QuEChERS結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定 荔枝龍眼中3種農(nóng)藥及代謝物殘留

王思威，王瀟楠，常虹，孫海濱*，劉艷萍*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室，廣東廣州 510640） （2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省昆蟲行為調(diào)控工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642）

荔枝和龍眼均是我國南方特色經(jīng)濟(jì)水果，中國也是荔枝龍眼年產(chǎn)量最大的國家[1,2]。荔枝以富含豐富的維生素、多糖、黃酮等營養(yǎng)和功能成分著稱[3]；龍眼以富含多酚類和黃酮類物質(zhì)，而被譽(yù)為“第七類營養(yǎng)素”[4,5]。目前我國荔枝和龍眼上登記農(nóng)藥種類極少，荔枝登記有效成分48種（殺蟲劑10種，殺菌劑23種，除草劑1種，植物生長調(diào)節(jié)劑14種），龍眼僅登記6種有效成分（殺蟲劑2種，殺菌劑1種，植物生長調(diào)節(jié)劑3種）[6]。苯醚甲環(huán)唑?qū)儆谌蝾悮⒕鷦哂袃?nèi)吸性，麥角甾醇生物合成抑制劑，具有很好保護(hù)和治療作用[7]，在荔枝上已登記，是防治炭疽病的主要藥劑；氯蟲苯甲酰胺是美國杜邦公司開發(fā)的首個具有新型鄰酰胺基苯甲酰胺類化學(xué)結(jié)構(gòu)的廣譜殺蟲劑[8]，溴氰蟲酰胺是杜邦公司開發(fā)的第二代魚尼丁受體抑制劑類殺蟲劑[9]，溴氰蟲酰胺未在荔枝龍眼上登記，但在生產(chǎn)中多用來防治荔枝蒂蛀蟲等蟲害。由于荔枝龍眼上已登記的農(nóng)藥數(shù)量極少，農(nóng)藥大劑量、多頻次的使用導(dǎo)致荔枝龍眼園中病蟲害抗性提高[10,11]；荔枝龍眼上農(nóng)藥不規(guī)范使用，不僅可引起果品中農(nóng)藥殘留污染、超標(biāo)問題，同時也對環(huán)境生物產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致對蜜蜂、家蠶等的毒性為中毒或高毒[12,13]。由此引起的果品質(zhì)量安全問題和環(huán)境問題值得關(guān)注。

截至2021年8月，關(guān)于苯醚甲環(huán)唑的檢測分析方法有氣相色譜法（GC-ECD）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[14,15]，前處理方法主要有玻璃層析柱凈化、SPE柱凈化、QuEChERS凈化等[16-18]；氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺母體的檢測方法有液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），前處理方法包含SPE凈化和QuEChERS凈化等[19-24]；溴氰蟲酰胺代謝物J9Z38的檢測方法為LC-MS/MS[25]。填充柱和固相萃取小柱凈化需要大量的有機(jī)溶劑，費時且操作繁瑣。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）法具有簡便、快速、廉價、高效、實用性強(qiáng)等優(yōu)勢，且有機(jī)溶劑用量少，并可根據(jù)不同樣品基質(zhì)選擇吸附劑種類來消除雜質(zhì)干擾，是當(dāng)前常用的凈化手段[26,27]。LC-MS/MS方法靈敏度高，適用性強(qiáng)，分析時間短，且可同時實現(xiàn)定性定量檢測，適于普及和推廣[28]。由于上述3種農(nóng)藥及代謝物未見在荔枝龍眼中同時檢測分析方法報道，通過建立荔枝龍眼中苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38的分析方法，可為3種農(nóng)藥的膳食暴露風(fēng)險評價和對環(huán)境指示生物的風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

本研究采用QuEChERS前處理方法凈化樣品，HPLC-MS/MS作為檢測儀器同時分析荔枝龍眼中苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38殘留，該方法具有較高靈敏度和良好準(zhǔn)確度，且操作簡便快速，能夠滿足分析檢測要求，填補(bǔ)了荔枝龍眼中3種農(nóng)藥及代謝物同時檢測分析的空白，為荔枝龍眼中農(nóng)藥殘留安全性分析評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津8045三重四級桿質(zhì)譜儀，（配電噴霧離子源ESI），日本島津公司；島津LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；Milii-Q超純水機(jī)，美國Millipore公司；GTR22-1離心機(jī)，北京時代北利離心機(jī)有限公司；XW-80A渦旋儀，上海精科有限公司。

乙腈和甲醇（色譜純），美國Fisher公司；甲酸（色譜純），美國Fluka公司；無水硫酸鎂、氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）和N-丙基乙二胺吸附劑（PSA），均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；納米氧化鋯，上海阿拉丁生物科技有限公司；多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，純度95%，長度10～30 μm，粒徑8 nm），南京先豐納米材料科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品：苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.9%，德國Ehrenstorfer GmbH公司；氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品純度為97.8%，德國Ehrenstorfer GmbH公司；溴氰蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品純度為98.0%，加拿大Toronto Research Chemicals公司；溴氰蟲酰胺代謝物J9Z38標(biāo)準(zhǔn)品純度為97.8%，杭州創(chuàng)引化工科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.1 mg）至4個10 mL容量瓶中，分別加入乙腈溶解，定容至刻度，搖勻，配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，在4 ℃冰箱中避光保存，待用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確吸取1 mL的苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封后4 ℃冰箱中避光保存，有效期6個月。

1.3 樣品前處理

將荔枝或龍眼樣品切碎，然后勻漿，形成均一的試樣。分別準(zhǔn)確稱取荔枝和龍眼全果試樣各10 g（精確至0.01 g），加入50 mL離心管中，用10 mL乙腈進(jìn)行提取，渦旋1 min，加入2 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈振蕩，再渦旋1 min，然后以5000 r/min離心2 min。取2 mL上清液，加入裝有0.3 g無水硫酸鎂、0.010 g Nano-ZrO2、0.050 g PSA和0.050 g C18的離心管中，劇烈振蕩，渦旋1 min，以10000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待HPLC-MS/MS檢測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：安捷倫InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色譜柱（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；流速為0.3 mL/min；流動相A（0.1%甲酸水溶液），B（乙腈），進(jìn)行梯度洗脫，具體程序為：0～2 min 80% A～5% A，2～3.5 min 5% A，3.5～4.5 min 20% A，4.5～6 min 20% A。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI+；掃描模式為MRM模式；接口溫度：300 ℃；DL溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；接口電壓：4000 V；霧化氣流量：3.0 L/min；干燥氣和加熱氣流量：10.0 L/min。其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectra parameters of difenoconazole, chlorantraniliprole, cyantraniliprole and its metabolite

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

目前，查閱大量文獻(xiàn)報道，發(fā)現(xiàn)QuEChERS前處理方法中最常用的有機(jī)提取溶劑為丙酮、乙酸乙酯和乙腈。丙酮在沒有非極性溶劑存在的條件下，不能與水進(jìn)行分離，而且丙酮容易將基質(zhì)中的色素等雜質(zhì)提取，共萃取現(xiàn)象極其嚴(yán)重[29]；乙酸乙酯在提取極性農(nóng)藥時提取效率較低，且易發(fā)生乳化現(xiàn)象；乙腈易與水分離，且提取的雜質(zhì)相對較少，是目前QuEChERS方法中最常用的提取溶劑[30]，因此，本試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 吸附劑的選擇和用量

探討了QuEChERS前處理方法中常用凈化劑（Nano-ZrO2、PSA、C18、GCB、MWCNTs）對苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38的吸附效果及回收率的影響，結(jié)果見圖1。通過查閱大量文獻(xiàn)[26,27,31,32]，發(fā)現(xiàn)MWCNTs對農(nóng)藥的吸附性較強(qiáng)，用量一般在5～10 mg范圍，GCB、PSA、C18等的用量一般為50 mg，因此，本試驗參照文獻(xiàn)用量進(jìn)行。結(jié)果顯示：當(dāng)MWCNTs用量在5～10 mg范圍時，4種目標(biāo)化合物的回收率在1.43%～25.71%，其中對溴氰蟲酰胺代謝物J9Z38的吸附最嚴(yán)重；50 mg GCB吸附劑對4種目標(biāo)化合物的回收率也均較低（17.11%～35.94%），因此不宜采用；50 mg PSA、50 mg C18和20 mg Nano-ZrO23種單一吸附劑，對4種目標(biāo)化合物的回收率均較好，均在90%以上。

荔枝龍眼的基質(zhì)較復(fù)雜，單一吸附劑對共提取雜質(zhì)的凈化效果遠(yuǎn)弱于混合吸附劑，因此考慮選擇PSA、C18和Nano-ZrO2不同吸附劑的組合，C18吸附劑具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)勢，可去除基質(zhì)中的脂肪、脂類等非極性干擾物；PSA屬于弱陰離子交換填料，可有效去除基質(zhì)中脂肪酸、色素、糖類等物質(zhì)；納米氧化鋯（Nano-ZrO2）具有比表面積大、吸附容量大等優(yōu)點，是近年來常用的凈化劑。上述吸附劑組合可較好的去除樣品中色素、糖等干擾雜質(zhì)。在吸附劑選擇試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，考察組合Ⅰ（50 mg PSA+20 mg Nano-ZrO2），組合Ⅱ（50 mg C18+20 mg Nano-ZrO2），組合Ⅲ （50 mg PSA+50 mg C18+20 mg Nano-ZrO2）和組合Ⅳ（50 mg PSA+50 mg C18+10 mg Nano-ZrO2）等4種吸附劑組合對上述4種化合物的回收率情況，結(jié)果見圖2、表2。實驗結(jié)果表明，上述復(fù)配組合Ⅰ-Ⅳ均可滿足實驗回收率要求，回收率在85.81%～105.73%。綜合考慮實驗成本、凈化效果等因素，最終選擇組合Ⅳ 50 mg C18+50 mg PSA+10 mg Nano-ZrO2作為復(fù)配吸附凈化劑用于荔枝和龍眼樣品基質(zhì)凈化。文獻(xiàn)中有關(guān)上述4種目標(biāo)化合物的吸附劑選擇有香蕉基質(zhì)用PSA+C18聯(lián)合凈化[29]、梨基質(zhì)未經(jīng)凈化直接進(jìn)樣[33]、蔬菜基質(zhì)用PSA單一吸附劑凈化[19]、水果基質(zhì)用PSA+C18+硅藻土聯(lián)合凈化[20]等報道，由于不同基質(zhì)的雜質(zhì)情況不同，如梨和香蕉基質(zhì)相對較簡單，主要為水分和糖分等，色素干擾較少，凈化步驟可省略；但部分水果和蔬菜的基質(zhì)相對較復(fù)雜，尤其是大量色素等共萃取雜質(zhì)的存在，可嚴(yán)重干擾目標(biāo)物的定量分析，因此其凈化步驟尤為重要，可直接影響目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確度和靈敏度。

表2 四種吸附劑組合對目標(biāo)化合物回收率的顯著性分析Table 2 Analysis of Significant of four adsorption combination to targeted compounds

2.2 色譜柱的選擇

比較了3種不同長度色譜柱對4種目標(biāo)物的分離效果。A（Shim-pack GIST-HP C18，50 mm）、B（InfinityLab Poroshell C18，75 mm）和C（Poroshell-120 EC-C18，150 mm），譜圖見圖3。其中色譜柱A的分析時間較短，但對目標(biāo)農(nóng)藥的響應(yīng)值及峰型對稱性略差；色譜柱C屬于長柱，目標(biāo)分析物的出峰時間相對較長，且有拖尾現(xiàn)象，影響定量結(jié)果；色譜柱B分析時間略長于A柱，但明顯短于C柱，目標(biāo)物的響應(yīng)值和峰型均較好。因此，選擇InfinityLab Poroshell C18作為本試驗的色譜分離柱。

2.3 流動相的選擇

選用2.2中75 mm色譜分離柱，探討甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等4種流動相組合對目標(biāo)化合物的分離度和響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示：有機(jī)相選用甲醇時，苯醚甲環(huán)唑存在峰型不對稱、峰展寬等問題，且響應(yīng)強(qiáng)度較乙腈低；流動相選用乙腈時，通過在水相中加入0.1%甲酸，可促進(jìn)[M+H]＋離子峰的形成，提高目標(biāo)物的分析靈敏度，尤其提高了峰型對稱性。因此，本研究的色譜流動相選用乙腈-0.1%甲酸水系。

2.4 流動相等度洗脫和梯度洗脫比較

選用乙腈-0.1%甲酸水系作為流動相，探討了等度洗脫和梯度洗脫對目標(biāo)化合物分離度和響應(yīng)值的影響，見圖4。結(jié)果顯示梯度洗脫不僅提高了4種目標(biāo)農(nóng)藥的響應(yīng)值，而且峰型十分對稱，可有效將雜質(zhì)與目標(biāo)化合物分離，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過查閱大量文獻(xiàn)，明確了4種目標(biāo)化合物在正離子模式下分析。為提高目標(biāo)化合物的離子化效率，對源內(nèi)參數(shù)開展了優(yōu)化實驗，相關(guān)色譜圖見圖5。在正離子模式下，對化合物進(jìn)行全掃描分析，一級質(zhì)譜掃描可獲取[M+H]+分子離子，以此來確定目標(biāo)分析物的母離子；然后再進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，獲取產(chǎn)物離子，最后在MRM模式下對4種目標(biāo)化合物的CE、Q1 Pre偏差、Q3 Pre偏差等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的色譜圖不論是峰型對稱性還是響應(yīng)值均好于優(yōu)化前。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是液質(zhì)分析定量結(jié)果準(zhǔn)確性的最重要影響因素。本試驗采用下式計算基質(zhì)效應(yīng)：ME(%)=［(mmatrix/msolvent)-1)］×100%，其中mmatrix為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，msolvent為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME為正值時，表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)可提高目標(biāo)物效應(yīng)；ME為負(fù)值時，表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，基質(zhì)可降低目標(biāo)物效應(yīng)；ME=0時，表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。表3實驗結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及其代謝物在荔枝龍眼中均存在基質(zhì)抑制作用，基質(zhì)效應(yīng)值在-79.12%～-33.54%，本實驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來校正基質(zhì)效應(yīng)。

表3 苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38在荔枝龍眼中的加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限、定量限等參數(shù)Table 3 Matrix effect, recoveries, RSDs, LOD, LOQ and other parameters of difenoconazole, chlorantraniliprole, cyantraniliprole and its metabolite J9Z38 in litchi and longan samples (n=5)

2.7 方法學(xué)評價

2.7.1 線性范圍、檢出限與定量限

在1～100 μg/kg濃度范圍內(nèi)，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，其所對應(yīng)的目標(biāo)化合物的響應(yīng)值（y）為縱坐標(biāo)作圖，得到苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程，線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。根據(jù)歐盟文件SANTE/11813/2017規(guī)定，當(dāng)最小添加水平回收率滿足70%～120%及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%時，定量限（LOQ）可以為最小添加水平。本方法對苯醚甲環(huán)唑的LOQ為0.1 μg/kg，低于稻米[34]（10 μg/kg）、梨[33]（10 μg/kg）和香蕉[29]（40 μg/kg）中的報道值；氯蟲苯甲酰胺LOQ為1 μg/kg，均低于茶葉[35]（5 μg/kg）、水果[31]（17.2 μg/kg）等基質(zhì)中的報道值；溴氰蟲酰胺LOQ分別為1 μg/kg，均低于南瓜[36]（10 μg/kg）、藍(lán)莓[24]（6 μg/kg）等基質(zhì)中的報道值，說明本文建立的分析方法具有較低的靈敏度，可適用于荔枝龍眼樣品的痕量分析。

2.7.2 回收率與精密度

在荔枝龍眼的空白樣品中分別添加10、50、100 μg/kg 3個濃度水平的4種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個 加標(biāo)水平重復(fù)5次，并作空白對照，具體結(jié)果見表3。4種目標(biāo)物在荔枝龍眼中的加標(biāo)回收率為82.48%～ 99.17%，日間和日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為4.11%～7.77%和6.10%～13.27%。荔枝空白樣品加標(biāo)的色譜圖見圖6。本方法具有較高的回收率和良好的精密度，可滿足荔枝和龍眼樣品檢測要求。

2.8 方法的應(yīng)用

采用本方法對市場中隨機(jī)購買的20份荔枝龍眼樣品進(jìn)行檢測，具體結(jié)果見表4。苯醚甲環(huán)唑和氯蟲苯甲酰胺在荔枝龍眼中均有檢出，溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38的殘留量均未檢出。僅苯醚甲環(huán)唑在荔枝上有最大殘留限量值（MRLs）[37]，所測實際樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留量低于MRLs。

表4 4種目標(biāo)分析物在荔枝龍眼實際樣品中的殘留量（mg/kg）Table 4 Residues of four targeted compounds in real litchi and longan samples (mg/kg)

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS結(jié)合HPLC-MS/MS同時測定苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38在荔枝龍眼基質(zhì)中的檢測方法，該方法有較好的檢測靈敏度和準(zhǔn)確度。樣品前處理過程操作簡便，回收率高，檢出限低，滿足定性和定量要求，適用于荔枝龍眼中苯醚甲環(huán)唑、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺及代謝物J9Z38定性定量分析要求，可為上述農(nóng)藥在荔枝龍眼中的風(fēng)險監(jiān)控提供有效的技術(shù)支持。