舒芬太尼對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織細(xì)胞自噬的影響*

楊雪梅，楊康明，李 娜

（1.甘孜州人民醫(yī)院麻醉科，甘孜 626000；2.甘孜州人民醫(yī)院肝膽一科，甘孜 626000；3.海南省人民醫(yī)院麻醉科，?？?572000）

急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）是一種常見(jiàn)的急性疾病，死亡率很高，并且容易導(dǎo)致慢性腎病的進(jìn)展[1]。腎缺血再灌注損傷（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）是導(dǎo)致AKI 最重要的原因之一，常見(jiàn)于腎移植、腎部分切除術(shù)、休克、急性腎動(dòng)脈阻塞和其他臨床手術(shù)過(guò)程[2]。自噬在RIRI中發(fā)揮著重要的作用。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠有效調(diào)控自噬的藥物將有助于RIRI 的治療。舒芬太尼（sufentanil，Sufen）是臨床最常用的麻醉藥物，具有鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)、起效快、蘇醒時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。有研究報(bào)道，Sufen通過(guò)抑制過(guò)度自噬可減輕大鼠RIRI[3]，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建RIRI 模型，探究Sufen對(duì)RIRI大鼠細(xì)胞自噬的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于廣州銳格生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2021-0059。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則，本研究得到甘孜州人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2022-0175）。

1.1.2 主要試劑 枸酸舒芬太尼注射液（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司）；PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002、肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；兔源一抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）、p62、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT、GAPDH 及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（廣州復(fù)能生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及處理 將60 只SPF 級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、Sufen 組、LY294002組、Sufen+LY294002 組，每組12 只。除對(duì)照組外，其它組均參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行RIRI 模型構(gòu)建。建模成功后，Sufen 組大鼠在再灌注前5 min尾靜脈注射舒芬太尼1 μg/kg、腹腔注射0.3 mg/kg 生理鹽水[4]；LY294002 組大鼠在再灌注前5 min 尾靜脈注射1 μg/kg 生理鹽水，腹腔注射LY294002 0.3 mg/kg[5]；Sufen+LY294002組大鼠在再灌注前5 min尾靜脈注射舒芬太尼1 μg/kg、腹腔注射LY294002 0.3 mg/kg，對(duì)照組、模型組大鼠則尾靜脈注射1μg/kg 生理鹽水、腹腔注射0.3 mg/kg生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 大鼠血清中Cr和BUN水平的檢測(cè) 給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血獲得血清，按照說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)大鼠血清中肌酐Cr和BUN水平。

1.2.3 蘇木精—伊紅（HE）染色檢測(cè)大鼠腎臟組織病理學(xué)變化 每組3 只大鼠，處死大鼠取出腎臟固定在多聚甲醛中，切成5 μm厚切片，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，HE 染色后，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察腎臟組織病理學(xué)變化。參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行腎臟組織病理評(píng)分，隨機(jī)選取6個(gè)不重疊的視野，根據(jù)腎小管壞死、管型形成和小管擴(kuò)張的分級(jí)評(píng)分反映腎小管損傷嚴(yán)重程度：0 分（無(wú)損傷）、1 分（≤10%的損傷）、2 分（11%～25%的損傷）、3分（26%～45%的損傷）、4分（46%～75%的損傷）和5分（≥76%的損傷）。

1.2.4 大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平的檢測(cè) 每組3只大鼠，嚴(yán)格按照MDA含量、SOD活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)大鼠腎臟組織中MDA 含量、SOD活性。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀(guān)察自噬小體的形成 取剩余6只大鼠腎組織，一部分將腎臟組織切成1 mm3的小塊，固定過(guò)夜后將組織樣本在室溫下用1%鋨酸固定1 h，在一系列乙醇水溶液中脫水，最后在100%乙醇中脫水，然后包埋在環(huán)氧樹(shù)脂中。使用超薄切片機(jī)切割的超薄切片用3%檸檬酸鉛染色，最后使用電子顯微鏡觀(guān)察自噬小體形成情況。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 取“1.2.5項(xiàng)”中剩余腎組織，通過(guò)RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，通過(guò)10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入一抗LC3、p62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后在室溫下與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗孵育1 h 后，加入ECL 試劑可視化蛋白，利用Image J 軟件分析目的蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中Cr和BUN水平的比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中Cr、BUN 水平升高；與模型組比較，Sufen 組大鼠血清中Cr、BUN 水平回降，LY294002 組大鼠血清中Cr、BUN水平回升；與Sufen組比較，Sufen+LY294002組大鼠血清中Cr、BUN水平升高，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中Cr和BUN水平比較±s，n=12

表1 各組大鼠血清中Cr和BUN水平比較±s，n=12

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷嚴(yán)重，如出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，管型形成，病理評(píng)分升高；與模型組比較，Sufen 組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷減輕、病理評(píng)分降低，LY294002組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷加劇，病理評(píng)分升高；與Sufen組比較，Sufen+LY294002組大鼠腎臟組織中的腎小管損傷嚴(yán)重、病理評(píng)分升高，見(jiàn)圖1和表2。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果

表2 各組大鼠腎臟組織病理評(píng)分比較±s，n=3

表2 各組大鼠腎臟組織病理評(píng)分比較±s，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.3 各組大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織中MDA含量升高，SOD 活性降低；與模型組比較，Sufen 組MDA 含量降低，SOD 活性升高，而LY294002 組MDA 含量升高，SOD 活性降低；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002組MDA含量升高，SOD活性降低，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎臟組織中MDA含量、SOD活性的比較±s，n=3

表3 各組大鼠腎臟組織中MDA含量、SOD活性的比較±s，n=3

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.4 各組大鼠腎臟組織中自噬小體形成比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量增加；與模型組比較，Sufen組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量減少，LY294002組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量增加；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002組大鼠腎臟組織中自噬小體的數(shù)量增加，見(jiàn)圖2。

圖2 透射電子顯微鏡觀(guān)察自噬小體的形成（×50 000）

2.5 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白表達(dá)降低；與模型組比較，Sufen 組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低，p62蛋白表達(dá)升高，而LY294002 組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白表達(dá)降低；與Sufen組比較，Sufen+LY294002 組大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，p62蛋白表達(dá)降低，見(jiàn)圖3和表4。

圖3 Western blotting檢測(cè)LC3、p62蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較±s，n=6

表4 各組大鼠腎臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較±s，n=6

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

2.6 各組大鼠腎臟組織中PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平降低；與模型組比較，Sufen組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平升高，而LY294002 組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平降低；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002 組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平降低，見(jiàn)圖4和表5。

圖4 Western blotting檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 各組大鼠腎臟組織中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較±s，n=6

表5 各組大鼠腎臟組織中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較±s，n=6

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與Sufen 組比較，ΔP＜0.05。

3 討論

據(jù)報(bào)道，RIRI 患者血液中Cr 和BUN 水平反映了腎功能損傷的程度，其水平越高，損傷越嚴(yán)重[7]。氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA可衡量氧自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化水平對(duì)腎組織的損傷能力，而SOD的活性則反映了機(jī)體清除活性氧的能力。本研究結(jié)果表明，RIRI模型大鼠腎臟損傷嚴(yán)重，氧化應(yīng)激增強(qiáng)。腎細(xì)胞主要依靠自噬來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活和恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，自噬可有效改善炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激，而過(guò)度的自噬則可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，細(xì)胞死亡增加。有研究報(bào)道，大鼠RIRI后腎組織的自噬活性升高[8]；LC3、p62蛋白是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，LC3蛋白存在LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種形式，可參與自噬小體的形成，而p62蛋白則參與自噬的降解。本研究結(jié)果提示RIRI 模型大鼠中存在過(guò)度自噬。

Sufen 是一種合成的阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛劑，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用；其通過(guò)抑制自噬水平在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用；Sufen 預(yù)處理通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體自噬來(lái)抑制大鼠心肌缺血再灌注引起的心肌損傷[9]。本研究結(jié)果提示，Sufen可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及過(guò)度自噬來(lái)發(fā)揮對(duì)RIRI大鼠腎臟的保護(hù)作用。

研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kenase B，PI3K/AKT）通路可以改善腎臟、肺、腦等的缺血再灌注損傷。右美托咪定通過(guò)激活PI3K/AKT通路減輕大鼠肺缺血再灌注損傷[10]；丹紅注射液可激活PI3K/AKT 通路發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[11]。本研究結(jié)果證明，在RIRI 模型大鼠中PI3K/AKT 通路被抑制，提示Sufen 可能通過(guò)激活PI3K/AKT通路來(lái)抑制過(guò)度自噬，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)RIRI大鼠腎臟的保護(hù)作用。本研究利用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，LY294002組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 水平降低，氧化應(yīng)激及自噬活性增強(qiáng)，腎臟損傷加??；與Sufen 組比較，Sufen+LY294002 組大鼠腎臟組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平降低，氧化應(yīng)激及自噬活性增強(qiáng)，腎臟損傷嚴(yán)重，證明了Sufen可能通過(guò)激活PI3K/AKT 通路來(lái)抑制過(guò)度自噬，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)RIRI大鼠腎臟的保護(hù)作用。

綜上所述，Sufen可能通過(guò)激活PI3K/AKT通路來(lái)抑制過(guò)度自噬，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)RIRI大鼠腎臟的保護(hù)作用。