環(huán)狀核糖核酸在骨質(zhì)疏松癥中的研究進(jìn)展

劉鑫 張亮 石鵬志 王平川 王俊武 張鈺 胡滿 趙文杰 王靜成*

1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225001 2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225001 3.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是由多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病[1]。OP已經(jīng)成為我國中老年人群的重要健康問題，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)50歲以上男性O(shè)P患病率為6.0%，女性患病率則達(dá)到32.1%，65歲以上女性的OP患病率更是高達(dá)51.6%[2]。脆性骨折是OP的最常見臨床并發(fā)癥，常累及髖骨、股骨和脊柱等部位，導(dǎo)致疼痛、畸形、功能障礙甚至死亡。因此研究OP的發(fā)病機(jī)制及早期診斷標(biāo)志物十分重要。

環(huán)狀RNA(circRNAs)是一類在真核細(xì)胞中廣泛存在并多樣的內(nèi)源性非編碼RNA，通過將RNA的3’端連接到5’端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，表達(dá)穩(wěn)定，不易降解[3]。circRNsA的高豐度、穩(wěn)定性和物種間的進(jìn)化保守性賦予其許多潛在功能[4]。circRNAs具有多個miRNA的保守結(jié)合位點，能夠競爭性結(jié)合內(nèi)源性mRNA，作為分子海綿有效抑制其活性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大量哺乳動物細(xì)胞中均存在豐富且穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源性circRNAs，而且有一些外顯子circRNAs可充當(dāng)miRNA海綿，并通過“mRNA陷阱”機(jī)制調(diào)節(jié)線性蛋白質(zhì)編碼RNA產(chǎn)物的表達(dá)[5]。越來越多的證據(jù)表明，circRNAs在細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理病理反應(yīng)等多種生物學(xué)過程以及OP的診治中發(fā)揮重要作用[6]。因此，本文就circRNAs在成骨及破骨分化中的miRNA海綿作用、成骨分化過程中和OP患者中circRNAs的表達(dá)譜、以及circRNAs作為OP潛在診斷生物標(biāo)志物等方面進(jìn)行綜述，以期對OP診治的發(fā)展有所幫助。

1 circRNAs的miRNA海綿作用

研究發(fā)現(xiàn)circRNAs含有多個miRNA反應(yīng)元件(MREs)，在轉(zhuǎn)錄后水平通過發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous，ceRNA)的作用對靶基因進(jìn)行調(diào)控，作為miRNA海綿來競爭性結(jié)合miRNA[7]。

1.1 circRNAs與成骨分化

在人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hASCs)成骨分化過程中，Shen等[8]研究發(fā)現(xiàn)circFOXP1和FOXP1的表達(dá)水平呈上升趨勢，而miR-33a-5p的表達(dá)水平逐漸下降；circFOXP1過表達(dá)可以降低miR-33a-5p表達(dá)，增強(qiáng)FOXP1的mRNA表達(dá)，而circFOXP1敲除則導(dǎo)致相反結(jié)果；circFOXP1和miR-33a-5p的表達(dá)水平不受FOXP1調(diào)節(jié)；過表達(dá)circFOXP1或FOXP1的hASCs的堿性磷酸酶染色和活性均顯著增強(qiáng)；并且茜素紅染色和定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circFOXP1或FOXP1可以顯著促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化。因此認(rèn)為circ-FOXP1與miR-33a-5p結(jié)合后通過作用于FOXP1促進(jìn)hASCs的成骨分化。

通過對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)患者進(jìn)行核糖核酸序列和生信分析，Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)PMOP中circRNA_0016624和骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)表達(dá)明顯下調(diào)。在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)的成骨分化過程中，circRNA_0016624和BMP2表達(dá)升高，而miR-98表達(dá)降低。此外，過表達(dá)circRNA_0016624可以增加BMP-2表達(dá)，降低miR-98表達(dá)，而下調(diào)circRNA_0016624則表現(xiàn)出相反結(jié)果；進(jìn)一步研究通過茜素紅S染色法檢測細(xì)胞分化程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRNA_0016624可以明顯促進(jìn)成骨分化，這可能為OP的治療提供新思路。

Xu等[10]研究發(fā)現(xiàn)在hBMSCs成骨分化過程中，circRNA_0011269和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)表達(dá)升高，而miR-122表達(dá)降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circ_0011269可以抑制miR-122表達(dá)，促進(jìn)RUNX2表達(dá)，而沉默circ_0011269則獲得相反結(jié)果；過表達(dá)miR-122可以抑制RUNX2表達(dá)，但對circ_0011269表達(dá)無明顯影響；過表達(dá)circRNA_0011269可以顯著上調(diào)成骨相關(guān)的生物標(biāo)志物表達(dá)，而過表達(dá)miR-122則可以顯著下調(diào)表達(dá)。Ji等[11]通過測序發(fā)現(xiàn)OP患者BMSCs中circ_0006215表達(dá)降低，過表達(dá)circ_0006215可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)成骨相關(guān)基因COL1A1、RUNX2和成骨細(xì)胞分泌蛋白表達(dá)；通過堿性磷酸酶染色和茜素紅染色定量分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)或沉默circ_0006215可以顯著促進(jìn)或抑制BMSCs的成骨分化；通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)或敲除circ_0006215則可以顯著增加或降低BMSCs中circ_0006215表達(dá)；而circ_0006215可能是通過與miRNA-942-5p結(jié)合，從而調(diào)節(jié)BMSCs中RUNX2和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)。由此說明成骨分化可與血管生成相偶聯(lián)，因此，成骨-血管生成偶聯(lián)可能成為今后OP病因及治療研究的一個方向。另外，其他相關(guān)研究[2,12-22]也報道其他不同circRNAs可以作為miRNA的海綿通過其他信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化(表1)。

表1 circRNAs在成骨分化中的miRNA海綿作用Table 1 miRNA sponge effect of circRNAs in osteogenic differentiation

1.2 circRNAs與破骨分化

circRNAs和miRNA在PMOP的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過RNA測序和生信分析等方法，Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)circ_0007059在PMOP患者和hBMSCs破骨分化過程中表達(dá)上調(diào)，而過表達(dá)circ_0007059可以抑制hBMSCs向破骨細(xì)胞分化；另外，破骨分化過程中BMP-2表達(dá)下調(diào)，circ_0007059可以靶向miR-378從而調(diào)控BMP-2表達(dá)；轉(zhuǎn)染miR-378可以逆轉(zhuǎn)circ_0007059對hBMSCs中破骨細(xì)胞分化的影響，而過表達(dá)circ_0007059可以通過miR378/BMP-2信號通路抑制破骨細(xì)胞形成。因此，靶向circ_0007059/miR-378/BMP-2軸可能是治療OP的一個新靶點。

Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中circ_0000549表達(dá)下調(diào)，miR-1247-5p表達(dá)增加，破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)增加，過表達(dá)circ_0000549可以逆轉(zhuǎn)這一作用；在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中過表達(dá)circ_0000549可以上調(diào)bcl6表達(dá)，沉默circ_0000549可以降低bcl6表達(dá)；此外，抑制miR-1247-5p可以明顯增加bcl6表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-1247-5p可以促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，而bcl6過表達(dá)則明顯減弱miR-12475p的促進(jìn)作用。因此，說明circ_0000549參與調(diào)節(jié)PMOP的成骨分化和破骨分化，為今后PMOP的機(jī)制研究提供了新的證據(jù)。

當(dāng)然，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的circRNAs不僅限于circ_0007059和circ_0000549，circRNA_28313和circRNA_0021739也參與其中。Chen等[25]研究發(fā)現(xiàn)體外敲除circRNA_28313后可以顯著抑制RANKL及CSF-1誘導(dǎo)的BMSCs向破骨細(xì)胞分化，而在體內(nèi)可以抑制去卵巢小鼠的骨吸收；通過檢測未經(jīng)處理和RANKAL及CSF-1處理的骨髓單核/巨噬細(xì)胞的circRNAs表達(dá)，并對破骨細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分析和鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RANKL及CSF-1處理可誘導(dǎo)circRNA_28313表達(dá)，而miR-195a可以靶向circRNA_28313和CSF-1的3′非編碼區(qū)，通過形成ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)骨髓單核/巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化，并在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用，從而影響去卵巢小鼠的骨吸收。Guan等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PMOP患者外周血單個核細(xì)胞中circRNA_0021739的高表達(dá)與破骨細(xì)胞miRNA-194-5p表達(dá)降低相關(guān)；過表達(dá)circ_0021739可以降低miRNA-502-5p表達(dá)水平，抑制破骨細(xì)胞分化。因此，miRNA-502-5p可能是circ_0021739調(diào)控破骨細(xì)胞分化的靶點。另外，其他相關(guān)研究[23-25,27]也報道了不同circRNAs可以作為miRNA的海綿來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化(表2)。

表2 circRNAs在破骨分化中的miRNA海綿作用Table 2 miRNA sponge effect of circRNAs in osteoclast differentiation

綜上，circRNAs 主要通過作為 miRNA 的海綿調(diào)控細(xì)胞的成骨分化和破骨分化，從而在OP的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

2 circRNAs的表達(dá)譜

2.1 成骨分化過程中circRNAs的表達(dá)譜

Zhang等[28]通過circRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，hBMSCs分化過程中有3 938個circRNAs表達(dá)上調(diào)，1 505個circRNA表達(dá)下調(diào)；進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析miRNA轉(zhuǎn)錄組，選擇與miRNAs負(fù)相關(guān)、具有miRNA反應(yīng)元件的circRNA構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在成骨細(xì)胞分化早期，差異表達(dá)的circRNAs的親本基因在功能上參與局部粘附、ECM-受體相互作用及鈣、胰島素和mTOR信號通路。Qian等[29]通過RNA測序檢測BMP-2誘導(dǎo)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞成骨分化過程中circRNAs的差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中74個circRNAs表達(dá)顯著上調(diào)，84個circRNAs表達(dá)顯著下調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circ_19142和circ_5846不僅與正向調(diào)控發(fā)育的生物學(xué)過程密切相關(guān)，而且與參與細(xì)胞生長和分化的成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板衍生生長因子和Wnt信號通路密切相關(guān)。Long等[30]通過circRNA微陣列分析小鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞成骨分化過程中circRNAs的差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中453個circRNAs表達(dá)上調(diào)，629個circRNAs表達(dá)下調(diào)，而其中43個circRNAs(40個上調(diào)和3個下調(diào))在成骨分化過程中的特定時間點持續(xù)變化。Li等[31]通過RNA測序分析hBMSCs成骨分化過程中的circRNAs差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)146個circRNAs差異表達(dá)，其中68個circRNAs表達(dá)下調(diào)，78個circRNAs表達(dá)上調(diào)。

因此，通過RNA測序或微陣列分析證實成骨分化過程中存在大量circRNAs差異表達(dá)，生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的circRNAs可能為今后OP的機(jī)制研究提供重要線索。

2.2 骨質(zhì)疏松癥患者的circRNAs表達(dá)譜

通過RNA測序或微陣列分析技術(shù)可以對OP患者骨組織或血清樣本中差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行檢測和分析。Shen等[8]通過circRNA微陣列分析OP患者的骨組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有2 327個circRNAs表達(dá)下調(diào)，2 645個circRNAs表達(dá)上調(diào)；進(jìn)一步選擇其中差異表達(dá)最顯著的circRNAs進(jìn)行驗證并預(yù)測相關(guān)miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circRNAs通過與miRNA結(jié)合后作為miRNA的海綿發(fā)揮作用。Yu等[9]從OP患者的血清樣本中提取總RNA后通過RNA測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)387個circRNAs差異表達(dá)，其中211個表達(dá)上調(diào)，176個表達(dá)下調(diào)。Yao等[32]對老年骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折患者外周血中的circRNAs進(jìn)行RNA測序，鑒定出884個差異表達(dá)的circRNA，其中554個表達(dá)上調(diào)，330個表達(dá)下調(diào)；并通過進(jìn)一步研究預(yù)測與這些差異表達(dá)的circRNAs相關(guān)的15條信號通路。Zhao等[33]通過circRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)PMOP患者有381個circRNAs差異表達(dá)，其中203個表達(dá)上調(diào)，178個表達(dá)下調(diào)。

綜上，通過RNA測序及circRNA微陣列分析證實在成骨分化過程中和OP患者組織中存在差異表達(dá)的circRNAs，這為今后深入探索OP的機(jī)制提供重要參考依據(jù)。

3 circRNAs作為骨質(zhì)疏松癥潛在的診斷生物標(biāo)志物

生物標(biāo)志物作為可以標(biāo)記系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生改變的生化指標(biāo)，在疾病診斷方面具有廣泛用途。Han等[13]通過circRNA測序分析發(fā)現(xiàn)OP患者中circ_0076690表達(dá)明顯下調(diào)，并與骨密度和T評分顯著相關(guān)；并且ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)circ_0076690的AUC值為0.829 9，靈敏度為79%，特異度為85%，因此認(rèn)為circ_0076690可以作為OP潛在的診斷生物標(biāo)志物。Guan等[26]通過RNA測序分析發(fā)現(xiàn)PMOP患者外周血單個核細(xì)胞中circ_0021739表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)水平與股骨、前臂及腰椎的T評分正相關(guān)；進(jìn)一步ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)circ_0021739表達(dá)在PMOP有較高的診斷價值(AUC=0.849)，因此認(rèn)為circ_0021739可能是一種潛在的PMOP診斷標(biāo)志物。Zhao等[32]通過circRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)PMOP患者外周血單個核細(xì)胞中circ_0001275表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步ROC曲線發(fā)現(xiàn)circ_0001275的AUC為0.759，因此認(rèn)為circ_0001275可以作為POMP的潛在診斷生物標(biāo)志物。除此之外，circRNA-0020 和circRNA-3832構(gòu)成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)[34]、circ_0002060[35]及circ_0006859[18]也可以作為潛在的診斷生物標(biāo)志物，這為OP的早期診斷和預(yù)防提供了新思路。

綜上所述，circRNAs作為重要的調(diào)控因子，目前主要通過circRNAs-miRNAs-mRNAs 軸的ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控成骨分化及破骨分化等多個途徑參與OP(表1、2)。目前涉及circRNA在OP發(fā)生發(fā)展機(jī)制方面的文獻(xiàn)較少，研究方法主要集中在基因測序和生物信息學(xué)分析水平，對circRNA和miRNA相互作用的研究還比較欠缺。circRNA與miRNA、mRNA彼此相互作用，構(gòu)成一個復(fù)雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與基因表達(dá)，但circRNAs-miRNAs-mRNAs軸的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。同樣，研究circRNAs調(diào)控細(xì)胞的成骨分化和破骨分化在OP中的作用還處于初級階段。因此，未來在這一領(lǐng)域的研究有助于深入了解骨代謝和OP的發(fā)生機(jī)制。此外，還需要進(jìn)行大量的研究來揭示circRNAs在臨床環(huán)境中開發(fā)治療方法的潛力，除了常規(guī)的物理治療和藥物治療外，如何從基因間的相互作用中尋找治療OP的治療方法。骨細(xì)胞在成骨分化中也有重要作用，circRNAs與骨細(xì)胞的生物功能是否相關(guān)尚不清楚，還需要深入探索。雖然目前circRNAs參與OP的具體機(jī)制尚不完全清楚，但隨著科技發(fā)展和研究深入，未來OP的治療方式有望得到進(jìn)一步發(fā)展，從而為OP的治療提供新思路和新靶點。