秦皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的影響*

韋 虹，蔣春蘭，覃再嫩△，鄭 立△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；2.廣西組織器官修復(fù)醫(yī)用生物材料工程技術(shù)研究中心，南寧 530021）

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，參與機(jī)體固有的免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[1]。巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的激活狀態(tài)和M1/M2比值與炎癥的嚴(yán)重程度高度相關(guān)，其中M1 巨噬細(xì)胞分泌幾種促炎細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，可導(dǎo)致基質(zhì)降解和炎癥發(fā)生[2-3]；M2 型巨噬細(xì)胞可以分泌一系列抗炎因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10），CD206，Arg-1 等來(lái)發(fā)揮抗炎作用和免疫抑制反應(yīng)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)的活性氧（ROS）會(huì)引起機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而破壞組織穩(wěn)態(tài)，加重炎癥的進(jìn)展[5-6]，且過(guò)量的ROS 也會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M1 型極化，促進(jìn)炎癥性因子的產(chǎn)生，加劇炎癥[7-8]。因此，清除過(guò)量表達(dá)的ROS和調(diào)控滑膜巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，減少有害細(xì)胞因子的分泌，可以促進(jìn)組織修復(fù)并延緩炎癥的進(jìn)程。

秦皮苷提取自秦皮，是秦皮的活性成分，有抗菌、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗高尿酸血癥和利尿等功效[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，秦皮苷可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激的水平，在體內(nèi)外均表現(xiàn)出有效的肝保護(hù)作用[9]。然而，關(guān)于秦皮苷通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化控制炎癥方面的研究目前仍較少。因此，本文旨在通過(guò)體外建立M1 型巨噬細(xì)胞極化模型，探討秦皮苷對(duì)巨噬細(xì)胞M1/M2極化的影響，為秦皮苷治療炎癥方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑 秦皮苷（純度≥95%）（麥克林，中國(guó)）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；PBS、脂多糖（LPS）、青鏈霉素混合液（100×）、總RNA 提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒、ROS 檢測(cè)試劑盒[二氯二氫熒光素二氫乙酸酯（DCFH-DA）]（索萊寶，中國(guó)）；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（CCK-8試劑）（Biosharp，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas Company，美國(guó)）；引物（金開(kāi)瑞，中國(guó)）；鈣黃綠素-A/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）（Sigma-Aldrich，美國(guó)）；免疫熒光染料FITC-IgG（博士德，中國(guó)）；CD206 一抗、iNOS 一抗（Gibco，美國(guó)）；封閉用山羊血清（中杉金橋，中國(guó)）；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Solarbio，中國(guó)）；1.1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（梯希愛(ài)，中國(guó)）。

1.1.2 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州金燕凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、核酸蛋白檢測(cè)儀（Thermo Scientific，美國(guó)）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國(guó)）、ProFlex?PCR 系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；正置熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）；Light-Cycler96實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Roche，瑞士），流式細(xì)胞分析儀（BD Accuri C6，美國(guó)）。

1.2 DPPH試劑檢測(cè)秦皮苷的自由基清除能力

稱取一定量的DPPH，用無(wú)水乙醇配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液。分別取400 μL不同濃度（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、160 μg/mL）的秦皮苷溶液，加入400 μL DPPH 溶液，混合均勻，室溫放置30 min 后，10 000 r/min 離心5 min。取上清液于540 nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算秦皮苷的自由基清除能力[自由基清除率=（1－各實(shí)驗(yàn)組的吸光度值/零濃度的吸光度值）×100]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，并置于條件為37oC、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)隔天換液，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)即可傳代。

1.4 CCK-8 試劑檢測(cè)秦皮苷對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性

RAW264.7 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度種在96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的秦皮苷溶液（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、160 μg/mL）孵育24 h，用CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定孔板在450 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力（細(xì)胞存活率=處理組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100）。

1.5 細(xì)胞分組與干預(yù)

將實(shí)驗(yàn)分為3 組，分別為對(duì)照組（未處理）、模型組（LPS）和實(shí)驗(yàn)組（LPS＋秦皮苷），對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，模型組加入含10 μg/mL LPS 的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含10 μg/mL LPS和20 μg/mL秦皮苷的完全培養(yǎng)基。

1.6 Calcein-AM/PI染色檢測(cè)秦皮苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活性的影響

將RAW264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度種于含有爬片的6 孔板上，待細(xì)胞貼壁后，加藥處理24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入含0.5%Calcein-AM 和2%PI的染色液，并在黑暗條件37oC下孵育5 min。用正置熒光顯微鏡觀察并拍照，用Image J軟件分析各組的活死細(xì)胞數(shù)，并分別計(jì)算各組活細(xì)胞比例（活細(xì)胞比例=活細(xì)胞數(shù)/活死細(xì)胞總數(shù)×100）。

1.7 DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫水平

按照1∶1 000 的比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA 熒光探針，使終濃度為10 μmol/L。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入1 mL DCFH-DA 熒光探針稀釋液，細(xì)胞置于37oC 的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌3 遍，在正置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度的平均值。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的定量水平。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)秦皮苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用總RNA 分離試劑盒提取各組樣品中的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA 樣品為cDNA。使用Light Cycle 96 系統(tǒng)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95oC 10 min，變性；95oC 15 min，退火；60oC 60 s，共45 個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。每個(gè)基因重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)?；蛞镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 RT-qPCR 的引物序列

1.9 免疫熒光染色評(píng)估RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)CD206和iNOS的表達(dá)水平

將RAW264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板上，待細(xì)胞貼壁后，加藥處理并在37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min。用3% H2O2孵育15 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min；然后用封閉用山羊血清處理15 min，倒掉血清，勿洗。分別加入一抗iNOS、CD206（1∶200），并在4oC 冰箱孵育過(guò)夜或37oC 冰箱孵育4 h，PBS 洗滌3 次，每次2 min，然后在室溫下加入二抗（anti-goat IgG-FITC，1∶200），在37oC的黑暗條件下孵育1 h，PBS 洗滌3 次，每次2 min 鐘；用DAPI（1 μg/mL）染色，黑暗條件下孵育10 min，PBS洗滌3次，每次2 min。然后用抗熒光淬滅劑封片，最后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩者間線性關(guān)系采用趨勢(shì)性檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秦皮苷自由基清除能力檢測(cè)

當(dāng)秦皮苷濃度為20 μg/mL時(shí)，其自由基清除率約為34%；隨著秦皮苷濃度的增加，自由基清除率增加（P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 DPPH檢測(cè)秦皮苷的總抗氧化能力

2.2 秦皮苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用

當(dāng)秦皮苷的濃度為20 μg/mL 時(shí)的細(xì)胞活力最好（P＜0.05），見(jiàn)圖2；表明秦皮苷的濃度為20 μg/mL 時(shí)RAW264.7 細(xì)胞的增殖作用最明顯。因此，將20 μg/mL 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的有效濃度。

圖2 秦皮苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

2.3 秦皮苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組相比，模型組活細(xì)胞數(shù)目減少，死細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞活力降低（P＜0.01）。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)目增多，死細(xì)胞數(shù)目減少（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 Calcein-AM/PI 染色檢測(cè)細(xì)胞活性

2.4 秦皮苷對(duì)RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.001），而加入秦皮苷處理后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度下降（P＜0.001），見(jiàn)圖4。同時(shí)，進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生情況，與對(duì)照組相比，模型組的ROS含量增加了28.9%，而與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組的ROS含量降低了25.7%，見(jiàn)圖5。

圖4 秦皮苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS的水平

2.5 秦皮苷調(diào)控RAW264.7細(xì)胞的極化

與對(duì)照組相比，模型組中RAW264.7 細(xì)胞iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α和CD86等M1型相關(guān)基因表達(dá)增加（均P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組中RAW264.7細(xì)胞iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α和CD86表達(dá)下降，Arg-1、IL-10和CD206等M2 型相關(guān)基因表達(dá)增加（均P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 秦皮苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

2.6 秦皮苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組中M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD206 的染色熒光強(qiáng)度較弱（P＜0.001）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.001）；與對(duì)照組相比，模型組中M1型RAW264.7細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物iNOS的染色熒光強(qiáng)度較強(qiáng)（P＜0.001），與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熒光強(qiáng)度下降（P＜0.001），見(jiàn)圖7。

圖7 免疫熒光染色檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

3 討論

巨噬細(xì)胞是吞噬性白細(xì)胞，在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。由感染、炎癥或損傷引起的組織穩(wěn)態(tài)紊亂會(huì)顯著改變組織局部環(huán)境，影響巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)和新陳代謝。在持續(xù)刺激的情況下，巨噬細(xì)胞可被激活并向M1 型極化，這將會(huì)促進(jìn)組織損傷和疾病[12]。秦皮苷是一種香豆素類(lèi)化合物，是中草藥秦皮的主要成分[10]，已知具有抗炎、抗氧化、抗病毒等作用[9-10]。本文就秦皮苷通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 極化并抑制巨噬細(xì)胞的M1極化來(lái)減緩炎癥的進(jìn)展進(jìn)行探討，有望通過(guò)抗炎和抗氧化的作用減緩炎癥的發(fā)生和進(jìn)展。

秦皮苷具有生物相容性良好的優(yōu)點(diǎn)，即便較大劑量也不會(huì)影響細(xì)胞的增殖[13]。Calcein-AM/PI 染色結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 處理后的巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，而經(jīng)秦皮苷處理后的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，說(shuō)明秦皮苷對(duì)巨噬細(xì)胞具有保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS在炎癥反應(yīng)中高表達(dá)，通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)的ROS 抑制氧化應(yīng)激，對(duì)炎癥的治療起著關(guān)鍵的作用[14]。本研究中DPPH結(jié)果顯示，隨著秦皮苷濃度的增加，其自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，表明其具有良好的總抗氧化能力。由于進(jìn)入細(xì)胞的非熒光DCFH-DA可被細(xì)胞內(nèi)ROS 氧化成熒光DCF，其熒光強(qiáng)度與ROS 水平成正比[15]，因此，利用DCFH-DA 熒光探針可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS。本研究結(jié)果也表明了秦皮苷具有清除巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS、抑制氧化應(yīng)激的作用。

研究表明，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，活化的巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子會(huì)促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[16-18]。因此，抑制炎癥因子的過(guò)度表達(dá)可以延緩炎癥的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS 處理后，巨噬細(xì)胞分泌的相關(guān)炎癥因子如iNOS、IL-1β、TNF-α、CD86和IL-6表達(dá)升高，向M1 型極化并加重炎癥反應(yīng)。而經(jīng)秦皮苷處理后，相關(guān)炎癥因子表達(dá)下降，抗炎因子如Arg-1、IL-10和CD206表達(dá)上升，巨噬細(xì)胞向M2型極化發(fā)揮抗炎作用。同時(shí)，巨噬細(xì)胞的顯著特征是M1 表型的iNOS 特異性表面受體和M2 表型的CD206 表面受體[19-20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后，M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白（iNOS）表達(dá)升高，M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白（CD206）表達(dá)下降，經(jīng)秦皮苷處理后，M1 型相關(guān)蛋白的表達(dá)受到抑制，M2型相關(guān)蛋白表達(dá)升高，這些結(jié)果與上述巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平結(jié)果一致，說(shuō)明秦皮苷的處理可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的不良反應(yīng)，促使巨噬細(xì)胞從促炎M1型向抗炎M2型極化，從而發(fā)揮抗炎作用。這些結(jié)果都表明了秦皮苷能夠抑制LPS誘導(dǎo)發(fā)生的炎癥。

綜上所述，秦皮苷能夠清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)抑制巨噬細(xì)胞向促炎M1 表型極化，并促進(jìn)其向抗炎M2 表型極化，從而分泌相關(guān)抗炎因子發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)炎癥轉(zhuǎn)歸，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。