炒制溫度及時(shí)間對黃芩主要成分含量的分析

湯泮泮 葉興蓉 夏偉軍 段媛昌 丁 茜 馮莉萍 梅雙喜 楊增明 崔 濤 王京昆 董 汛 云南省藥物研究所 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 651000

黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱燥濕、解毒止血、安胎等功效，臨床用有黃芩和炮制品，一般炒緩其寒性，現(xiàn)代研究表明黃芩中的主要活性成分為黃酮類化合物，其主要有抗菌[1-2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5-6]等藥理作用。其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素4種成分含量較高，其量的高低是評價(jià)黃芩及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)[7-9]。研究采用HPLC建立了同時(shí)測定黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素4種主要有效成分的方法，在此方法下，探討不同加熱溫度及時(shí)間對4個(gè)指標(biāo)性成分的變化情況，闡述其變化規(guī)律，以期為炒黃芩的炒制加工研究及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技)；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒)；ME204/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；SK-8200HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芩苷(批號：110715-201821，含量以95.4%計(jì))、漢黃芩苷(批號：112002-201702，含量以98.5%計(jì))、黃芩素(批號：111595-201808，含量以97.9%計(jì))、漢黃芩素(批號：111514-201706，標(biāo)定后含量以94.4%計(jì))等均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，純凈水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.3 材料 黃芩藥材(購于河北省寬城縣)，經(jīng)云南省藥物研究所付德歡主任藥師鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，批號：190201。除去雜質(zhì)，洗凈，蒸30 min，取出，切薄片，即可。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以InterSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，流動相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，22%～25%A；10～15 min，25%A；15～25 min，25%～32%A；25～30 min，32%～40%A；30～35 min，40%A；35～40 min，40%～50%A。流速1.0 mL/min;檢測波長：276 nm;柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，用體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇配制成濃度分別為0.3049、0.08258、0.05142、0.0203 mg/mL的混合對照品溶液A，備用。

分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，用體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇配制成濃度分別為0.6296、0.4129、0.1119、0.01665 mg/mL的混合對照品溶液B，備用。

分別精密稱取黃芩苷，漢黃芩苷，黃芩素，漢黃芩素對照品適量，用體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇配制成濃度分別為0.3635、0.07176、0.01207、0.0393 mg/mL的混合對照品溶液C，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取炒黃芩粉末(過四號篩)0.1g，精密稱取，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，超聲處理(400 W，53 kHz)15 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，取續(xù)濾液，即可。

2.2.3 空白溶液 以體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為空白溶液，進(jìn)樣，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性 實(shí)驗(yàn)取2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液、混合對照品溶液A以及空白溶液各10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，色譜圖如圖1所示。由圖1可知，4種成分色譜峰分離度良好，空白溶液無干擾。

1.黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素 A.對照品；B.藥材；C.炒黃芩；D.空白圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.2.1的混合對照品溶液B各5、2、1、0.4、0.2、0.1 mL置于10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，取續(xù)濾液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖，以各成分進(jìn)樣質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，其對應(yīng)色譜峰的以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果見表1。

表1 4種成分線性關(guān)系

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取炒黃芩粉末(同一批號190201)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD值分別為0.31%、0.46%、0.32%、0.24%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取炒黃芩粉末(同一批號190201)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD值分別為0.27%、0.32%、0.44%、0.49%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取炒黃芩粉末6份(同一批號190201)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量分別為15.38%、2.84%、0.47%、0.14%，RSD值分別為0.22%、0.43%、1.20%、1.41%(n=6)，表明重復(fù)性較好。

2.8 回收率 實(shí)驗(yàn)稱取已知指標(biāo)成分含量的炒黃芩粉末約0.05 g(同一批號190201)，9份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別量取2.2.1項(xiàng)下制備的對照品溶液C 10 mL、20 mL、30 mL，置于錐形瓶中，平行做3份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定4個(gè)成分的含量，計(jì)算4種成分回收率。結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 黃芩炒制過程中指標(biāo)性成分的變化規(guī)律

為了避免結(jié)果因炒制過程中受熱不均而受到影響，故通過電熱鼓風(fēng)干燥箱加熱的方式來模擬炒制時(shí)加熱過程，探討不同加熱時(shí)間及溫度時(shí)4個(gè)指標(biāo)性成分的變化情況。

3.1 受熱溫度對指標(biāo)性成分的影響 分別精密量取黃芩混標(biāo)溶液A各2 mL，置于5 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至干，再分別取黃芩粉末5 g(同一批號190201)，平鋪于培養(yǎng)皿中，分別在80、100、120、140、160、180 ℃的烘箱中加熱30 min，取出，放冷，對照品精密量取70%甲醇2 mL使溶解，樣品按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，上述樣品按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量。結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 不同溫度對4個(gè)指標(biāo)性成分含量變化趨勢圖

1.黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素A.80 ℃；B.100 ℃；C.120 ℃；D.140 ℃；E.160 ℃；F.180 ℃圖3 不同溫度對4個(gè)指標(biāo)性成分影響HPLC色譜圖

由圖2、圖3可知，加熱時(shí)間為30 min時(shí)，隨著加熱溫度升高，黃芩中黃芩苷含量有略微升高，在140 ℃后明顯降低，至180 ℃后，黃芩苷含量由14.35%降低至12.34%；漢黃芩苷含量變化趨勢同黃芩苷，在140 ℃后明顯降低，至180 ℃時(shí)，漢黃芩苷含量由2.68%降低至2.01%；黃芩素含量變化呈上升趨勢，黃芩素含量由0.39%增加至1.61%；漢黃芩素含量變化趨勢同黃芩素，漢黃芩素含量由0.12%增加至0.60%；對照品在加熱至160 ℃～180 ℃時(shí)，出現(xiàn)了焦點(diǎn)，炭化現(xiàn)象，黃芩苷和漢黃芩苷未檢出，黃芩素和漢黃芩素含量也隨之減少，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10]。

3.2 受熱時(shí)間對指標(biāo)性成分的影響 分別精密量取黃芩混標(biāo)溶液A各2 mL，置于5 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至干，再分別取黃芩粉末5 g(同一批號190201)，平鋪于培養(yǎng)皿中，分別在120 ℃和150 ℃的烘箱中加熱15、30、60、90、120 min，取出，放冷，對照品精密量取70%甲醇2 mL使溶解，樣品按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，上述樣品按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量。結(jié)果如圖4和圖6、圖5和圖7所示。

由圖4可知，加熱溫度為120 ℃，隨著加熱時(shí)間，對照品中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素?zé)o明顯變化，但是黃芩樣品中黃芩苷含量由14.46%降至14.43%，漢黃芩苷由2.56%升至2.64%，含量變化趨勢甚微，黃芩素含量由0.39%增至0.65%，漢黃芩素含量由0.12%增加至0.23%。

由圖 5可知，加熱溫度為150 ℃，對照品中黃芩苷和漢黃芩苷隨著時(shí)間延長，逐漸到未檢出其含量，而黃芩素含量由0.11 mg升至0.35 mg，漢黃芩素含量由0.04 mg升至0.13 mg，但是在90 min后兩者含量有所下降；黃芩樣品中黃芩苷含量由13.12%降低至10.80%，漢黃芩苷含量由2.29%降至1.59%；但是黃芩素含量由0.39%增至2.21%，漢黃芩素含量由0.12%增加至0.82%。

圖4 120 ℃不同受熱時(shí)間對4個(gè)指標(biāo)性成分含量變化趨勢圖

圖5 150 ℃不同加熱時(shí)間對4個(gè)指標(biāo)性成分含量變化趨勢圖

1.黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素 A.0 min；B.15 min；C.30 min；D.60 min；E.90 min；F.120 min圖6 不同加熱時(shí)間4個(gè)指標(biāo)性成分HPLC色譜圖(120 ℃)

1.黃芩苷；2.漢黃芩苷；3.黃芩素；4.漢黃芩素 A.0 min；B.15 min；C.30 min；D.60 min；E.90 min；F.120 min圖7 不同加熱時(shí)間4個(gè)指標(biāo)性成分HPLC色譜圖(150 ℃)

4 討論

4.1 不同受熱溫度對黃芩中4個(gè)成分含量的影響 當(dāng)加熱溫度為120 ℃時(shí)，單體成分和黃芩成分中的黃酮類成分含量變化不明顯，說明不發(fā)生苷鍵斷裂反應(yīng)。當(dāng)120～150 ℃時(shí)，黃芩苷、漢黃芩苷黃酮類成分之間的苷鍵斷裂反應(yīng)開始，并且隨著溫度的升高，逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化為黃芩素和漢黃芩素。當(dāng)溫度180 ℃時(shí)，可能黃芩中4個(gè)成分自身不穩(wěn)定性，因此成分含量都有所下降。

4.2 不同受熱時(shí)間對黃芩中4個(gè)成分含量的影響 在溫度為120 ℃時(shí)，隨著時(shí)間延長至120 min，單體成分和黃芩成分中4個(gè)成分含量變化不明顯，說明在此溫度下，4個(gè)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定；但是在溫度為150 ℃時(shí)，隨著時(shí)間延長至30 min，單體成分和黃芩成分中4個(gè)成分含量變化不明顯，但是30 min以后，黃芩苷、漢黃芩苷黃酮類成分之間的苷鍵斷裂反應(yīng)開始，黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷成分含量總體呈下降趨勢，黃芩素和漢黃芩素成分含量總體呈上升趨勢。

從黃芩苷和漢黃芩苷結(jié)構(gòu)分析(如圖8所示)，兩者都由黃芩苷類和葡萄糖醛酸組成，在受熱過程中，葡萄糖醛酸從黃芩苷和漢黃芩苷上脫落，逐漸形成黃芩素和漢黃芩素。據(jù)文獻(xiàn)[11]研究及推測黃芩苷和漢黃芩苷在受熱時(shí)降解反應(yīng)不僅發(fā)生在糖苷鍵上，還有可能先發(fā)生異構(gòu)化的降解途徑，再發(fā)生糖苷鍵水解脫去糖醛酸生成黃芩素，其后黃芩素又發(fā)生聚合反應(yīng)生成黃芩素二聚體。

圖8 4個(gè)成分之間的化學(xué)反應(yīng)示意圖

綜上所述，單體成分加熱過程中，4個(gè)指標(biāo)成分含量變化是顯而易見的，主要受苷鍵裂解和自身破壞因素的影響。黃芩在炒制過程中，化學(xué)成分的變化是復(fù)雜的，除了苷鍵裂解外，還有可能存在其他復(fù)雜反應(yīng)，炒制時(shí)間、炒制溫度、藥材自身穩(wěn)定性等因素都有可能導(dǎo)致各化學(xué)成分最終含量的高低。既要保證對黃芩的殺酶保苷效果，又要確保其功效，因此應(yīng)根據(jù)臨床應(yīng)用選擇適合的炒制方法。