海王鹿皮膠免疫調(diào)節(jié)作用研究*

李會(huì)影 康櫻櫻 王慶 翟英濯 程憲春

吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021

動(dòng)物藥作為中藥的三大來源之一，在我國(guó)具有悠久的應(yīng)用歷史，豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。目前，常用有六種補(bǔ)膠藥材，如阿膠、黃明膠、龜甲膠、鱉甲膠、鹿角膠、魚鱗膠等，均存在廣闊的發(fā)展?jié)摿?。海王鹿皮膠是由吉林海王健康生物科技有限公司研制的，以養(yǎng)殖鹿鹿皮為原料，經(jīng)熬膠取汁、濃縮凝膠等工藝制成的符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的普通食品[1，2]。探討海王鹿皮膠的免疫調(diào)節(jié)功能是針對(duì)鹿皮膠的全新研究，通過建立免疫低下動(dòng)物模型，觀察海王鹿皮膠與阿膠對(duì)免疫低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用差異，為將海王鹿皮膠開發(fā)成為保健食品提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 鹿皮膠 鹿皮膠，吉林海王健康生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20180621。以養(yǎng)殖鹿鹿皮為原料，棕色至棕紅色的長(zhǎng)方形塊狀固體，味微甜，略腥。配置方法:用少量黃酒中蒸化配置合適濃度的水溶液。

1.2 阿膠 阿膠，山東東阿阿膠股份有限公司提供，批號(hào):20180910。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)小鼠，昆明種，性別:雄性，體重18～22g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(遼)2020－0001。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室，室溫:22－25℃，相對(duì)濕度:40%－50%。采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，墊料為玉米芯，放射線同位素鈷60輻照消毒。雌、雄分籠飼養(yǎng)，每籠10只。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。

2 試驗(yàn)方法

2.1 鹿皮膠對(duì)免疫低下小鼠單核－巨噬細(xì)胞系統(tǒng)碳粒廓清功能的影響 取健康昆明種小鼠60只，體重18～22g，雄性，采用隨機(jī)數(shù)字法，將其分為5組，正常對(duì)照組、阿膠對(duì)照組、鹿皮膠高劑量組、鹿皮膠中劑量組、鹿皮膠低劑量組，每組10只，各組均連續(xù)給樣品30天。從給藥第27天開始，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按劑量50mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3天。于末次灌胃后1小時(shí)，各鼠由尾靜脈按劑量(0.1ml/10g體重)注射印度墨汁，然后在注射2min及12min時(shí)，從小鼠眼靜脈叢取血20ul，加入濃度為0.1%碳酸鈉溶液2ml中，搖勻，靜置1h，然后以碳酸鈉溶液作空白對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)光密度OD值[3]。最后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，剖取肝臟、脾臟稱重，計(jì)算廓清指數(shù)K值、吞噬指數(shù)α值。結(jié)果見表1。

2.2 鹿皮膠對(duì)免疫低下小鼠免疫器官重量的影響 取60只健康昆明種小鼠，性別為雄性。體重為18～22g，分組給藥方式如2－1。阿膠對(duì)照組和鹿皮膠高劑量組、鹿皮膠中劑量組、鹿皮膠低劑量組按以上所示劑量。從給藥第27天開始，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按劑量50mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3天。建立免疫機(jī)能低下小鼠模型，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。各組小鼠于末次給藥后，禁食不禁水12h，稱重，脫頸椎處死，仔細(xì)剝離脾臟、胸腺后稱重，并計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)[4]。

2.3 鹿皮膠對(duì)免疫低下小鼠血清溶血素的影響 取60只健康昆明種小鼠，性別為雄性。體重為18～22g，分組給藥方式如2－1。阿膠對(duì)照組和鹿皮膠高劑量組、鹿皮膠中劑量組、鹿皮膠低劑量組按以上所示劑量。從給藥第27天開始，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠按劑量50mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)3天。建立免疫機(jī)能低下小鼠模型，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。①SRBC:于綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中搖動(dòng)脫纖維，4℃冰箱保存。②制備補(bǔ)體:采集多只豚鼠血分離血清，將1ml壓積的SRBC加入到5ml豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，經(jīng)常震蕩，離心取上清，用時(shí)以SA液按1:8稀釋。③免疫動(dòng)物 取羊血，用生理鹽水洗滌3次，2000r/min每次離心10min。將SRBC配成2%(v/v)的生理鹽水細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2ml進(jìn)行免疫，5d后，摘眼球取血至離心管中，放置1h，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。④溶血反應(yīng):將血清∶SA緩沖液＝1∶200(V/V)稀釋后，冰浴中各試管依次加入0.5m L 稀釋血清、0.25m L 10%SRBC、0.5ml補(bǔ)體(用SA液按1∶8稀釋)，另設(shè)不加血清的對(duì)照管(以SA緩沖液代替)。置37℃ 恒溫水浴中保溫10～15min，冰浴終止反應(yīng)。2000r/min離心10min，取上清液0.5m L，加都氏液1.5m L。同時(shí)取10%SRBC 0.125m L，加 都 氏液1.875m L，充分混勻，室溫放置10min，于570nm 處以對(duì)照管做空白，分別測(cè)血清溶血素含量，計(jì)算半數(shù)溶血值(HC50)[5]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 海王鹿皮膠對(duì)小鼠單核－巨噬細(xì)胞功能的影響表1結(jié)果表明:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的廓清指數(shù)明顯降低，P＜0.001，差異極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；吞噬指數(shù)略降低，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明免疫低下小鼠模型復(fù)制成功。與模型對(duì)照組比較，海王鹿皮膠高劑量組的廓清指數(shù)K值明顯升高，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；阿膠對(duì)照組的廓清指數(shù)K值無明顯變化，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 海王鹿皮膠對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響(±s)

表1 海王鹿皮膠對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，＃P＜0.05，＃＃＃P＜0.001，與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 動(dòng)物數(shù)(只) 劑量(g/kg) 廓清指數(shù)K值 吞噬指數(shù)α值正常對(duì)照組 10 －－ 0.060±0.016 6.617±0.474模型對(duì)照組 10 0.016±0.010＃＃＃ 5.240±1.556＃阿膠對(duì)照組 10 0.39 0.024±0.015 5.595±0.994海王鹿皮膠組 10 1.04 0.027±0.007* 6.042±0.673海王鹿皮膠組 10 0.52 0.021±0.004 5.587±0.454海王鹿皮膠組 10 0.26 0.023±0.011 5.963±1.183

3.2 海王鹿皮膠對(duì)小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響 表2結(jié)果表明:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明免疫低下小鼠模型復(fù)制成功。與模型對(duì)照組比較，海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數(shù)明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；阿膠對(duì)照組的胸腺指數(shù)明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且阿膠對(duì)照組和海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數(shù)比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 海王鹿皮膠對(duì)小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響(n=10，±s)

表2 海王鹿皮膠對(duì)小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響(n=10，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，＃＃＃P＜0.001，與模型對(duì)照組比較，***P＜0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別 動(dòng)物數(shù)(只) 劑量(g/kg) 脾指數(shù)(mg/g) 胸腺指數(shù)(mg/g)正常對(duì)照組 10 — 3.346±0.316 1.127±0.364模型對(duì)照組 10 — 1.951±0.302＃＃＃ 0.330±0.256＃＃＃阿膠對(duì)照組 10 0.39 2.191±0.595 1.015±0.286***海王鹿皮膠組 10 1.04 2.272±0.493 0.865±0.296***海王鹿皮膠組 10 0.52 1.823±0.387 0.574±0.372海王鹿皮膠組 10 0.26 1.771±0.371 0.311±0.162

3.3 海王鹿皮膠對(duì)免疫低下小鼠血清溶血素的影響表3結(jié)果表明:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠的半數(shù)溶血值顯著降低，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明免疫低下小鼠模型復(fù)制成功。與模型對(duì)照組比較，海王鹿皮膠高劑量組、海王鹿皮膠中劑量組的半數(shù)溶血值明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；阿膠對(duì)照組的半數(shù)溶血值明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。阿膠對(duì)照組和海王鹿皮膠高劑量組的半數(shù)溶血值比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 海王鹿皮膠對(duì)免疫低下小鼠血清溶血素的影響

3 討 論

鹿產(chǎn)業(yè)是吉林省重要優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，發(fā)展?jié)摿Υ?、后勁足，鹿皮膠保健食品的開發(fā)將有利于帶動(dòng)我省鹿業(yè)產(chǎn)品又快又好的提升。由于傳統(tǒng)驢皮膠(阿膠)具有補(bǔ)血、止血、抗氧化、抗休克的作用，尤其是在機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)方面得到廣泛的證實(shí)。人們也日益重視鹿皮膠能否在增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面發(fā)揮與驢皮膠同樣的功效，為此，深入研究鹿皮膠與驢皮膠在增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面的作用差異，為鹿皮膠保健食品的開發(fā)提供理論支持。本組試驗(yàn)研究表明，與模型對(duì)照組比較，海王鹿皮膠高劑量組的廓清指數(shù)K值明顯升高，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數(shù)明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；海王鹿皮膠高劑量組的胸腺指數(shù)明顯升高，P＜0.001，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明海王鹿皮膠與阿膠在提高免疫功能方面作用相當(dāng)。綜上所述，海王鹿皮膠可明顯增強(qiáng)免疫功能低下小鼠的免疫功能，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。