蒜氨酸體外抗菌機制的研究*

裴天容，李明強

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，貴州 遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學(xué)微免實驗室，貴州 遵義 563003)

大蒜為百合科，蔥屬植物的地下鱗莖，早期以食物調(diào)味劑進入人們的生活，已有千年歷史。大蒜素抗菌作用開啟了大蒜生物活性成分的研究進程，大蒜素具有抗菌、抗腫瘤、抗衰老、降低血脂血糖、調(diào)節(jié)免疫功能、防治心血管疾病、改善血液循環(huán)等多種生物學(xué)活性[1-4]。大蒜素包括二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物、二烯丙基四硫化合物等幾種含硫化合物，具有獨特的臭味和刺激性，均為脂溶性物質(zhì)[5]。大蒜素脂溶性特征導(dǎo)致大蒜素注射液配制必須使用有機溶劑、助溶劑、增溶劑等，故而帶來了不良反應(yīng)[6]。局部高濃度大蒜素的刺激性引起局部組織炎性反應(yīng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞受損[7-8]，以致大蒜素注射液臨床應(yīng)用受限，療效達不到預(yù)期效果。為此人們將目光轉(zhuǎn)移到大蒜素前體物質(zhì)——水溶性蒜氨酸。蒜氨酸與蒜酶同時使用引起蒜氨酸的藥理作用研究，在進行蒜氨酸藥理作用研究過程中采用蒜氨酸、蒜氨酸加蒜酶、大蒜素進行對比實驗發(fā)現(xiàn)，蒜氨酸的藥理作用顯著低于蒜氨酸加蒜酶、大蒜素的藥理作用[9-11]。同時，蒜氨酸與蛋白非特異性結(jié)合影響實驗結(jié)果[12]，影響人們對蒜氨酸的研究進程，更未見蒜氨酸體外抗菌機制的相關(guān)文獻報道。本研究探討了蒜氨酸在機體外的抗菌機制，以提高人們對蒜氨酸的認(rèn)識，旨在為推動蒜氨酸的開發(fā)研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料 2020年3月從農(nóng)貿(mào)市場購買紫皮大蒜參照文獻[13]方法分離提取蒜氨酸，分離的蒜氨酸經(jīng)化學(xué)分析、紫外光譜分析、紅外、質(zhì)譜和核磁共振波譜等鑒定結(jié)果與文獻[13]記載一致。配制成100 mg/mL蒜氨酸溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.4備用。菌種為金黃色葡萄球菌(金葡菌)CMCC(B)26003、白色葡萄球菌(白葡菌)CMCC(B)26101、大腸桿菌CMCC(B)44102、傷寒桿菌CMCC(B)50037等。杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液購于上海立菲生物技術(shù)有限公司(貨號：C11995500BT)，異硫氰酸熒光素(FITC)購于蘇州亞科科技股份有限公司(貨號：3326-32-7)，BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司(貨號:PC0020),青霉素購于中諾藥業(yè)有限公司(批號：0121804114)，二抗購于Sigma公司(貨號：G7402)。超薄切片機生產(chǎn)廠家為Leica(型號Leica UC7)，鉆石切片刀生產(chǎn)廠家為Daitome(型號Ultra 45°)，透射電子顯微鏡生產(chǎn)廠家為HITACHI(型號HT7800/HT7700)。

1.2方法

1.2.1微量稀釋法檢測蒜氨酸最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度 參照文獻[14]的方法，細(xì)菌用大腸桿菌、傷寒桿菌、金葡菌、白葡菌16 h斜面培養(yǎng)物，無菌生理鹽水洗下菌苔，配制成0.5個麥?zhǔn)蠁挝痪海儆肈MEM培養(yǎng)液進行20倍稀釋，調(diào)至5×105CFU/mL，1 h內(nèi)使用。蒜氨酸稀釋：用96孔板，每一塊板8排，每排12孔，每個蒜氨酸濃度40個復(fù)孔，22個濃度孔，大腸桿菌、傷寒桿菌、金葡菌、白葡菌4種細(xì)菌各做10個復(fù)孔。每孔加入DMEM培養(yǎng)液100 μL，從第1孔開始至第2排最后一孔，100 mg/mL蒜氨酸溶液100 μL加入第1孔，混勻后吸取100 μL加入第1孔混勻，倍比稀釋至第1排第10孔，第10孔混勻后吸取100 μL丟去，微量反應(yīng)板上對蒜氨酸濃度進行倍比稀釋，第1孔濃度為50 000 μg/mL，第2孔濃度為25 000 μg/mL，第3孔濃度為12 500 μg/mL，第4孔濃度為6 250 μg/mL，第5孔濃度為3 125 μg/mL，第6孔濃度為1 563 μg/mL，第7孔濃度為781.3 μg/mL，第8孔濃度為390.1 μg/mL，第9孔濃度為195 μg/mL，第10孔濃度為97.510 μg/mL，第11孔濃度為48.750 μg/mL，第12孔濃度為24.380 μg/mL，第13孔濃度為12.190 μg/mL，第14孔濃度為6.094 μg/mL，第15孔濃度為3.047 μg/mL，第16孔濃度為1.524 μg/mL，第17孔濃度為0.762 μg/mL，第18孔濃度為0.386 μg/mL，第19孔濃度為0.193 μg/mL，第20孔濃度為0.096 μg/mL，第21孔濃度為0.048 μg/mL，第22孔濃度為0.024 μg/mL，第23孔為陽性對照，第24孔為培養(yǎng)基對照。第1孔至第2排第11孔每孔加入上述準(zhǔn)備好的5×105CFU/mL菌液100 μL，第2排第11孔為細(xì)菌正常生長，陽性對照；第2排第12孔加入DMEM培養(yǎng)液100 μL為培養(yǎng)基對照，蓋好板蓋37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h觀察結(jié)果。24 h結(jié)果觀察后用接種環(huán)挑取1環(huán)培養(yǎng)液劃線接種平板培養(yǎng)基(血液瓊脂或伊紅美藍培養(yǎng)基)。抑菌試驗培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)72 h，分別收集第0孔至MIC孔培養(yǎng)液和陽性對照孔培養(yǎng)液，用熒光免疫技術(shù)檢測菌體表面結(jié)合蒜氨酸情況。

1.2.2免疫熒光檢測抑菌菌體表面蒜氨酸抗原

1.2.2.1FITC兔抗蒜氨酸熒光抗體的制備 利用本實驗室分離提取蒜氨酸免疫家兔制備多價抗體，參照文獻[15-17]進行抗體純化與FITC標(biāo)記。

1.2.2.2抗體純化 取蒜氨酸免疫兔血清50 mL用0.06 mol/L pH 4.0醋酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值為4.5。按每毫升血清逐滴加入正辛酸至終質(zhì)量濃度為25 μL/mL，室溫下充分?jǐn)嚢?0 min，10 000 r/min離心30 min取上清液，用0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)調(diào)節(jié)pH值至7.4，每毫升上述混合液加0.277 g固體硫酸銨，4 ℃攪拌30 min，5 000 r/min離心15 min，沉淀溶于0.005 mol/L氯化鈉溶液，裝入透析袋，置相同溶液中透析，每6 小時更換透析液1次，直至用奈氏試劑檢測透析液中無銨離子存在。采用BCA蛋白測定試劑盒測定抗體蛋白質(zhì)量濃度，并調(diào)整質(zhì)量濃度為1 mg/mL球蛋白。

1.2.2.3FITC標(biāo)記抗體 取抗體蛋白總量為1 mg適量溶液用0.3 mol/L碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)抗體溶液pH值至9.0，加入適量二甲基亞砜溶解FITC至終質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，于室溫避光振蕩反應(yīng)1 h，再加入1 mL DPBS、1 mL 4%聚乙二醇8000和1 mL 3%氯化鈉沉淀標(biāo)記的抗體，5 000 r/min離心15 min，重復(fù)2次。用0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶解沉淀即為FITC標(biāo)記的家兔抗蒜氨酸抗體。

1.2.2.4蒜氨酸抗原檢測 采用微量稀釋法經(jīng)72 h培養(yǎng)后用無菌吸管吸取板孔中培養(yǎng)液于小試管中，1 000 r/min離心10 min，取上清液于10 mL離心管中，加入甲醛溶液至終濃度10%，室溫靜置30 min，4 000 r/min離心20 min，棄上清液留取沉淀，用生理鹽水洗滌3次，用100 μL pH 7.4 PBS分散細(xì)菌，涂片、干燥、甲醇固定。在涂片上加入FITC兔抗蒜氨酸熒光抗體，濕盒中37 ℃培養(yǎng)1 h，用pH 7.4 PBS沖洗干凈，冷風(fēng)吹干，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3免疫電鏡觀察蒜氨酸在菌體內(nèi)的分布

1.2.3.1標(biāo)本準(zhǔn)備 大腸桿菌和金葡菌12 h斜面培養(yǎng)物，用生理鹽水洗下菌苔，4 000 r/min離心20 min，離心洗滌3次，配制成9×109個/mL細(xì)菌濃度，分別分為2份，一份按每毫升加入100 mg/mL蒜氨酸溶液0.2 mL充分混勻，靜置30 min，加入甲醛溶液至終濃度為10%，靜置30 min，4 000 r/min離心20 min，離心洗滌3次，配制成9×1010個/mL細(xì)菌濃度，為蒜氨酸陽性標(biāo)本。另一份不加蒜氨酸處理，作為陰性對照。2份均4 000 r/min離心20 min，沉淀物用免疫電鏡固定液固定。標(biāo)本經(jīng)清洗、脫水、樹脂滲透、包埋、聚合等處理后進行70～80 nm超薄切片予4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2免疫標(biāo)記 鎳網(wǎng)從4 ℃取出用超純水懸浮5 min，清洗、封閉后加入1∶5稀釋的兔抗蒜氨酸抗體覆蓋標(biāo)本后4 ℃過夜孵育；室溫復(fù)溫后用三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗3次，每次5 min；加入二抗，室溫孵育 20 min后轉(zhuǎn)37 ℃烘箱孵育 1 h，然后轉(zhuǎn)室溫復(fù)溫0.5 h。實驗過程中防止干片。用三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗5次，每次5 min，超純水清洗5次，每次5 min；采用鈾復(fù)染后用70%乙醇清洗3次，超純水清洗3次；烘干，透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像，黑色10 nm大小的金顆粒即為陽性表達。

2 結(jié) 果

2.1蒜氨酸體外抗菌結(jié)果 采用微量稀釋法培養(yǎng)24 h，4種細(xì)菌光密度(OD)值均呈現(xiàn)以第1孔最高，逐漸下降至OD值最低；大腸桿菌最低OD值為第14孔(1.16±0.09)，傷寒桿菌最低OD值為第13孔(0.94±0.06)，金葡菌最低OD值為第17孔(0.15±0.02)，白葡菌最低OD值為第17孔(0.19±0.03)，然后又逐漸上升至陽性對照孔，形成一個V型曲線。見表1、圖1。4種細(xì)菌OD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較以最低OD值孔為蒜氨酸對該菌的MIC。同時，第14孔蒜氨酸稀釋濃度為6.094 μg/mL，加入菌液后的最終質(zhì)量濃度為3.047 μg/mL，因此，蒜氨酸對大腸桿菌的MIC值為3.047 μg/mL，由此蒜氨酸對傷寒桿菌的MIC值為6.094 μg/mL，對金葡菌和白葡菌MIC值均為0.386 μg/mL。96孔板培養(yǎng)24 h后用接種環(huán)于各孔挑取菌液劃線接種血平板和伊紅美藍培養(yǎng)基平板，經(jīng)培養(yǎng)24 h平板上均有相應(yīng)細(xì)菌生長。96孔板繼續(xù)培養(yǎng)72 h，大腸桿菌和傷寒桿菌第1孔至OD值最低孔的OD值均明顯低于陽性對照孔，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；最低孔至陽性對照孔OD值均繼續(xù)升高。金葡菌和白葡菌各孔OD值無明顯變化。見表1、圖2。在收集培養(yǎng)液時可見培養(yǎng)基pH明顯升高，酚紅指示劑顏色明顯變紅，可嗅到淡淡的大蒜素氣味。

表1 蒜氨酸體外抑菌試驗OD值

續(xù)表1 蒜氨酸體外抑菌試驗OD值

圖1 蒜氨酸抑菌試驗24 h OD值曲線圖

圖2 蒜氨酸抑菌試驗72 h OD值曲線圖

2.2菌體表面蒜氨酸抗原檢測結(jié)果 熒光顯微鏡下可見綠色熒光的菌體，見圖3。對照孔無綠色熒光出現(xiàn)。革蘭陰性菌的菌體表面熒光較革蘭陽性菌薄，熒光強度也弱于革蘭陽性菌。

2.3免疫電鏡觀察 蒜氨酸陽性標(biāo)本可見大腸桿菌和葡萄球菌菌體表面、細(xì)胞壁、細(xì)胞內(nèi)均有較多的黑色金顆粒，表明結(jié)合了較多的蒜氨酸，結(jié)合蒜氨酸處細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、菌體內(nèi)容物形態(tài)與陰性對照比較未見異常表現(xiàn)，陰性標(biāo)本未見黑色金顆粒。革蘭陽性球菌表面與細(xì)胞壁黑色金顆粒較革蘭陰性桿菌菌多,見圖4。

A:大腸桿菌;B:葡萄球菌。

A：大腸桿菌免疫電鏡蒜氨酸陽性結(jié)果；B：大腸桿菌免疫電鏡蒜氨酸陰性結(jié)果；C：金葡菌免疫電鏡蒜氨酸陽性結(jié)果；D：金葡菌免疫電鏡蒜氨酸陰性結(jié)果。

3 討 論

本研究采用微量稀釋法結(jié)果顯示，蒜氨酸對大腸桿菌MIC為3.047 μg/mL，對傷寒桿菌MIC值為6.094 μg/mL，對金葡菌和白葡菌MIC值均為0.386 μg/mL。蒜氨酸對4種細(xì)菌均無殺菌作用。

從微量稀釋法培養(yǎng)不同時間結(jié)果分析可見第1孔至OD值最低孔OD值升高是由于蒜氨酸與大分子蛋白結(jié)合產(chǎn)生乳白色沉淀所致，OD值最低孔至陽性對照孔OD值升高為細(xì)菌生長所致。培養(yǎng)72 h大腸桿菌和傷寒桿菌由于細(xì)菌緩慢生長，導(dǎo)致第1孔至OD值最低孔OD值均明顯低于陽性對照孔，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明第1孔至OD值最低孔蒜氨酸與蛋白結(jié)合出現(xiàn)乳白色結(jié)合物沉淀，導(dǎo)致OD值明顯升高，由于細(xì)菌生長繁殖消耗大量蒜氨酸后結(jié)合蒜氨酸減少，乳白色結(jié)合物降低，OD值明顯下降。最低孔OD值與陽性對照孔OD值持續(xù)升高，72 h也是持續(xù)升高，表明是細(xì)菌生長所致。革蘭陽性菌由于細(xì)胞壁厚而致密、蛋白含量高結(jié)合大量蒜氨酸，嚴(yán)重阻斷了細(xì)菌與環(huán)境的物質(zhì)交換，即使延長培養(yǎng)時間細(xì)菌也無生長表現(xiàn)。24 h培養(yǎng)物接種相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)鑒定出相應(yīng)細(xì)菌，說明蒜氨酸體外無殺菌活性。

在收集培養(yǎng)液時可嗅大蒜素氣味，也可見培養(yǎng)基pH升高，以大腸桿菌最為顯著。這是由于革蘭陰性菌細(xì)胞壁薄、脂質(zhì)含量高而蛋白含量較低，蒜氨酸阻斷細(xì)菌與環(huán)境的物質(zhì)交換的嚴(yán)重程度較低，細(xì)菌緩慢生長繁殖分解蒜氨酸產(chǎn)氨使培養(yǎng)基pH升高，產(chǎn)生的大蒜素濃度不足以殺死細(xì)菌，但可增強蒜氨酸抑菌作用，同時，大腸桿菌的營養(yǎng)要求較傷寒桿菌低，生長速度快于傷寒桿菌，提高了蒜氨酸對大腸桿菌的抑菌效果，致使蒜氨酸對大腸桿菌MIC值低于傷寒桿菌MIC值。

免疫電鏡下可見革蘭陰性桿菌表面熒光層較陽性菌薄，熒光強度弱于革蘭陽性球菌。免疫電鏡顯示革蘭陰性桿菌有較厚的外膜，黑色金顆粒較少；革蘭陽性球菌具有堅硬、厚實的細(xì)胞壁肽聚糖層，具有較多的黑色金顆粒，與免疫熒光檢測結(jié)果吻合。這是因為革蘭陰性細(xì)胞壁外膜脂質(zhì)含量高，革蘭陽性菌細(xì)胞壁蛋白含量高，蒜氨酸與蛋白質(zhì)非特異結(jié)合，所以，革蘭陽性菌黑色金顆粒較革蘭陰性菌多。由于蒜氨酸與細(xì)胞壁及外膜中蛋白結(jié)合，使蛋白空間構(gòu)象改變，從而改變了細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的通透性，阻斷了細(xì)菌與環(huán)境物質(zhì)交換，抑制了細(xì)菌生長、繁殖，以致革蘭陽性菌MIC值(0.386 μg/mL)顯著低于革蘭陰性桿菌MIC值(3.047 μg/mL)。免疫電鏡觀察到菌體內(nèi)均有黑色金顆粒，是因為蒜氨酸為小分子氨基酸類物質(zhì)，因被動轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞內(nèi)。同時，蒜氨酸與菌體內(nèi)功能蛋白(如酶蛋白)結(jié)合抑制細(xì)菌生命活動，具有較強的抑菌作用。由于革蘭陽性菌與革蘭陰性菌結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成不同，導(dǎo)致蒜氨酸與之結(jié)合存在差異，以致對不同細(xì)菌的抑菌作用也出現(xiàn)差異，與蒜氨酸MIC出現(xiàn)明顯差異的結(jié)果吻合。細(xì)菌菌體內(nèi)、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞器結(jié)合蒜氨酸處的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與陰性對照比較未見異常表現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌離開蒜氨酸環(huán)境表現(xiàn)為正常生長、繁殖，顯示蒜氨酸無殺菌活性。

綜上所述，蒜氨酸能與菌體蛋白質(zhì)、細(xì)菌酶蛋白結(jié)合阻止細(xì)菌與環(huán)境物質(zhì)交換，抑制細(xì)菌生命活動，具有較強的抑菌活性；細(xì)菌緩慢的生命活動又可分解蒜氨酸，形成大蒜素，加強蒜氨酸抑菌效應(yīng)。蒜氨酸無殺菌活性。