骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物的研究進(jìn)展

田琳琳 馮正平

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400016

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)受到破壞導(dǎo)致骨骼脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的慢性疾病。骨質(zhì)疏松和低骨量在老年人中越來(lái)越普遍，相對(duì)于骨密度檢查的不便及檢測(cè)延遲，骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物可更早反映骨轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)。骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物分為骨形成生化標(biāo)志物和骨吸收生化標(biāo)志物，骨形成生化標(biāo)志物包括骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型前膠原氨基端前肽(P1NP)、Ⅰ型前膠原羧基端前肽(P1CP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、骨保護(hù)素(OPG)等；骨吸收生化標(biāo)志物包括Ⅰ型膠原氨基末端肽(NTX)、Ⅰ型膠原羧基末端肽(CTX)、酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、吡啶啉(PYD)、脫氧吡啶啉(DPD)等。目前骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于臨床，新的骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物也在不斷被發(fā)現(xiàn)，本文就國(guó)內(nèi)外一些新的骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物研究進(jìn)展作一綜述。

1 骨鈣素

骨鈣素(osteocalcin，OC)又被稱為骨γ-羧基谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins，BGLAP)，是BGLAP編碼的由非增殖期的成骨細(xì)胞特異合成并分泌的骨組織中含量最豐富的維生素K依賴的非膠原蛋白，參與骨基質(zhì)的合成、維持骨礦化。成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素含有3種γ-羧基谷氨酸殘基，它們與骨羥基磷灰石基質(zhì)具有高親和力。當(dāng)骨吸收時(shí)，由于破骨細(xì)胞吸收腔隙內(nèi)的pH值降低，骨鈣素上的羧基被清除，降低了其對(duì)骨骼的親和力，羧化不全的骨鈣素被釋放到循環(huán)中，所以測(cè)定血清中的骨鈣素水平既能反映成骨細(xì)胞活性，又能反映骨轉(zhuǎn)換的程度[1]。

Karsenty小組最早通過(guò)敲除Bglap和Bglap2基因產(chǎn)生骨鈣素缺乏(Ocn-/-)小鼠，發(fā)現(xiàn)Ocn-/-小鼠表現(xiàn)出骨小梁和皮質(zhì)骨的體積均增加，但其成骨細(xì)胞未增加、破骨細(xì)胞的數(shù)量增加；表明骨鈣素抑制成骨細(xì)胞功能和破骨細(xì)胞的生成，是骨形成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。對(duì)純B6基因背景下的骨鈣素缺失(OC-/-)小鼠研究發(fā)現(xiàn)[2]，與野生型小鼠相比，OC-/-小鼠骨小梁體積、骨小梁體積/總體積、連接密度和數(shù)量均顯著增加。OC-/-小鼠骨礦物中酸性磷酸鹽含量增加、血清P1NP濃度升高，表明其骨形成增加。另一方面，野生型小鼠和OC-/-小鼠的血清CTX濃度無(wú)顯著差異，表明其不影響骨吸收。最近有研究通過(guò)Neo基因替換Bglap和Bglap2基因生成骨鈣素缺乏(Ocn-/-)小鼠[3]，發(fā)現(xiàn)野生型和Ocn-/-小鼠股骨小梁的骨體積、厚度和數(shù)量無(wú)顯著差異，同時(shí)股骨松質(zhì)骨中的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和骨形成的參數(shù)是無(wú)顯著差異的，表明骨鈣素缺乏并不影響骨量、骨密度、骨形成或骨吸收。分析兩組小鼠的骨骼微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠中羥基磷灰石晶體的c軸方向與膠原纖維的排列方向是平行的，而Ocn-/-小鼠中膠原纖維排列正常，但羥基磷灰石晶體c軸平行于骨縱軸的取向程度減弱，導(dǎo)致骨礦化紊亂，骨強(qiáng)度降低，表示骨鈣素通過(guò)調(diào)整平行于膠原纖維的羥基磷灰石晶體c軸方向，影響骨骼礦化而影響骨質(zhì)量和強(qiáng)度而不是數(shù)量。

對(duì)絕經(jīng)后女性相關(guān)研究[4]發(fā)現(xiàn)，血清骨鈣素水平與腰椎和髖關(guān)節(jié)骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)。印度的研究發(fā)現(xiàn)[5]，絕經(jīng)后女性骨鈣素水平顯著升高；相較于骨密度正常的婦女，低骨量及骨質(zhì)疏松婦女的血清骨鈣素水平也是顯著升高的。對(duì)絕經(jīng)后使用激素替代治療的婦女隨訪血清骨鈣素水平，發(fā)現(xiàn)3個(gè)月內(nèi)血清骨鈣素水平較基線發(fā)生顯著變化。在2型糖尿病患者中[6]發(fā)現(xiàn)，在男性和女性患者中，骨鈣素水平升高與全腰椎、股骨以及髖關(guān)節(jié)骨密度下降均存在顯著相關(guān)性。

血清骨鈣素能直接反映成骨細(xì)胞活性，其水平與骨密度呈負(fù)相關(guān)，且血清骨鈣素水平變化可作為評(píng)估骨質(zhì)疏松治療的早期療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 CXC趨化因子配體12

CXC趨化因子配體12(C-X-C chemokine ligand 12，CXCL12)屬于CXC趨化因子家族，也被稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived D factor-1，SDF-1)，是一種由骨髓細(xì)胞中的基質(zhì)細(xì)胞分泌的小信號(hào)蛋白，在成骨細(xì)胞系細(xì)胞、血管周圍網(wǎng)狀細(xì)胞等均有表達(dá)，與CXC趨化因子受體4(CXCR4)結(jié)合形成SDF-1/CXCR4軸，為細(xì)胞存活創(chuàng)造微環(huán)境。CXCL12影響間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)、存活和分化，祖細(xì)胞通過(guò)CXCL12被募集到骨髓的壁龕形成成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞[7]。其促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的趨化募集，募集后RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞成熟為破骨細(xì)胞[8]。同時(shí)CXCL12還通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶間接影響破骨細(xì)胞前體從循環(huán)向骨髓的遷移[9]。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中[10]發(fā)現(xiàn)CXCL12缺失小鼠股骨干中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞特異性mRNA表達(dá)增加，加快了骨重建速度，但骨吸收和骨形成之間的平衡沒(méi)有改變。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)CXCL12通過(guò)抑制成骨細(xì)胞的生成和成骨細(xì)胞系細(xì)胞提供的破骨細(xì)胞支持來(lái)抑制骨轉(zhuǎn)換率。Pang等[11]發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞中CXCL12的mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而破骨細(xì)胞中CXCL12的mRNA和蛋白水平明顯升高，提示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控CXCL12基因表達(dá)抑制成骨細(xì)胞增殖和破骨細(xì)胞凋亡。Carbone等[12]對(duì)老年性骨質(zhì)疏松患者的研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12血漿濃度與髖關(guān)節(jié)骨密度呈負(fù)相關(guān)，但與髖部骨折發(fā)生率無(wú)顯著相關(guān)性。表明在老年人中，血漿中CXCL12水平的升高與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生相關(guān)，但不能作為預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者腰椎骨折組血漿CXCL12水平顯著高于非骨折組，血漿CXCL12濃度與Genant半定量分級(jí)呈正相關(guān)。與絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松患者及對(duì)照組相比，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者股骨頸、全髖關(guān)節(jié)及腰椎的骨密度顯著降低，且血漿CXCL12水平與股骨頸、全髖和腰椎骨密度呈顯著負(fù)相關(guān)。血漿CXCL12水平升高也與視覺(jué)模擬評(píng)分(VAS)和Oswestry殘疾指數(shù)評(píng)分(ODI)的嚴(yán)重程度相關(guān)。此外，CXCL12水平的升高也與炎癥標(biāo)志物TNF-α和骨吸收因子CTX-1呈正相關(guān)。這些研究發(fā)現(xiàn)血漿CXCL12水平與骨密度改變呈顯著的相關(guān)性，且其升高的水平可反映骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度，可作為反映骨吸收的標(biāo)志物。

3 凝溶膠蛋白

凝溶膠蛋白(Gelsolin，GSN)是鈣依賴性的凝溶膠蛋白超家族的成員，通過(guò)切斷、封端肌動(dòng)蛋白絲，或使肌動(dòng)蛋白聚集成核等方式來(lái)控制肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)，作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，參與破骨細(xì)胞胞足體的組裝和移動(dòng)過(guò)程，GSN缺陷可阻礙破骨細(xì)胞胞足體的組裝，使骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度增加。此外，GSN可能通過(guò)整合素的激活將破骨細(xì)胞與骨基質(zhì)聯(lián)系起來(lái)，從而最終激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收。

但是在不同的研究中，GSN與骨密度之間的聯(lián)系并不是單一的。墨西哥的一項(xiàng)研究[14]發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后女性低骨量和骨質(zhì)疏松患者中血清GSN水平降低但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。外周血單核細(xì)胞(PBMs)作為破骨細(xì)胞的前體，產(chǎn)生對(duì)破骨細(xì)胞發(fā)育重要的細(xì)胞因子，在骨代謝中發(fā)揮重要作用。一項(xiàng)對(duì)極高值及極低值骨密度高加索男性的PBMs的細(xì)胞質(zhì)蛋白組學(xué)分析[15]發(fā)現(xiàn)，極低骨密度患者GSN表達(dá)顯著升高。同樣一項(xiàng)對(duì)6 000多例樣本采取極端采樣法選取極高及極低骨密度樣本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，血漿GSN水平在男性極高和極低骨密度人群中無(wú)顯著差異，但是在絕經(jīng)后女性中GSN水平在極低骨密度組顯著升高，與髖關(guān)節(jié)骨密度呈負(fù)相關(guān)[16]。兩項(xiàng)對(duì)絕經(jīng)后女性中GSN與骨密度的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，較絕經(jīng)前女性，絕經(jīng)后女性GSN水平顯著升高；較正常骨密度組比較，低骨量或骨質(zhì)疏松組中血漿GSN水平顯著升高，血漿GSN與絕經(jīng)后女性髖部骨密度之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，且GSN是股骨頸、腰椎骨密度的獨(dú)立影響因素。目前研究表明血漿GSN或可作為診斷骨質(zhì)疏松的骨吸收生化標(biāo)志物，但仍需對(duì)其進(jìn)行更深入和廣泛的研究。

4 膜聯(lián)蛋白A2

膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)是一種表達(dá)在外周血單核細(xì)胞表面的鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能刺激單核細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和破骨細(xì)胞的形成。然而，ANXA2在骨重塑中的作用并不局限于破骨形成，通過(guò)對(duì)ANXA2缺失的MC3T3-E1小鼠成骨前體細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn)[19]表明，ANXA2能夠促成骨前體細(xì)胞的增殖和分化，從而影響骨形成。

在絕經(jīng)后高加索女性中[20]發(fā)現(xiàn)ANXA2在低骨量和骨質(zhì)疏松患者中表達(dá)增加。近期有研究發(fā)現(xiàn)[21]，相對(duì)于無(wú)骨折患者，骨質(zhì)疏松性骨折患者的PBMs中ANXA2蛋白表達(dá)顯著升高。血漿ANXA2蛋白水平與中國(guó)老年人髖關(guān)節(jié)骨密度呈負(fù)相關(guān)，并且在骨密度極低的人群中顯著高于骨密度極高人群。同時(shí)研究觀察到，ANXA2以濃度依賴性的方式調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，較低濃度的ANXA2蛋白可促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的作用在較高濃度(>50 ng/mL)時(shí)減弱，ANXA2對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的雙重反向作用表明，血漿中ANXA2蛋白可能在體內(nèi)骨形成與骨吸收的偶聯(lián)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

這些研究表明ANXA2可能是骨質(zhì)疏松的潛在生化標(biāo)志物，但是目前對(duì)于ANXA2的臨床研究少，血漿中ANXA2水平能否預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松還有待于進(jìn)一步的縱向研究。

5 微小RNA

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，大多數(shù)miRNAs是高度保守的，miRNA對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的增殖和分化均有調(diào)控作用，miRNAs通過(guò)降低Runx2的穩(wěn)定性和乙?；?、阻遏Wnt/β-catenin信號(hào)通路[22]等抑制成骨細(xì)胞的分化，削弱Hmga2對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用、抑制Smad7減輕Runx2的抑制作用、減輕c-Cbl對(duì)IP3K/ATK信號(hào)通路的拮抗作用等[23-25]促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化；miRNAs通過(guò)影響RANKL相關(guān)的因子表達(dá)抑制或促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及功能[26]。

miRNAs在不同靶細(xì)胞中對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的調(diào)控具有時(shí)序性和組織特異性。miR-29a通過(guò)結(jié)合RANKL的3’UTR抑制成骨細(xì)胞RANKL的分泌。抑制組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(PCAF)介導(dǎo)的組蛋白3賴氨酸27(H3K27ac)乙?；档虷3K27ac在CXCL12啟動(dòng)子中的富集，從而減少破骨細(xì)胞分化。在骨鈣素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的成骨細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-29a的小鼠比野生型小鼠表現(xiàn)出更高的骨密度、骨小梁體積和骨質(zhì)量[27]。Liu等[28]發(fā)現(xiàn)與年輕患者相比，miR-96在老年患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，使多種骨形成標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后女性患者血清miR-96水平與血清骨堿性磷酸酶(SBALP)呈負(fù)相關(guān)。在大鼠和人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-203的過(guò)表達(dá)通過(guò)直接靶向Dkk1mRNA增加了許多骨形成標(biāo)志物表達(dá)，從而得出miR-203可以促進(jìn)BMSC向成骨細(xì)胞分化；在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與正常受試者相比，骨質(zhì)疏松婦女的miR-203水平顯著降低[29-30]。使用RT-PCR檢測(cè)骨質(zhì)疏松患者和健康對(duì)照組之間的循環(huán)miRNAs。以人和小鼠成骨細(xì)胞系為研究對(duì)象，檢測(cè)miRNAs的誘導(dǎo)差異。作者發(fā)現(xiàn)150個(gè)檢測(cè)的miRNA中有14個(gè)在患者和健康對(duì)照之間顯著異常表達(dá)。結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松患者miR-328-3p、let-7 g-5p、miR-133b、miR-22-3p、miR-2861、miR-518 miR-100表達(dá)下調(diào)，而miR-10b-5p、miR-21、miR-125b、miR-127表達(dá)上調(diào)。MiR-10b-5p增加人、小鼠成骨細(xì)胞ALP活性和礦物質(zhì)沉積，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。MiR-328-3p和let-7 g-5p降低ALP活性，抑制礦物質(zhì)沉積[31]。

miRNA以被包裹在胞囊內(nèi)或與相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合的方式被釋放到細(xì)胞外液中稱為循環(huán)miRNA，是非常穩(wěn)定的物質(zhì)，可以使用金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如定量聚合酶鏈反應(yīng))進(jìn)行測(cè)量，使得miRNA有潛力成為新的診斷骨質(zhì)疏松相關(guān)性疾病的生化標(biāo)志物。

6 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)屬于免疫球蛋白超家族跨膜蛋白中的一員，被發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性分泌(ES)和可溶性分泌(S)兩種細(xì)胞外分泌形式，能夠與多種內(nèi)源性及外源性配體結(jié)合，在調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。RAGE激活改變了骨細(xì)胞中大量下游信號(hào)通路，RAGE缺乏的破骨細(xì)胞整合素表達(dá)減少，抑制破骨細(xì)胞的成熟和粘附；在成骨細(xì)胞中，RAGE與配體結(jié)合激活增加了Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低了細(xì)胞活力，激活了beclin1和lc3b介導(dǎo)的自噬[32]。

體外研究發(fā)現(xiàn)[33]，在RAGE缺失小鼠中分離的骨髓細(xì)胞中RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化/活性減弱，并且RAGE缺乏導(dǎo)致破骨細(xì)胞形態(tài)缺陷，這與破骨細(xì)胞分化減少以及骨吸收相關(guān)。這些破骨細(xì)胞缺陷是由于RAGE缺失骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMMs)和破骨前細(xì)胞中αvβ3依賴信號(hào)通路的缺陷和肌動(dòng)蛋白基細(xì)胞骨架組織的減弱。與野生型小鼠相比，RAGE缺乏小鼠骨密度、骨質(zhì)量顯著增加，破骨細(xì)胞數(shù)量減少[34]。RAGE缺乏小鼠的IL-6和吡啶啉水平顯著降低而ALP水平無(wú)明顯差異，提示RAGE缺乏可能主要影響破骨細(xì)胞功能，而不影響成骨細(xì)胞。去卵巢RAGE缺乏小鼠骨密度無(wú)顯著變化，而對(duì)照組小鼠骨密度顯著降低，表示RAGE缺乏小鼠的骨吸收受到抑制。RAGE缺乏導(dǎo)致破骨細(xì)胞形成和功能降低，骨密度、骨質(zhì)量增加。

但是不同的研究發(fā)現(xiàn)sRAGE與骨密度的相關(guān)性是不一致的。對(duì)84名絕經(jīng)后女性研究發(fā)現(xiàn)[35]，骨質(zhì)疏松和低骨量患者血清sRAGE水平顯著高于骨密度正常人群，且在骨質(zhì)疏松和低骨量人群中，sRAGE水平與骨折風(fēng)險(xiǎn)增加存在相關(guān)性。但在老年男性中研究[36]發(fā)現(xiàn)esRAGE與骨形成標(biāo)志物P1NP、骨鈣素呈正相關(guān)，且這種相關(guān)性在患糖尿病的男性中更加顯著。同時(shí)有研究表示[37]，絕經(jīng)后女性2型糖尿病組與對(duì)照組sRAGE水平無(wú)顯著差異，同時(shí)血清sRAGE水平與2型糖尿病組的骨密度、骨折患病率、骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物均沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

RAGE被認(rèn)為是刺激破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化和功能的信號(hào)事件的重要因素，低esRAGE水平已被報(bào)道為2型糖尿病患者椎體骨折的危險(xiǎn)因素，其可能在監(jiān)測(cè)骨質(zhì)疏松進(jìn)展方面具有潛在的診斷作用，但其在臨床應(yīng)用上的研究較少，需進(jìn)一步深入研究其在預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)上的價(jià)值。

目前國(guó)際上仍以骨密度作為診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)，但隨著對(duì)骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)其能更早反映骨重建，且具有無(wú)創(chuàng)性、及時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物已經(jīng)應(yīng)用于臨床。對(duì)于新的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物還需要更深入及廣泛的研究其在臨床應(yīng)用上的特異性、靈敏性、穩(wěn)定性等特征，使其能更好地應(yīng)用于骨代謝疾病的診斷及鑒別診斷、藥物開(kāi)發(fā)以及骨質(zhì)疏松癥治療療效的臨床監(jiān)測(cè)。