淫羊藿素對乳腺癌細(xì)胞化療敏感的影響機(jī)制研究*

劉衛(wèi)國 ,何利芳 ,顧 玲 ,何育威 ,侯俊杰△

（1.長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，仙桃 433000；2.湖北省黃石市中心醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，黃石 435000）

乳腺癌是世界女性最常見惡性腫瘤之一，據(jù)流行病學(xué)資料顯示，其在美國死亡率已經(jīng)躍居第一位[1]，在中國，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅女性健康[2]?；熓桥R床上針對乳腺癌治療的常用手段，但由于患者的個體差異性，其對化療藥物的敏感性也各有不同，統(tǒng)一的化療方案對不同的患者有著不同的療效[3]。研究發(fā)現(xiàn)，與乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的基因，如人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）、人抑癌基因p53 和促凋亡基因Bax等與患者化療敏感性有關(guān)[4-5]。

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，臨床上主要用于乳房腫塊和高血壓等疾病的治療。淫羊藿素（icaritin,ICT）是淫羊藿主要活性單體淫羊藿苷的水解產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化和免疫抑制等多重效應(yīng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，ICT可逆轉(zhuǎn)人多發(fā)性骨髓瘤耐藥細(xì)胞株KM3/BTZ 的多藥耐藥性的作用[7]。脫水ICT 可抑制受體狀態(tài)不同的人乳腺癌細(xì)胞株的增殖活性[8]?；诖?，本研究通過構(gòu)建乳腺癌順鉑（cisplatin，CDDP）耐藥株，進(jìn)一步探究ICT對乳腺癌化療敏感性的影響及其可能的作用機(jī)制，為乳腺癌的臨床治療提供可靠的化療增敏藥物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物和主要試劑 人三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中科院上海細(xì)胞庫。ICT（貨號：JOT-11573；純度≥98%）購自成都普菲德生物公司；注射用CDDP（國藥準(zhǔn)字H37021358）購自齊魯制藥。MTT 購自美國Sigma 公司；PRMI-1640 購自美國HyClone 公司；Matrigel 購自美國的BD 公司；結(jié)晶紫購自北京碧云天公司；ECL購自武漢谷歌生物科技公司；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國的Invitrogen 公司；Transwell 小室購自美國Millipore公司。一抗磷酸化（p）-ERK1/2、p-p53及GAPDH購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及MDA-MB-231/CDDP 耐藥株的構(gòu)建 取MDA-MB-231 細(xì)胞，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的不完全RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%，加入100 ng/mL的CDDP，采用持續(xù)誘導(dǎo)法以100 ng/mL 濃度穩(wěn)定增加藥物濃度，使細(xì)胞穩(wěn)定存活，傳代。以4 μg/mL的維持濃度至少培養(yǎng)7 個月獲得耐藥CDDP 細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)前停用CDDP兩周。

1.3 MTT 法檢測MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞株增殖活性 取傳代后對數(shù)生長期MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞，消化，重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為5 000個/孔，將細(xì)胞接種至96 孔板中，設(shè)置對照組（0.0 μmol/L ICT）和不同濃度（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L、2.5 μmol/L、3.0 μmol/L、4.0 μmol/L、5.0 μmol/L）ICT處理組。待細(xì)胞貼壁后根據(jù)分組給予藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用MTT 檢測細(xì)胞的增殖情況，檢測波長為570 nm，計(jì)算細(xì)胞增殖率=處理組OD 值/對照組OD 值×100%。取對MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞增殖沒有影響的臨界濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取對數(shù)生長期MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞，消化、重懸后繼續(xù)接種于96孔板，設(shè)置各濃度CDDP 組及CDDP+ICT 組，CDDP 處理MDA-MB-231 細(xì)胞的終濃度分別為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.3 μg/mL、0.4 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL，處理MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞的終濃度分別為1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL、6.0 μg/mL、7.0 μg/mL，ICT 濃度為上述臨界濃度。待細(xì)胞貼壁后根據(jù)分組給予藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。采用MTT 檢測細(xì)胞的增殖情況，檢測波長為570 nm，計(jì)算細(xì)胞相對增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-對照組OD 值）/對照組OD值×100%。

1.4 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲 取100 μL Matrigel凝膠均勻鋪在小室上層，然后將小室放在孔板內(nèi)；取對數(shù)生長期MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞，PBS洗滌后換用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約5×105個/mL；在小室上室加入200 μL 細(xì)胞懸液，設(shè)置對照（Con）組、CDDP 組及CDDP+ICT組，按照分組加入CDDP和ICT，使其終濃度分別為IC50和臨界濃度，對照組加200 μL 細(xì)胞懸液。培養(yǎng)48 h后將Transwell小室取出，棄去培養(yǎng)基，酒精棉簽擦去上層Matrigel 凝膠及未穿膜的細(xì)胞。另取干凈的24孔板中，將小室置于其中，4%多聚甲醛固定30 min。棄去固定液，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 洗滌，棉簽擦去未結(jié)合的染料，顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)量。相對侵襲率=實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)/對照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞，消化，重懸并調(diào)整其密度為1×105個/mL，接種于6 孔板。胰酶消化，離心，棄上清，加入結(jié)合緩沖液500 μL 對細(xì)胞進(jìn)行重懸，再加5 μL AnnexinV-FITC 及5 μL PI 染液，混勻后避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀分析檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blotting法檢測p-ERK1/2和p-p53蛋白表達(dá) 于冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白；BCA 法測定蛋白濃度，配膠、上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PCDF膜，封閉；加入一抗p-ERK1/2、p-p53與內(nèi)參蛋白GAPDH，4 ℃下孵育過夜；洗膜，加入二抗，室溫下孵育2 h，洗膜；ECL 顯色，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICT 對MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞CDDP敏感性的影響 隨著ICT濃度的增加，其對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用更加明顯，ICT表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用。當(dāng)ICT濃度大于1.5 μmol/L時，ICT對MDA-MB-231細(xì)胞增殖有明顯抑制作用（P＜0.001）；當(dāng)ICT 濃度大于2 μmol/L 時，ICT 對MDA-MB-231/CDDP 耐藥細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用（P＜0.05），見圖1A。選擇ICT 對兩種乳腺癌細(xì)胞增殖無顯著影響的濃度，即1.5 μmol/L 的ICT進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與CDDP 單獨(dú)作用比較，ICT 聯(lián)合CDDP 對兩種乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用更加明顯（均P＜0.05），見圖1B～1C。根據(jù)實(shí)驗(yàn)選取MDA-MB-231細(xì)胞的IC50濃度，即1 μg/mL CDDP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 ICT對MDA-MB-231耐藥細(xì)胞CDDP敏感性的影響

2.2 ICT 對MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞侵襲的影響 在兩種乳腺癌細(xì)胞中，與Con組比較，CDDP單用和CDDP聯(lián)合ICT均能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲（P＜0.05）；與CDDP單用比較，CDDP 聯(lián)合ICT 抑制細(xì)胞侵襲的作用更加顯著（P＜0.01），見圖2。

圖2 ICT對MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞侵襲的影響（×200）

2.3 ICT 對MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞凋亡的影響 在兩種乳腺癌細(xì)胞中，與Con 組比較，CDDP 組和CDDP+ICT 組細(xì)胞凋亡更加明顯（P＜0.001）；與CDDP 單用比較，CDDP 聯(lián)合ICT 誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡的作用更加顯著（P＜0.001），見圖3。

圖3 ICT對MDA-MB-231和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞凋亡的影響

2.4 ICT 對MDA-MB-231 和MDA-MB-231/CDDP耐藥細(xì)胞ERK1/2 和p53 蛋白表達(dá)的影響 與Con組比較，兩種細(xì)胞的p-ERK1/2蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.001），p-p53蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；且CDDP聯(lián)用ICT較CDDP單用對p-ERK1/2蛋白表達(dá)的下調(diào)及p-p53蛋白表達(dá)的上調(diào)作用更加明顯（P＜0.05），見圖4、表1。

圖4 ICT對兩種細(xì)胞p-ERK1/2和p-p53蛋白表達(dá)的影響

表1 3組p-ERK1/2和p-p53蛋白表達(dá)比較±s

表1 3組p-ERK1/2和p-p53蛋白表達(dá)比較±s

與Con組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與CDDP組比較，*P＜0.05。

3 討論

目前臨床上針對乳腺癌的治療已經(jīng)有了較為明顯的進(jìn)展，但乳腺癌患者由于經(jīng)常產(chǎn)生耐藥情況且缺乏有效的藥物治療靶點(diǎn)，因此，乳腺癌患者面臨著生存期較短，死亡率較高的危險(xiǎn)[9]。CDDP為一種抑制DNA復(fù)制的烷化劑，屬于非細(xì)胞周期特異性化療藥，其在三陰乳腺癌的臨床治療中具有重要地位[10]。但在乳腺癌的臨床治療上，隨著化療藥物周期的延長，其也易產(chǎn)生耐藥性，同時伴隨著多種毒副作用的發(fā)生。因此，針對乳腺癌細(xì)胞對CDDP 的耐藥，臨床上也多采取多藥聯(lián)合的方式來治療乳腺癌，尋求一種化療增敏劑能夠增強(qiáng)CDDP 化療敏感性而降低其毒副作用的藥物則顯得至關(guān)重要[11-12]。蔣紹艷等[13]研究證實(shí)，淫羊藿苷可抑制人卵巢癌細(xì)胞的多藥耐藥，抑制耐藥細(xì)胞株的增殖、侵襲及侵襲能力，同時，還可通過上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，相較于CDDP單獨(dú)作用，ICT聯(lián)合CDDP 對兩種乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用更加明顯。根據(jù)實(shí)驗(yàn)選取MDA-MB-231 細(xì)胞的IC50濃度，繼續(xù)探究ICT聯(lián)合CDDP對兩種細(xì)胞的侵襲和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種乳腺癌細(xì)胞中，相較于Con組，CDDP單用和CDDP聯(lián)合ICT均能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲，誘導(dǎo)凋亡；但與CDDP 單用比較，CDDP 聯(lián)合ICT 抑制細(xì)胞侵襲及誘導(dǎo)凋亡的作用更加明顯。結(jié)果提示ICT可增強(qiáng)CDDP對乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用更加顯著。

有研究發(fā)現(xiàn)，鉑類藥物可通過p63/p73 相關(guān)通路影響三陰乳腺癌的化療敏感性[14]。此外，p53 基因的突變也被證實(shí)與三陰乳腺癌較差的預(yù)后密切相關(guān)，許多化療藥物通過p53 依賴性細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)其作用。p53基因表達(dá)的下調(diào)可大大降低鉑類藥物的敏感性，其機(jī)制可能涉及到DNA 的損傷修復(fù)[15]。除p53基因外，ERK1/2通路的異常激活在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色[16]，ERK1/2 MAPK是Ras 基因下游最為經(jīng)典的一條信號通路，ERK1/2 MAPK 通路主要參與調(diào)控細(xì)胞周期以及促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-18]。研究表明，ICT 可激活包括PI3K/Akt、JAK/STAT3 和MAPK/ERK/JNK 在內(nèi)的多種關(guān)鍵細(xì)胞信號通路發(fā)揮抗血液惡性腫瘤的作用[19]。Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，ICT 還可通過靶向ERK 通路抑制A549 細(xì)胞的增殖和遷移等。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于Con組，兩種細(xì)胞的p-ERK1/2 蛋白表達(dá)均顯著降低，p-p53 蛋白表達(dá)顯著升高；且CDDP 聯(lián)用ICT 較CDDP 單用對p-ERK1/2蛋白表達(dá)的下調(diào)及p-p53蛋白表達(dá)的上調(diào)作用更加明顯。提示ICT對CDDP的增敏作用可能與ERK1/2 相關(guān)通路的抑制及p-p53 蛋白的激活有關(guān)。

綜上，ICT 聯(lián)合CDDP 較CDDP 單用對人乳腺癌細(xì)胞及其CDDP 耐藥細(xì)胞株的增殖、侵襲抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用更加明顯，且ICT 的增敏作用可能與ERK1/2 相關(guān)通路的抑制及p-p53 蛋白的激活有關(guān)。