)魚步村居群為一支，然后合為一支再與新疆察布查爾錫伯自治縣博孜墩村居群聚為一支；新疆新源縣鐵木里克村居群、新疆新源縣玉什開普臺爾村居群和新疆新源縣哈拉西克村居群聚為另一支。當遺傳相似系數(shù)為0.91時可分為2組：貴州惠水縣龍洞村居群、廣西平陽鎮(zhèn)平陽村居群、廣西大灣鎮(zhèn)居石山村居群、廣西金雞鄉(xiāng)魚步村居群和新疆察布查爾縣博孜墩村居群為一組；新疆新源縣鐵木里克村居群、新疆新源縣玉什開普臺爾村居群和新疆新源縣哈拉西克村居群為另一組。豚草聚類結(jié)果與遺傳距離的結(jié)果一致，各居群間相似系數(shù)高，相似性大。

三裂葉豚草新疆新源縣阿克其村居群和新疆新源縣沙哈村居群聚為一支；遼寧省沈陽市沈河區(qū)居群和新疆新源縣鐵熱克阿吾孜村居群聚為一支，后與新疆新源縣圖爾根農(nóng)場居群聚為一支；新疆新源縣則克臺村居群和新疆新源縣杏花村居群聚為一支。當遺傳相似系數(shù)為0.91時，7個居群分為2組：新源縣阿克其村居群和新疆新源縣沙哈村居群分為一組；遼寧省沈陽市沈河區(qū)居群、新疆新源縣鐵熱克阿吾孜村居群、新疆新源縣吐爾根農(nóng)場居群、新疆新源縣則克臺村居群和新疆新源縣杏花村居群為另一組。三裂葉豚草聚類結(jié)果與遺傳距離的結(jié)果一致，各居群間相似系數(shù)高，相似性大(圖2)。

2.5 遺傳距離與地理距離間的相關(guān)性分析

豚草和三裂葉豚草居群間遺傳距離與相應(yīng)地理距離的相關(guān)性回歸分析如圖3所示,豚草的回歸方程為Y=2E-0.5X+0.0692，利用SAS軟件進行的相關(guān)性分析可知其相關(guān)系數(shù)R2=0.4860>r0.05(P=0.001<0.05)。豚草各居群間的遺傳距離與地理距離間有顯著的相關(guān)關(guān)系,居群間的基因交流受到地理距離的限制。三裂葉豚草的回歸方程為Y=-7.958X+1.895，利用SAS軟件進行的相關(guān)性分析可知其相關(guān)系數(shù)R2=0.06940.05)。三裂葉豚草各居群間的遺傳距離與地理距離間無顯著的相關(guān)關(guān)系,居群間的基因交流不受地理距離的限制。

3 討論

沙偉和周福軍(1999)、沙偉等(2000)采用水平切片淀粉凝膠電泳測定了東北地區(qū)分布不同生態(tài)環(huán)境條件下7個豚草居群的遺傳結(jié)構(gòu)，揭示了東北豚草7個居群間的變異僅占總變異的7.3%,大多數(shù)(92.7%)變異存在于居群內(nèi)部。鄧旭等(2011)應(yīng)用ISSR分子檢測技術(shù)研究了5個湖南豚草居群的遺傳多樣性，總遺傳變異中有29.61%是存在于居群間的，居群內(nèi)遺傳變異占總變異的70.39%。黃久香等(2012)等應(yīng)用ISSR技術(shù)對廣東豚草居群進行遺傳多樣性分析，67.37%的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)，32.63%的遺傳變異發(fā)生在居群間。本研究對新疆地區(qū)豚草和三裂葉豚草研究結(jié)果表明，遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)部，這與上述研究結(jié)果一致。

遺傳多樣性分析表明，無論是多態(tài)性位點比率，還是居群的相似性指數(shù)均較高，2物種可能來源于同一源種群，是導致其遺傳相似度相對較高的主要原因。新疆地區(qū)豚草遺傳相似度和廣西、貴州較高，因此入侵新疆的豚草可能來源于廣西、貴州。

圖2 豚草和三裂葉豚草UPGMA聚類結(jié)果Fig.2 UPGMA clustering results of A. artemisiifolia and A. trifida

圖3 豚草(A)和三裂葉豚草遺(B)傳距離和地理距離的回歸分析Fig.3 Regression analysis of genetic distance and geographical distance between A. artemisiifolia (A)and A. trifida(B)

本研究發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)豚草和三裂葉豚草各居群遺傳距離較近。這一現(xiàn)象可能是由于豚草和三裂葉豚草為一年生草本植物,其結(jié)實量大,存活率和增殖率都很高；同時伊犁河谷屬農(nóng)牧交錯區(qū)，牛羊等牲畜的攜帶以及人為活動使其在短期內(nèi)迅速蔓延擴展，導致各居群的遺傳距離較近。由于新疆地區(qū)豚草發(fā)生分布面積相對較大，三裂葉豚草發(fā)生分布相對較小，導致三裂葉豚草各樣點的距離相對較近，可能是豚草遺傳距離和地理距離有顯著相關(guān)性，三裂葉豚草無顯著相關(guān)性的一個重要原因。因此，要真正揭示新疆三裂葉豚草和豚草來源以及遺傳特性還需要研究更大范圍更多數(shù)量的居群。

4 結(jié)論

本研究從豚草和三裂葉豚草中共篩選出13條多態(tài)性引物，豚草獲得304條特征條帶，三裂葉豚草獲得266條特征條帶。ISSR分析結(jié)果表明：豚草和三裂葉豚草在居群間具一定的遺傳穩(wěn)定性；居群內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性；遺傳變異主要來源于居群內(nèi)部。豚草遺傳距離和地理距離有顯著相關(guān)性，三裂葉豚草無顯著相關(guān)性。本研究可為新疆地區(qū)豚草和三裂葉豚草的防治和進一步的研究提供理論基礎(chǔ)。