南美蟛蜞菊霜霉病病原鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

李華洪， 何成成， 習(xí)平根， 姜子德， 李敏慧

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室， 廣東 廣州 510642

南美蟛蜞菊Sphagneticolatrilobata(L.) Pruski[異名Wedeliatrilobata(L.) Hitchc.]又名三裂葉蟛蜞菊，是菊科向日葵族蟛蜞菊屬的多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲及中美洲地區(qū)，于20世紀(jì)70年代作為地被綠化植物引進我國(吳彥瓊等，2005)。南美蟛蜞菊對環(huán)境的適應(yīng)性超強，不僅可通過化感作用強烈抑制其周圍植物的生長(柯展鴻等，2014)，還可以利用其內(nèi)生叢枝菌根真菌促進自身生長，增強自身對本地植物的競爭優(yōu)勢(祁珊珊等，2020)，并能改善土壤營養(yǎng)環(huán)境，提高土壤肥力，形成對自身生長有利的微環(huán)境(全國明等，2016)，從而快速在棲息地形成優(yōu)勢種群，因此也被認為是最具威脅的100個外來入侵物種之一(辜睿等，2020)。近年來，南美蟛蜞菊在我國東南沿海省(區(qū))(福建、廣東、廣西和海南等)迅速定殖并不斷擴散，對其周邊生物多樣性及生態(tài)環(huán)境造成巨大影響和潛在威脅(Qietal.,2014)。

目前，南美蟛蜞菊的治理主要采取人工清除、化學(xué)防治和生物防治等方法。人工清除效果顯著，但需耗費大量人力物力。在我國廣泛使用的化學(xué)除草劑莠去津雖然對南美蟛蜞菊防控效果較好，但因其高殘留和高污染已經(jīng)被歐盟國家禁用(田學(xué)軍等，2016)。已有研究表明，施用不同濃度的百草枯、草甘膦和穩(wěn)殺得化學(xué)除草劑短期內(nèi)對蟛蜞菊化感作用的影響有限，反而在一定程度上促進了蟛蜞菊的入侵(李光義等，2010)，因而應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥控制南美蟛蜞菊還有待進一步研究。生物防治目前主要是利用本土植物的化感作用(柯展鴻等，2014； 袁偉影等，2017)和利用本土植物對其生態(tài)位的競爭(周雨露等，2016)抑制其生長。雖然利用天敵限制入侵植物的生長和蔓延是較為理想的防控方法，但南美蟛蜞菊病蟲害種類較少，在我國未見其病害報道。因此，調(diào)查南美蟛蜞菊上自然發(fā)生的病害并鑒定其病原，對于挖掘其生防微生物資源、探索生物防治途徑具有重要意義。

核糖體DNA(ribosomal DNA, rDNA)序列包括18S小亞基編碼區(qū)(small subunit, SSU)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)和28S大亞基編碼區(qū)(large subunit, LSU)序列，這3種序列是常用的真菌鑒定分子標(biāo)記(Rajaetal., 2017)。其中，ITS序列更是被稱作真菌的條形碼標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于種及種下分類水平的真菌鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析(Schochetal.,2012)。含有D1和D2高變異區(qū)的LSU序列，單獨或與ITS序列結(jié)合時，也可用于真菌和卵菌的物種鑒定(Rajaetal.,2017; Riethmülleretal.,2002)。本研究對廣州南美蟛蜞菊病害發(fā)生情況進行調(diào)查，并通過對病原菌ITS和LSU序列進行克隆、測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，對南美蟛蜞菊霜霉病病原進行分子鑒定，明確侵染菊科植物的單軸霉屬不同種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及標(biāo)本采集

2020年8月—2021年8月，在廣東省廣州市天河區(qū)、白云區(qū)各森林公園以及華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，對南美蟛蜞菊病害的發(fā)生及危害情況進行調(diào)查，對發(fā)現(xiàn)的霜霉病采用5點取樣法，每個點隨機取20株進行發(fā)病率和病情指數(shù)統(tǒng)計。以病害發(fā)生的嚴重程度劃分病情級數(shù)：0級為整株葉片無病斑；1級為植株下部小于等于10%的葉片上有少量病斑；2級為大于10%，小于等于30%的植株葉片上有病斑；3級為大于30%，小于等于60%的葉片有病斑； 4級為大于60%的葉片有病斑。以5個取樣點的平均發(fā)病率和病情指數(shù)(方仲達，1998)評估調(diào)查地點南美蟛蜞菊霜霉病發(fā)生情況。采集癥狀典型的病葉及帶病植株，帶回實驗室進行病原鑒定。

1.2 病害癥狀觀察

對采集的蟛蜞菊霜霉病病害標(biāo)本進行癥狀觀察，記錄病斑顏色、大小、發(fā)病部位。

1.3 病原菌形態(tài)鑒定

選擇具有典型癥狀的新鮮葉片樣本，在發(fā)病葉片背面刮取霉層制成臨時玻片置于光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53)下，觀察病原菌的形態(tài)，并記錄病原菌的孢囊梗、孢子囊大小和形狀等形態(tài)特征。根據(jù)霜霉菌形態(tài)特征及寄主范圍進行病原菌屬的鑒定(余永年，1998； Choietal.,2009; Voglmayretal.,2008)。

1.4 病原菌rDNA-ITS及LSU序列擴增及分析

刮取并收集蟛蜞菊霜霉病葉背面的霉層，利用真菌DNA抽提試劑盒(貨號：D3390-04，Omega Bio-Tek)提取病原菌的DNA。使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3′)進行ITS序列擴增(Rajaetal.,2017)；引物L(fēng)R0R(ACCCGCTGAACTTAAGC)和LR7(TACTACCACCAAGATCT)進行LSU序列的擴增(Mctaggartetal.,2015)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中Taq PCR Master Mix10 μL，模板DNA1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，16 ℃保存。

將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，如產(chǎn)物單一則對PCR產(chǎn)物直接進行回收、純化備用。將純化得到的PCR產(chǎn)物用試劑盒(貨號：D101，TAKARA)進行T克隆，操作方法：在微量離心管中分別加入pMD18-T載體1 μL，目標(biāo)DNA 4 μL和5 μL的溶液I，混勻后置于16 ℃過夜；將連接好的反應(yīng)體系全部加入到100 μL的JM109大腸桿菌的感受態(tài)細胞中混勻后，置于冰上放置30 min，再將其置于42 ℃下熱激45 s，然后在冰中放置1 min，加入890 μL LB(luria-bertani)培養(yǎng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min，將培養(yǎng)液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取白色菌落，使用菌落PCR法確定載體中插入片段的長度大小，選取6個正確的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序得到ITS和LSU序列。

將獲得的ITS和LSU序列分別在NCBI網(wǎng)上進行序列比對，下載與之相似性高的相關(guān)序列，以馬鈴薯晚疫病菌致病疫霉Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary和荔枝霜疫霉PeronophythoralitchiiChen ex Koetal.作為外圍群，應(yīng)用MEGA 7系統(tǒng)發(fā)育軟件的最大似然法(Kumaretal.,2016)分別構(gòu)建基于 LSU和ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中自展支持重復(fù)1000次。根據(jù)向日葵霜霉病菌P.halstedii(Farl.) Berl.& De Toni的ITS結(jié)構(gòu)分析方法(Springetal.,2006； Thinesetal.,2005)，結(jié)合序列的同源比對結(jié)果，對分離自南美蟛蜞菊上的霜霉病菌ITS序列進行結(jié)構(gòu)注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查結(jié)果

病害調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南美蟛蜞菊霜霉病在廣州火爐山、白云山和天鹿湖等森林公園零星發(fā)生，但在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)發(fā)生較嚴重，發(fā)病較重的地塊發(fā)病率可達50%～70%，病情指數(shù)達30～35，病害嚴重限制了發(fā)病植株下部葉片的生長。病害一般發(fā)生在植株下部蔭避區(qū)，發(fā)病初期葉子正面出現(xiàn)不規(guī)則的淡黃色病斑，病健交界處清晰可見，病斑直徑1.0～5.5 mm(圖1A)，葉背面出現(xiàn)清晰可見的白色霉層(圖1B、C)。發(fā)病后期葉面病斑變灰褐色，葉片病組織變薄并壞死(圖1D)，直至整個葉片逐漸死亡，葉背面霉層消失。

圖1 南美蟛蜞菊霜霉病癥狀Fig.1 Symptoms of downy mildew on S. trilobata A：病害葉部癥狀(正面); B和C：病害葉部癥狀(背面); D：病害在田間的癥狀。 A: Disease symptoms on leaf (upside); B and C: Disease symptoms on leaf (downside); D: Disease symptoms in the field.

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)特征

由圖2可見，南美蟛蜞菊霜霉病病原孢囊梗從氣孔伸出，無色，有隔膜，常為直角或近直角的單軸分枝，長260.0～500.0 μm，寬12.0～13.5 μm，孢囊梗單軸分枝3次，分枝寬6.5～8.5 μm，分枝末端較尖細。孢子囊著生在孢囊梗上，呈橢圓形或卵圓形，乳突不明顯，表面光滑，無色，大小(長×寬)為(17.5～25.0) μm× (12.0～18.0) μm。根據(jù)寄生在菊科植物上的霜霉病菌記錄，共有3種單軸霉屬菌物，分別是寄生在蒼耳XanthiumsibiricumPatrin ex Widder上的蒼耳單軸霉P.angustiterminalisNovot.、寄生在向日葵HelianthusannuusL.和金光菊RudbeckialaciniataL.上的向日葵單軸霉P.halstedii和澳大利亞報道的寄生在南美蟛蜞菊上的蟛蜞菊單軸霉P.sphagneticolaeMetaggart & R.G.Shivas (余永年,1998; Komjátietal.,2007; Leeetal.,2020; Mctaggartetal.,2015)。本菌孢囊梗比向日葵單軸霉的稍短，游動孢子囊更趨近于圓形且較小，與寄生在菊科植物上的另外2種單軸霉形態(tài)非常相近，根據(jù)其寄主擬鑒定為蟛蜞菊單軸霉。

圖2 南美蟛蜞菊霜霉病病原形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of P. sphagneticolae parasitic on S. trilobata A：具分枝的孢囊梗；B：游動孢子囊。 A: Sporangiophore with branches; B: Sporangia.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

克隆測序得到南美蟛蜞菊霜霉病病原物的LSU序列(GenBank 登錄號：MW298155)，在NCBI網(wǎng)上進行序列比對，結(jié)果顯示：本菌(2-LSU)與來自澳大利亞的南美蟛蜞菊上霜霉病菌P.sphagneticolae相似性最大，達到99.86%。而基于LSU序列的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖3)顯示，本菌與寄生在菊科植物向日葵和金光菊上的向日葵單軸霉同樣緊密地聚在一個分枝上，與寄生菊科植物蒼耳上的蒼耳單軸霉和牛蒡Arctotissp.上的馬氏單軸霉P.majewskiiConstant.& Thines以及寄生于傘形科植物上的細葉芹單軸霉P.chaerophylli(Casp.) Trotter和雪白單軸霉P.nivea(Unger) Schr?t.較遠地聚在一枝，且自展支持率較低。致病疫霉和荔枝霜疫霉在LSU系統(tǒng)發(fā)育分析中與單軸霉屬的其他種在最外圍聚在一起。

圖3 基于LSU序列單軸霉屬真菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree obtained from a maximum likelihood analysis of the LSU region

對寄生在不同科屬植物上的單軸霉ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖4)顯示，有3個自展支持率較高的分枝：分枝Ⅰ將本菌(ITS序列的登錄號：MW306664)與寄生在菊科植物上的向日葵單軸霉和蒼耳單軸霉聚在一起，說明這3個菌株親緣關(guān)系密切，然而，同源比對結(jié)果顯示，本菌與向日葵單軸霉ITS序列相似度只有89%，與蒼耳單軸霉相似度為78%；分枝Ⅱ?qū)⑶秩緜阈慰浦参锏募毴~芹單軸霉和雪白單軸霉聚在一枝；分枝Ⅲ是侵染牻牛兒苗科老鸛草屬植物的4個不同種的單軸霉(老鸛草單軸霉P.geranii(Peck) Berl.& De Toni, 林生老鸛草單軸霉P.geranii-sylvaticiS?vul.& O.S?vul., 微小單軸霉P.pusilla(de Bary) J.Schr?t.和威氏單軸霉P.wilsoniiVoglmayr, Fatehi & Constant.)。由此可見，除了侵染鳳仙花的鳳仙花單軸霉P.obducens(J.Schr?t.) J.Schr?t.和侵染葡萄的葡萄生單軸霉P.viticola(Berk.& M.A.Curtis) Berl.& De Toni在較遠的地方與侵染菊科植物的單軸霉聚在一枝外，ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析可以較好地區(qū)分寄生在不同科屬植物上的單軸霉，并且不與外圍群聚在一個分枝上。

2.4 序列結(jié)構(gòu)及相似性比較分析

通過對來自南美蟛蜞菊和向日葵上的霜霉病菌rDNA-ITS序列進行同源比對，構(gòu)建該序列結(jié)構(gòu)示意圖，結(jié)果(圖5)顯示，本研究克隆測序得到蟛蜞菊霜霉病菌ITS序列長為2228 bp，ITS2含有3個重復(fù)的序列(PsR1-PsR3)，該結(jié)構(gòu)與來自向日葵霜霉病菌的ITS序列相似，不同的是后者含有4個重復(fù)序列(PhR1-PhR4)。正因為含有多個重復(fù)序列才使得這2種病原菌的ITS序列顯著長于其他病原菌的ITS序列。二者重復(fù)序列相似度比較結(jié)果如表1所示，蟛蜞菊霜霉病菌ITS序列自身的重復(fù)序列相似度達90%以上，而與向日葵霜霉病菌ITS的重復(fù)序列相似度為83.4%～89.0%，平均為85.9%，可見二者重復(fù)序列之間還有一定的差異。在ITS序列注釋的基礎(chǔ)上，結(jié)合ITS序列和LSU序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，本研究認為,獲得的南美蟛蜞菊霜霉病菌與向日葵霜霉病菌分屬不同的種，根據(jù)寄主的屬及形態(tài)特征將其鑒定為蟛蜞菊單軸霉P.sphagneticolae。

圖4 基于ITS序列單軸霉屬真菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogram obtained from a maximum likelihood analysis of ITS sequences of P. species

圖5 蟛蜞菊單軸霉和向日葵單軸霉ITS序列結(jié)構(gòu)Fig.5 ITS sequence structures of P. sphagneticolae and P. halstedii ITS序列包括ITS1區(qū)、5.8S 核糖體DNA區(qū)和ITS2區(qū)。向日葵單軸霉ITS序列結(jié)構(gòu)引自Thines et al. 2005. PsR1-PsR3代表蟛蜞菊單軸霉ITS2區(qū)中的重復(fù)序列，PhR1-PhR4代表向日葵單軸霉ITS2區(qū)中的重復(fù)序列。 ITS sequence includes ITS1 region, 5.8S ribosomal DNA and ITS2 region.Structure of the ITS sequence in P. halstedii according to Thines et al. 2005.PsR1-PsR3, repetitive units of ITS2 from P. sphagneticolae； PhR1-PhR4, repetitive units of ITS2 from P. halstedii .

表1 蟛蜞菊單軸霉和向日葵單軸霉ITS2區(qū)序列相似性Table 1 Sequence similarity of repetitive units of ITS2 region in P. sphagneticolae and P. halstedii

3 討論

LSU序列分析結(jié)果顯示，來自廣東的南美蟛蜞菊霜霉病菌與澳大利亞的南美蟛蜞菊霜霉病菌緊密地聚在一起，并且與向日葵單軸霉以較高的自展支持率聚在一個分枝上，同時與寄生菊科植物上的蒼耳單軸霉和馬氏單軸霉以及非菊科植物上的單軸霉聚在同一個分枝上，但自展支持率較低。這一結(jié)果與來自澳大利亞的南美蟛蜞菊霜霉病菌LSU序列系統(tǒng)發(fā)育分析一致(Mctaggartetal.,2015)，說明LSU系統(tǒng)發(fā)育分析不能將南美蟛蜞菊霜霉病菌與其他寄生在菊科植物上和非菊科植物上的霜霉菌區(qū)分開。故在此基礎(chǔ)上進行ITS序列分析，結(jié)果表明，分自菊科向日葵族(南美蟛蜞菊、向日葵和蒼耳)的單軸霉以較高的自展支持率聚在一個大的分枝中，并且在較小的分枝水平上不同的種也能被很好地區(qū)分開來，說明來自菊科向日葵族植物上的單軸霉親緣關(guān)系緊密。其ITS2序列的結(jié)構(gòu)分析表明，南美蟛蜞菊霜霉病菌與向日葵霜霉病菌重復(fù)序列之間的平均相似性只有85.9%，而同一菌內(nèi)的重復(fù)序列相似性達到90%以上。而蒼耳單軸霉的ITS2區(qū)也含有多個重復(fù)序列，且與向日葵單軸霉ITS2區(qū)的重復(fù)序列同源，致使其ITS2長達2815 bp(Komjtietal.,2007)。鑒于來自向日葵族的單軸霉ITS2區(qū)均含有多個同源的重復(fù)序列，但不同種的重復(fù)序列數(shù)不同，且重復(fù)序列不同會導(dǎo)致病原菌的致病型發(fā)生改變(Springetal.,2006)，再結(jié)合病原菌的形態(tài)特征比較結(jié)果，本研究將采自廣東廣州的南美蟛蜞菊霜霉病病原鑒定為蟛蜞菊單軸霉。

據(jù)統(tǒng)計，除了本研究鑒定的蟛蜞菊單軸霉，已報道寄生在菊科植物上的單軸霉屬菌物還包括侵染向日葵和金光菊的向日葵單軸霉、侵染蒼耳的蒼耳單軸霉、侵染牛蒡?qū)僦参锏鸟R氏單軸霉等(Choietal.,2009; Leeetal.,2020; Mctaggartetal.,2015; Riveraetal.,2014)。在本研究中，雖然LSU系統(tǒng)發(fā)育分析將寄生在菊科植物上的單軸霉屬菌物聚在一個分枝上，但不能區(qū)分寄生在其他科植物上的單軸霉，且自展支持率較低，表明單獨LSU序列分析不足以進行單軸霉屬種的分子鑒定。而ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析能夠清晰地區(qū)分來自不同科植物的單軸霉，雖然GenBank數(shù)據(jù)庫中很多單軸霉屬的種缺乏ITS序列，但本研究認為，相比LSU序列，ITS序列更適用于單軸霉屬的種類鑒定。本研究中，系統(tǒng)發(fā)育分析也支持單軸霉屬菌物屬于多譜系的霜霉菌這一論點，認為其可以侵染多種科屬的寄主植物(Thinesetal.,2009)。基于ITS序列結(jié)構(gòu)分析，本研究支持將侵染菊科向日葵族植物的單軸霉屬細分成多個小種，而不是只有一個大種：向日葵單軸霉(Choietal.,2009)。更多侵染菊科植物的霜霉病菌ITS序列的克隆和種的鑒定有待進一步研究。

利用天敵昆蟲和病原限制其寄主植物的生長和蔓延是一種較為理想的入侵植物生物防控方法。比如利用擬銹病菌SynchytriumsolstitialeWidmer防治美國西部的一種入侵雜草黃矢車菊CentaureasolstitialisL.(Eskandarietal., 2011)，利用薇甘菊頸盲蝽PachypeltismicranthusMu & Liu和薇甘菊柄銹菌Pucciniaspegazzinide Toni防治我國的外來入侵植物薇甘菊MikaniamicranthaKunth(李志剛等，2006；李云琴等，2019)。這些天敵昆蟲和病原菌都具有一定的?；裕潭ㄈ∈郴蚣纳谙薅ǖ募闹髦参锷?，病原菌也不能人工培養(yǎng)，但其是一種對非寄主的本土植物友好且安全的生防資源。本研究鑒定的蟛蜞菊單軸霉也是一種典型的專性寄生菌，雖不能人工培養(yǎng)，但作為國內(nèi)南美蟛蜞菊上發(fā)現(xiàn)的第一個天然發(fā)生的病害病原，該菌極具生防潛力。然而，其擴大培養(yǎng)方案和致病寄主范圍等還需進一步研究。