銀鉑復(fù)合納米材料的制備及其抗菌性能

劉雲(yún)鳳，李慧慧

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，湖北 武漢430070

0 引 言

耐藥菌相關(guān)疾病蔓延迅速，如不采取措施加以遏制，預(yù)計(jì)2050 年后每年死于耐藥菌感染的人數(shù)將達(dá)到1 000 萬[1]。同時，菌株的耐藥性也會導(dǎo)致使用抗生素的常規(guī)治療療效越來越差。所以，開發(fā)新型高抗菌活性和低耐藥性的抗菌藥物具有重要意義[2]。

納米材料具有獨(dú)特的催化和氧化能力，是抗菌應(yīng)用平臺的理想候選材料[3～5]。大量科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，銀納米粒子對一些常見的細(xì)菌具有高效的殺滅作用，例如大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等[6]。細(xì)胞中的生物大分子因含有硫、氧、氮原子而具有豐富的給電子基團(tuán)，能與銀離子發(fā)生相互作用而導(dǎo)致其失去活性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞破損、死亡[7]。為了更加充分地發(fā)揮銀的抗菌活性，一系列新穎的銀納米復(fù)合材料被制備并用 于 抗 菌 研 究[8，9]。2010 年，Chen 等[10]用 金 紅 石 型TiO2作為載體制備了納米銀與TiO2的復(fù)合材料Ag@TiO2，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Ag@TiO2用量為10 μg/mL 時可完全抑制大腸桿菌的生長，明顯優(yōu)于單獨(dú)的TiO2和Ag 納米顆粒。在抗菌材料中，金屬鉑的抗菌活性也引起了極大關(guān)注。2017 年，Cai 等[11]采用脫合金工藝，以氯鉑酸和硝酸銀為前驅(qū)體、甲醛為還原劑、多環(huán)芳烴為表面活性劑，制備了一系列PtxAg100-x(0＜x＜100)納米粒子，其中脫合金后的D-Pt50Ag50用量為20 μg/mL 時可抑制約半數(shù)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。

本文以TiO2/C 微球負(fù)載鉑納米線的復(fù)合物Pt/TiO2/C（PTC）為載體，表面負(fù)載納米銀，制備銀和鉑的復(fù)合納米材料Ag-Pt/TiO2/C（APTC），再通過3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）的氧化測試研究該復(fù)合材料的氧化物模擬酶活性和過氧化物模擬酶活性，并考察了復(fù)合材料的抗菌性能、對大腸桿菌的最低抑菌濃度以及抗菌機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

試劑：PTC 為實(shí)驗(yàn)室自制；大腸桿菌（Escherichia coliK12）由實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基配方為1%氯化鈉（m/V），1%胰蛋白胨（m/V），0.5% 酵母提取物（m/V），1.5% 瓊脂粉（m/V）；所有試劑均為分析純或更高純度，使用前無需進(jìn)一步純化，均購自上海國藥集團(tuán)；所有溶液均為超純水配制。

儀器：UV-1800 型紫外-可見分光光度計(jì)（UVVis，Shimadzu 公司），Multiskan GO 型全波酶標(biāo)儀（Thermo Scientific 公司），OTF-1200X-S 型管式爐和KSC-1100X 型馬弗爐（合肥科晶材料技術(shù)有限公司）；采用D8 Advance 型X 射線衍射儀（XRD，Bruker 公司）分析樣品中銀和鉑的晶體結(jié)構(gòu)；采用SU8010 型掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi 公司）表征樣品的形貌；采用JEOL-2100F 型透射電子顯微鏡（TEM，JEOL 公司）上的能量色散譜儀（EDS）研究樣品中各元素的分布；利用Agilent7900 型電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS，Agilent 公司）檢測樣品中Ag 的負(fù)載量。

1.2 材料制備

1.2.1 銀納米粒子的制備

用抗壞血酸還原AgNO3法合成銀納米粒子。在2.4 mL 水 中 加 入300 μL 5.6 mg/mL AgNO3溶液和300 μL 29 mg/mL 抗壞血酸，超聲分散。混合溶液在旋轉(zhuǎn)混勻器上反應(yīng)1 h，離心，去掉上清液，得到銀納米粒子，在水中超聲清洗3 次，再用無水乙醇洗滌1 次，置于真空干燥箱中于50 ℃干燥12 h，得到銀納米粒子。

1.2.2 APTC 復(fù)合材料的制備

將3 mg PTC 加入到2.4 mL 超純水中，超聲分散，加入300 μL 5.6 mg/mL AgNO3溶液，混勻，再加入300 μL 29 mg/mL 抗壞血酸。將該混合溶液置于旋轉(zhuǎn)混勻器上反應(yīng)1 h，離心，去上清，沉淀用超純水洗滌3 次，無水乙醇洗滌1 次，然后置于真空干燥箱中于50 ℃干燥12 h，得到APTC 復(fù)合材料。

1.3 氧化模擬酶和過氧化物模擬酶活性測試

在加或不加H2O2條件下測吸光度，用TMB 氧化法對APTC 的過氧化物模擬酶和氧化模擬酶活性進(jìn)行研究，并測試了pH 值對氧化模擬酶和過氧化物模擬酶活性的影響。反應(yīng)均在10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中進(jìn)行，監(jiān)測體系在652 nm 處的吸光度變化。具體步驟為：分別取400 μL pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0 的PBS 于4 個離心管中，依次加 入40 μL APTC（1 mg/mL）、40 μL TMB 溶 液（10 mmol/L）和20 μL 的H2O2(50 mmol/L)，放置10 min 觀察其顏色變化，并測試樣品的UV-Vis 吸收光譜。

1.4 抑菌性能測試

1.4.1 APTC 的抑菌效果

細(xì)菌懸浮液A：將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌母液用pH 7.0 的PBS 稀釋至1.0×108CFU/mL。細(xì)菌懸浮液B：將細(xì)菌懸浮液A 分別與不同濃度APTC 等體積混合，并在旋轉(zhuǎn)混勻器上反應(yīng)4 h，混合后APTC 濃度分別為0.25、0.5、1、2 μg/mL。細(xì)菌懸浮液C：將細(xì)菌懸浮液B 稀釋104倍。細(xì)菌懸浮液D：在細(xì)菌懸浮液B 中添加H2O2（1 mmol/L），然后稀釋104倍。分別將100 μL 細(xì)菌懸浮液C 和D 涂布于固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)12 h，考察APTC的抑菌效果。另設(shè)置3 個對照組（E. coli、E. coli+APTC、E. coli+1 mmol/L H2O2）同時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 APTC 對細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷

取1 mL 細(xì)菌懸浮液B 于離心管內(nèi)，以4 000 r/min 離 心10 min，去上 清，沉 淀 用pH 7.4 的PBS 洗滌3 次，向沉淀中加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛PBS 溶液，混勻后于冰箱中4 ℃靜置10～12 h，取出，以4 000 r/min 離心10 min，去上清，沉淀先用PBS 洗滌3 次，再按照乙醇體積百分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、100%的順序進(jìn)行梯度脫水洗滌，離心，每次10 min。將脫水洗滌后的菌體用100%叔丁醇超聲重懸兩次，每次半小時，于室溫下真空干燥，得到粉末樣品。用掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌。對照組為細(xì)菌懸浮液A。

1.4.3 APTC 的最低抑菌濃度

取5 個離心管，以LB 培養(yǎng)基作溶劑，依次配制濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 的APTC 溶液。將培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)菌離心后，用LB 培養(yǎng)基稀釋至濃度為1.0×106CFU/mL，得到細(xì)菌懸浮液E。取上述5 個濃度的APTC 溶液分別與細(xì)菌懸浮液E 等體積混合，得到5 個混合溶液，其中APTC 濃度依次為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL。以96孔板作為反應(yīng)器，每孔中注入100 μL 上述混合溶液，設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)。另設(shè)陽性對照（100 μL 含有相同細(xì)菌濃度的培養(yǎng)基）和陰性對照（100 μL 培養(yǎng)基）各3 組。將96 孔板于恒溫箱中37 ℃放置12 h，用酶標(biāo)儀測得各實(shí)驗(yàn)組于600 nm 處的光密度（OD600nm），考察APTC 的最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

從圖1(a)(b)APTC 的SEM 圖可以看到，復(fù)合材料呈球狀形貌，直徑約600 nm，表面覆蓋著納米尺寸的顆粒。進(jìn)一步研究了復(fù)合材料的元素分布，由圖1(c)～(g)可以清晰地看到，復(fù)合材料中均勻分布著C、O、Pt、Ag 和Ti 元素，證明復(fù)合材料表面成功負(fù)載了銀納米粒子。另外，通過ICP-MS 測得APTC 中Ag 實(shí)際負(fù)載量為14.30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

利用XRD 對APTC 和PTC 的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2 所示。PTC 的XRD 圖中在39.5°、46.2°、67.3°處出現(xiàn)3 個峰，分別歸屬為Pt 的3 個晶面（111）、（200）、（220）。APTC 的XRD 圖 中 在38.0°、45.0°、65.0°、75.0°處出現(xiàn)4 個峰，分別對應(yīng)Ag 的4 個晶格面（111）、（200）、（220）、（311），且Ag和Pt 的衍射峰分開，證明該復(fù)合材料中銀和鉑沒有形成合金化結(jié)構(gòu)，各自保持為典型的面心立方結(jié)構(gòu)[12]。

圖2 APTC 和PTC 的XRD 圖Fig.2 XRD patterns of APTC and PTC

2.2 APTC 的氧化模擬酶和過氧化物模擬酶活性

在加或不加H2O2條件下測吸光度，對APTC 的過氧化物模擬酶和氧化模擬酶活性用TMB 氧化法進(jìn)行了研究。如果溶液顏色變深，同時觀察到在625 nm 處有明顯的吸收峰，則說明TMB 被氧化。溶液的吸光度越高，表明材料的氧化能力越強(qiáng)。圖3（a）顯示，TC+TMB 體系在pH 6.0 或7.0 時幾乎沒有顏色變化，pH 5.0 時為輕微的藍(lán)色，吸光度為0.20，pH 4.0 時體系顯示為較深的藍(lán)色，吸光度達(dá)到1.07。這說明PTC 在偏中性環(huán)境下的催化劑幾乎沒有氧化酶活性，而在偏酸性環(huán)境下具有明顯的氧化模擬酶活性，且酸性越強(qiáng)氧化酶活性越好。圖3（b）顯示，PTC+TMB+H2O2體系在pH 7.0 時無顏色變化，此時體系沒有過氧化物模擬酶活性；在pH 5.0 和6.0 時都有明顯的顏色變化，吸光度也隨之增大；pH 4.0 時體系藍(lán)色更深，吸光度為2.16，明顯高于PTC+TMB 體系的吸光度。這說明PTC在偏酸性條件下具有過氧化物模擬酶活性，可能氧化H2O2產(chǎn)生羥基自由基[13]。綜上所述，只有在偏酸性環(huán)境下，PTC 的氧化模擬酶活性和過氧化物模擬酶活性才能顯現(xiàn)出來。

圖3（c）顯示，APTC +TMB 反應(yīng)體系在不同pH 值條件下均沒有明顯變藍(lán)色，但其吸光度在偏酸性條件下有微弱上升，表明APTC 具有較弱的氧化模擬酶活性，能夠產(chǎn)生少量的活性氧。這是由于復(fù)合材料中納米鉑產(chǎn)生的活性氧首先氧化了負(fù)載在其表面的銀納米粒子，使溶液中的活性氧濃度降低，從而減弱了對TMB 的氧化。圖3（d）顯示，APTC+TMB+H2O2體 系 在pH 5.0、6.0 和7.0 時均呈現(xiàn)藍(lán)色，且吸光度隨著pH 值的增大而增大，變化趨勢與圖3（b）相反。推測是由于酸性條件下復(fù)合材料中納米鉑產(chǎn)生的活性氧首先將其表面的納米銀氧化為銀離子，從而削弱了APTC 對H2O2產(chǎn)生羥基自由基的催化作用；隨著pH 值的增大，復(fù)合材料中納米鉑產(chǎn)生的活性氧變少，納米銀的量相對增加，增強(qiáng)了APTC 對H2O2產(chǎn)生羥基自由基的催化作用，能夠產(chǎn)生更多的羥基自由基，從而促進(jìn)了藍(lán)色氧 化 態(tài)TMB 的 生 成[14]。

圖3 4 個反應(yīng)體系不同pH 值的氧化模擬酶和過氧化物模擬酶活性（插圖為對應(yīng)的TMB 顯色照片）Fig.3 The oxidative mimics enzyme and peroxidase mimetic activity of four reaction systems at different pH (the inset is the photo of the corresponding TMB color reaction)（a）PTC +TMB；（b）PTC +TMB+H2O2；（c）APTC +TMB；（d）APTC +TMB+H2O2

基于上述結(jié)果，APTC 可用于抗菌應(yīng)用相關(guān)的研究。

2.3 APTC 的抗菌性能

在培育細(xì)菌的過程中，通過監(jiān)測細(xì)菌懸液的OD600nm值，可以判斷細(xì)菌生長是否進(jìn)入對數(shù)期。選擇處于對數(shù)期生長的細(xì)菌進(jìn)入后續(xù)研究。

圖4（a）顯示，當(dāng)細(xì)菌的存活率分別為83.64%、68.87%、53.03%和0 時，相應(yīng)的復(fù)合材料用量分別為0.25、0.5、1、2 μg/mL。隨著APTC 用量 的 增加，E.coli菌落數(shù)有明顯減少的趨勢，當(dāng)APTC 用量為2 μg/mL 時，殺菌率達(dá)到100%。進(jìn)一步探究了H2O2對反應(yīng)體系的影響。圖4（b）顯示，在H2O2存在條件下，細(xì)菌存活率分別為69.09%、34.84%、8.71%、0 時，APTC 用 量 分 別 為0.062 5、0.125、0.25、0.5 μg/mL。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明，H2O2使得復(fù)合材料的抗菌能力顯著增強(qiáng)，當(dāng)APTC 用量為0.25 μg/mL 時就可以殺滅91.29%的細(xì)菌，用量僅為未添加H2O2所需APTC 的12.5%。這與APTC 的氧化模擬酶和過氧化物模擬酶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在不加H2O2時，APTC 中由于協(xié)同作用生成的銀離子具有抗菌作用[15]；在加H2O2時，APTC 中的納米銀和納米鉑都對H2O2產(chǎn)生羥基自由基具有催化作用，通過損壞細(xì)菌細(xì)胞膜的功能[16]達(dá)到殺菌的目的。

圖4 不同處理后細(xì)菌存活率柱狀圖（a）：①空白對照，②～⑤APTC（0.25，0.5，1，2 μg/mL）；（b）：⑥H2O（21 mmol/L），⑦～⑩APTC（0.062 5, 0.125, 0.25, 0.5 μg/mL）+H2O（21 mmol/L）Fig.4 The corresponding bar graph of bacterial survival rate after different treatments（a）：①Blank，②～⑤APTC（0.25，0.5，1，2 μg/mL）；（b）：⑥H2O（21 mmol/L），⑦～⑩APTC（0.062 5, 0.125, 0.25, 0.5 μg/mL）+H2O（21 mmol/L）

由圖5（a）大腸桿菌和APTC 處理過的大腸桿菌的SEM 圖像可見，表面比較光滑的是正常的E.coli，而被APTC 處理后，細(xì)菌表面變得粗糙，表明細(xì)菌的細(xì)胞壁受到了損傷。這種損傷可以從兩方面解釋：一是APTC 復(fù)合材料產(chǎn)生的銀離子與細(xì)胞內(nèi)含S、O 或N 生物大分子上的給電子基團(tuán)相互作用致其失活[7]，從而導(dǎo)致細(xì)胞破損而死亡；二是銀離子通過靜電吸附與細(xì)菌上帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁的功能受損[17]。

圖5 大腸桿菌（a）和APTC 處理過的大腸桿菌（b）的SEM 圖Fig.5 SEM images ofE. coli(a)andE. colitreated by APTC (b)

進(jìn)一步測試了APTC 復(fù)合材料的最低抑菌濃度。將一定量的細(xì)菌分別與不同用量的APTC 復(fù)合材料（3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL）37 ℃培養(yǎng)過夜，設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)。表1 為對應(yīng)的OD600nm的數(shù)據(jù)。除去陰性對照的值，APTC 用量為50 μg/mL時OD600nm值最?。浑S著APTC 用量的減少，OD600nm值逐漸增大；扣除陰性對照背景值之后，APTC 用量 為50 μg/mL 與25 μg/mL 時，OD600nm值 均 小 于0.1，APTC 用量 為25 μg/mL 時溶 液是澄 清的，當(dāng)APTC 用量降至12.5 μg/mL 時溶液呈現(xiàn)渾濁。因此，APTC 的最低抑菌濃度為25 μg/mL。測試了添加H2O2對復(fù)合材料抗菌效果的影響，發(fā)現(xiàn)體系中是否添加H2O2抗菌效果相差不多。推測是由于體系在37 ℃下培育，較高的溫度使H2O2分解，其作用未得到體現(xiàn)。另外還制備了銀納米顆粒用于抗菌實(shí)驗(yàn)，當(dāng)其濃度為50 μg/mL 時未顯示出明顯的抗菌效果，說明由于APTC 復(fù)合材料中各成分的協(xié)同作用，增強(qiáng)了整體的抗菌能力。

表1 不同用量APTC 與細(xì)菌孵育過夜后體系的OD600 nmTable 1 OD600 nmof APTC with different concentration and bacteria incubated overnight

3 結(jié) 語

本文在TiO2/C 微球負(fù)載鉑納米線表面負(fù)載銀納米粒子，制備了多元銀鉑復(fù)合納米材料APTC，并通過XRD、SEM、EDS 等技術(shù)進(jìn)行表征。TMB氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對于PTC，APTC 復(fù)合材料在中性條件下有著更好的過氧化物模擬酶活性?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果表明：APTC 復(fù)合材料對大腸桿菌具有很好的抗菌能力，用量為2 μg/mL 時，僅通過與大腸桿菌混合放置，殺菌率就達(dá)到100%，進(jìn)一步在體系中加入1 mmol/L H2O2后，則只需要0.25 μg/mL，抑菌率就達(dá)到91.29%，此用量僅為未加H2O2時用量的12.5%；APTC 復(fù)合材料的最低抑菌濃度為25 μg/mL。綜上所述，APTC 復(fù)合材料用于抑菌有潛在的應(yīng)用前景。