半夏瀉心湯及其不同拆方對抗生素誘導(dǎo)的菌群紊亂幼鼠結(jié)腸黏膜屏障的影響

張映紅，戴麗蓉，陳啟明，劉喜平，岳娟，施麗娟，朱中博，李沛清

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

人體胃腸道是一個巨大的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道菌群與其他組織及系統(tǒng)共同構(gòu)成了腸道黏膜的生物屏障。正常情況下，腸道菌群在腸道內(nèi)環(huán)境與機(jī)體形成一種互相依存、互相制約的共生關(guān)系，并維持動態(tài)平衡。在生命早期階段，腸道菌群對免疫系統(tǒng)的形成至關(guān)重要也最易受到干擾，使菌群比例失調(diào)，破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，改變免疫應(yīng)答，造成代謝障礙，還會使條件致病菌過度增殖、腸黏膜屏障受損，消弱機(jī)體免疫，增加腸道通透性，成為功能性胃腸病、炎癥性腸病及一系列感染性疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。因此，基于生命早期階段腸道菌群紊亂后腸黏膜屏障功能的改變，研究腸道菌群功能及藥物的干預(yù)效應(yīng)，對防治腸上皮屏障損傷相關(guān)胃腸道疾病具有重要意義。半夏瀉心湯出自《傷寒論》，全方辛開苦降，甘補(bǔ)益脾，調(diào)和胃腸。臨床研究表明，半夏瀉心湯可通過調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)改善菌群失調(diào)炎癥性腸病等引起的腸黏膜受損，能提高機(jī)體免疫機(jī)能，減輕炎性反應(yīng)，保護(hù)胃腸黏膜。本研究采用抗生素暴露致幼鼠腸道菌群失調(diào)并經(jīng)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，觀察半夏瀉心湯及其不同拆方對菌群失調(diào)幼鼠腸道菌群及結(jié)腸黏膜屏障的影響，進(jìn)一步探討半夏瀉心湯干預(yù)效應(yīng)與其配伍的關(guān)系，以期為中醫(yī)藥防治腸上皮屏障損傷相關(guān)胃腸道疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

3～4周齡SPF級雄性Balb/c幼鼠70只，體質(zhì)量（15±2）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心，溫度（22±1）℃，相對濕度45%～65%，12 h明暗交替，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔自來水喂養(yǎng)。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2020-264）。

1.2 藥物及制備

半夏瀉心湯（法半夏60 g，干姜45 g，黃芩45 g，黃連15 g，人參45 g，大棗20枚，甘草45 g），飲片購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院景明教授鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)半夏瀉心湯配伍規(guī)則，將其分為全方組（法半夏60 g，干姜45 g，黃芩45 g，黃連15 g，人參45 g，大棗20枚，甘草45 g）、辛開組（法半夏60 g，干姜45 g）、苦降組（黃芩45 g，黃連15 g）和甘補(bǔ)組（人參45 g，大棗20枚，甘草45 g）。各組藥物飲片浸泡30 min，煎煮2次，第一次加8倍量水煎煮1 h，第二次加6倍量水煎煮45 min，合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮至全方組、辛開組、苦降組、甘補(bǔ)組原藥材濃度分別為0.91、0.32、0.18、0.41 g/mL。雙歧桿菌四聯(lián)活菌片，批號202005244，杭州遠(yuǎn)大生物，用生理鹽水溶解，配制成濃度為68 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

氨芐西林膠囊（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號96003103）；硫酸新霉素、兩性霉素B、甲硝唑、脂多糖（北京索萊寶，批號分別為70210512、511B059、827L021、408Z033）；鹽酸萬古霉素（上海源葉生物，批號H13M11Y11310）；Occludin、ZO-1抗體（英國Abcam公司，貨號分別為ab216327、ab96587）；糞便清蛋白ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號202102）。ECLIPSE Ti型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；LEICA2016型切片機(jī)（德國Leica公司）；JY-SCZ2+型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；DYCZ-40B型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；SpecraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc MP型數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 混合抗生素溶液配制

參考文獻(xiàn)[9]方法，使用生理鹽水配制混合抗生素溶液，鹽酸萬古霉素、硫酸新霉素、兩性霉素B、氨芐西林、甲硝唑濃度分別為5、10、0.1、10、10 mg/mL。

2.2 造模、分組及給藥

幼鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為空白組，其余幼鼠參考文獻(xiàn)[9]方法，每12 h予混合抗生素溶液（鹽酸萬古霉素50 mg/kg、硫酸新霉素100 mg/kg、兩性霉素B 1 mg/kg、氨芐西林100 mg/kg、甲硝唑100 mg/kg）灌胃制備抗生素暴露幼鼠模型，灌胃體積10 mL/kg，連續(xù)灌胃14 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽性對照組、全方組、辛開組、苦降組和甘補(bǔ)組，每組10只。按照人與動物體表面積換算等效劑量，陽性對照組、全方組、辛開組、苦降組、甘補(bǔ)組分別為0.68、9.1、3.19、1.82、4.1 g/kg，各組分別予雙歧桿菌四聯(lián)活菌片溶液、半夏瀉心湯全方及相應(yīng)拆方組藥液灌胃，空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。

2.3 腸道菌群多樣性檢測

末次灌胃12 h后，無菌收集幼鼠糞便（約0.5 mg），置于無菌EP管中，-80 ℃冰箱保存，用于16S rDNA測序分析腸道菌群。采用Illumina NovaSeq測序平臺，提取全基因組DNA。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域，使用帶Barcode的特異引物進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit進(jìn)行文庫構(gòu)建，經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。利用Uparse算法（http://www.drive5.com/uparse/）對所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，篩選出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTUs的代表序列，作物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1）。并根據(jù)OTU分類對腸道菌群α多樣性及物種差異等進(jìn)行分析。由蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司提供技術(shù)支持。

2.4 ELISA檢測糞便清蛋白含量

于“2.3”項下采集糞便6 h后，除空白組外所有幼鼠一次性腹腔注射LPS（10 mg/kg）誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，6 h后采集幼鼠糞便（約0.5 mg）于無菌EP管中，加入無菌蒸餾水充分溶解，4 000 r/min離心10 min，分離上清液，按試劑盒說明書檢測清蛋白含量。

2.5 HE染色觀察結(jié)腸組織形態(tài)

采集糞便后脫頸處死幼鼠，分離全胃腸道組織，取距離闌尾處約2 cm的近端結(jié)腸組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗干凈，4.5%多聚甲醛溶液固定10 h，石蠟包埋，切片（9 μm），常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)。

2.6 Western blot檢測結(jié)腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)

取100 mg結(jié)腸組織，加入1 mL RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清液，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，將30 μL 5×上樣緩沖液與120 μL蛋白樣品混合，于PCR儀98 ℃加熱變性5 min，冰浴5 min，重復(fù)3次。取等量蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入ZO-1、Occludin一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5次，每次6 min，加入二抗（1∶4 000），室溫孵育90 min，TBST洗膜5次，每次6 min，凝膠成像分析系統(tǒng)曝光、顯影。采用Image J 1.8軟件測量條帶灰度值，計算蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±表示，組間兩兩比較采用檢驗(yàn)、MetaStat法，多組間比較采用方差分析。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 半夏瀉心湯及其不同拆方對抗生素暴露幼鼠腸道菌群α多樣性的影響

基于幼鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)繪制稀釋曲線及Rank Abundance曲線，顯示樣品測序數(shù)據(jù)量合理、飽和。與空白組比較，模型組幼鼠腸道菌群Shannon、Chao1及Simpson指數(shù)顯著降低（＜0.01），PD指數(shù)顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，全方組及不同拆方組幼鼠腸道菌群Shannon、Simpson指數(shù)顯著升高（＜0.01），辛開組及甘補(bǔ)組幼鼠腸道菌群Chao1指數(shù)顯著降低（＜0.05），辛開組、甘補(bǔ)組及苦降組幼鼠腸道菌群PD指數(shù)顯著降低（＜0.01），全方組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；各治療組組間比較，全方組在升高Shannon指數(shù)方面最顯著（＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組幼鼠腸道菌群α多樣性比較（±s）

4.2 半夏瀉心湯及其不同拆方對抗生素暴露幼鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

LDA Effect Size分析可以確定各組之間具有顯著差異的腸道菌群物種，LDA score＞4的物種共52個，見圖1、圖2。空白組有9個差異物種，其中擬桿菌門Bacteroidetes、擬桿菌綱Bacteroidia、擬桿菌目Bacteroidales豐度較高；模型組有8個差異物種，其中 γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、腸桿菌目Enterobacterales、腸內(nèi)細(xì)菌科Enterobacteriaceae、克雷伯氏菌屬豐度較高；陽性對照組有4個差異物種，副桿菌屬、坦納菌科Tannerellaceae、腸球菌屬、腸球菌科Enterococcaceae豐度基本接近；辛開組有14個差異物種，其中擬桿菌屬、阿克曼氏菌屬、普雷沃菌屬、布勞特氏菌屬豐度較高；苦降組未見差異顯著的腸道菌群；甘補(bǔ)組有9個差異物種，其中多枝梭菌屬、梭菌屬豐度較高；全方組有8個差異物種，其中乳桿菌屬、檸檬酸桿菌屬豐度較高。

圖1 各組幼鼠腸道菌群環(huán)形進(jìn)化

圖2 各組幼鼠腸道菌群LDA score分布

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取各樣品在屬水平上豐度排名前10位的物種，繪制物種相對豐度柱形累加圖，見圖3。其中相對豐度較高的菌屬有克雷伯氏菌屬、擬桿菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬。與空白組比較，模型組幼鼠腸道克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬豐度顯著增加，擬桿菌屬、乳桿菌屬豐度顯著減少（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、全方組及不同配伍組幼鼠腸道克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬豐度顯著減少，全方組和不同配伍組幼鼠腸道擬桿菌屬、乳桿菌屬豐度顯著增加；各治療組組間比較，辛開組降低克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬豐度最顯著（＜0.01），全方組增加乳桿菌屬豐度最顯著（＜0.01），辛開組增加擬桿菌屬豐度較全方組和苦降組顯著（＜0.01）。見表2。

表2 各組幼鼠腸道菌屬水平豐度比較（±s，%）

圖3 各組幼鼠腸道菌群屬水平豐度

4.3 半夏瀉心湯及其不同拆方對抗生素暴露幼鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響

空白組幼鼠結(jié)腸絨毛發(fā)達(dá)，結(jié)腸黏膜上皮組織完整，結(jié)構(gòu)清晰，隱窩無破壞，上皮細(xì)胞排列整齊，腺體完整，可見少量炎性細(xì)胞浸潤；與空白組比較，模型組幼鼠結(jié)腸絨毛結(jié)構(gòu)發(fā)育落后，結(jié)腸黏膜上皮組織不完整，結(jié)構(gòu)不清晰，隱窩不明顯，有大量炎性細(xì)胞浸潤，腺體萎縮，有膿腫形成，細(xì)胞形態(tài)有所改變；與模型組比較，陽性對照組、全方組及不同拆方組幼鼠結(jié)腸組織腺體變長，黏膜層內(nèi)隱窩結(jié)構(gòu)損傷程度減輕，結(jié)腸黏膜組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤，其中以全方組較為明顯。見圖4。

圖4 各組幼鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.4 半夏瀉心湯及其不同拆方對抗生素暴露幼鼠糞便清蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組幼鼠糞便清蛋白含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、全方組、甘補(bǔ)組、苦降組幼鼠糞便清蛋白含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表3。4.5 半夏瀉心湯及其不同拆方對抗生素暴露幼鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的影響

表3 各組幼鼠糞便清蛋白含量比較（±s，μg/mL）

與空白組比較，模型組幼鼠結(jié)腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、全方組及不同配伍組幼鼠結(jié)腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05，＜0.01）；各治療組組間比較，全方組上調(diào)ZO-1蛋白表達(dá)最顯著（＜0.05，＜0.01），上調(diào)Occludin蛋白表達(dá)較甘補(bǔ)組顯著（＜0.05）。結(jié)果見表4、圖5。

圖5 各組幼鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白免疫印跡

表4 各組幼鼠結(jié)腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)比較（±s）

5 討論

西醫(yī)臨床兒科人群和新生兒約25%的處方藥含有抗生素，抗生素在防治各種感染性疾病的同時，也干擾了嬰幼兒腸道正常菌群?？股乇┞兑殉蔀樯缙陔A段干擾腸道菌群結(jié)構(gòu)的最常見誘因，可誘發(fā)炎癥性腸病、哮喘、肥胖、變應(yīng)性疾病等多種疾病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幼鼠抗生素暴露后腸道菌群Shannon、Chao1、Simpson指數(shù)顯著降低，PD指數(shù)升高，表明腸道菌群平衡被破壞。半夏瀉心湯全方及其不同拆方能升高Shannon、Chao1、Simpson指數(shù)，降低PD指數(shù)，其中半夏瀉心湯全方組在升高Shannon、Simpson指數(shù)方面更顯著，提示半夏瀉心湯在調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性方面更具優(yōu)勢。對差異菌的研究表明，各組差異菌種類及豐度均有顯著變化，其中辛開組差異菌最多，共有14個，苦降組無顯著差異菌。

腸道菌群屬水平分析表明，模型組腸道克雷伯氏菌屬及腸桿菌屬豐度顯著增加，擬桿菌屬和乳桿菌屬豐度顯著降低。克雷伯氏菌屬是寄生于腸道中的條件致病菌，可引發(fā)呼吸道、消化道感染，尤其是免疫功能低下的新生兒和老年人，腸桿菌屬也是常見的致病菌屬，能夠利用宿主炎癥反應(yīng)定植，過度生長，進(jìn)一步加重腸道炎癥程度。擬桿菌屬和乳桿菌屬是腸道常見的生理性菌群，其中擬桿菌屬在腸黏膜血管形成、腸道微生態(tài)平衡及提高宿主免疫方面具有重要意義。乳桿菌能通過分泌乳酸、細(xì)菌素等物質(zhì)降低腸道pH值，對腸道炎癥、氧化應(yīng)激和微生物群的共生作用產(chǎn)生有益影響，也能改善腸道菌群結(jié)構(gòu)缺陷。本研究結(jié)果表明，抗生素暴露導(dǎo)致幼鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有害菌豐度增加，有益菌豐度減少。半夏瀉心湯全方及其不同拆方能顯著降低克雷伯氏菌屬及腸桿菌屬豐度，增加擬桿菌屬和乳桿菌屬豐度。其中辛開組在降低克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬豐度方面最為顯著，辛開組、甘補(bǔ)組在增加擬桿菌屬豐度方面最為顯著，全方組在增加乳桿菌屬豐度方面最為顯著。

腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障和免疫屏障組成。機(jī)械屏障是腸黏膜屏障的最后一道防線，主要由黏膜液、微絨毛、上皮黏膜細(xì)胞緊密連接蛋白等結(jié)構(gòu)組成。緊密連接蛋白Occludin及ZO-1是反映結(jié)腸和回腸細(xì)胞旁通透性，維持腸黏膜屏障功能完整的重要標(biāo)志；糞便清蛋白能維持腸道營養(yǎng)和滲透壓，是腸黏膜屏障功能受損的指標(biāo)。已有研究表明，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物可為腸上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá)，塑造腸黏膜屏障，而腸道益生菌可通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)保護(hù)腸上皮屏障的完整性。因此，腸道菌群與緊密連接蛋白、腸黏膜屏障之間的相互協(xié)調(diào)在維持腸屏障穩(wěn)態(tài)過程中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后幼鼠結(jié)腸絨毛結(jié)構(gòu)發(fā)育落后，結(jié)腸黏膜表面上皮組織不完整，隱窩不明顯，腺體萎縮，結(jié)腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)降低，糞便清蛋白含量增加，提示腸黏膜屏障受損嚴(yán)重。半夏瀉心湯全方及其不同拆方能改善結(jié)腸組織病理形態(tài)，促進(jìn)Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)，降低糞便清蛋白含量，以半夏瀉心湯全方作用最顯著。

綜上所述，抗生素暴露導(dǎo)致幼鼠腸道菌群紊亂，進(jìn)而破壞腸黏膜屏障，半夏瀉心湯全方及其不同拆方可調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，保護(hù)受損腸黏膜屏障。但辛開組、苦降組、甘補(bǔ)組及全方組在調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)及不同菌屬豐度方面作用并不完全一致，在調(diào)節(jié)腸受損黏膜屏障、結(jié)腸組織ZO-1表達(dá)方面，以半夏瀉心湯全方最為顯著，而辛開、苦降、甘補(bǔ)3種配伍具有協(xié)同增效作用。本研究可為臨床合理應(yīng)用抗生素及半夏瀉心湯防治腸上皮屏障損傷相關(guān)胃腸道疾病提供科學(xué)依據(jù)。