miR-146b在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系*

陶嘉楠,王學(xué)紅,馬臻棋,張宏琳

1.青海大學(xué)研究生院,青海西寧 810016;2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,青海西寧 810000

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,早期癥狀隱匿,明確診斷時(shí)常常處于癌癥進(jìn)展期,導(dǎo)致預(yù)后不佳。目前胃癌在全球常見癌癥中排名第五,是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。我國是全球胃癌高發(fā)區(qū),據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),2018年全球胃癌的發(fā)病例數(shù)已超103萬,我國約占44%,總死亡人數(shù)超過78萬,其中約一半為中國人[2]。胃癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,其發(fā)生機(jī)制尚不明確。近年來許多研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miRNA)在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[3],多種miRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平有明顯差別,其表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)常常與胃癌的臨床病理特征有關(guān)[4-6]。miR-146b在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著雙重作用,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miR-146b在惡性膠質(zhì)瘤[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、胰腺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用,而在甲狀腺癌[12]中卻發(fā)揮著促癌基因的作用。本研究檢測胃癌患者miR-146b在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平,探討其在胃癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年11月至2021年9月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院行胃鏡檢查并經(jīng)病理檢查證實(shí)為胃癌的40例患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)胃鏡和病理活檢首次確診為胃癌；(2)術(shù)前未經(jīng)放化療、分子靶向治療、中醫(yī)藥抗癌治療等；(3)自愿參與該項(xiàng)研究,并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他臟器原發(fā)惡性腫瘤者；(2)肝、腎功能衰竭者；(3)近1個(gè)月使用抑酸藥、抗菌藥物者。在行胃鏡檢查時(shí),用胃鏡活檢鉗鉗取癌組織及癌旁組織各1塊,其中癌旁組織取自距離癌組織邊緣大于5 cm的胃組織,立即放入凍存管內(nèi)，并于-80 ℃冰箱保存。設(shè)計(jì)表格,記錄患者年齡、性別、內(nèi)鏡下腫瘤最大徑、腫瘤部位、腫瘤分化程度、臨床分期等一般資料。40例患者中男33例,女7例；年齡33～74歲,中位年齡59歲；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期14例,Ⅲ～Ⅳ期26例,分期標(biāo)準(zhǔn)參照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會(huì)(UICC/AJCC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第8版)。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及監(jiān)督。

1.2儀器與試劑 研磨儀(低溫型)、離心管、TIP頭均購自Servicebio公司；臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)購自DragonLab公司；熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；超凈工作臺(tái)購自蘇凈安泰公司；超微量分光光度計(jì)購自Thermo公司；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀購自青島富勒姆科技有限公司；RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Servicebio公司；miRNA通用引物和特異性引物由青海賽斯克生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1總RNA抽提 (1)取勻漿管,加入1 mL的RNA 提取液,置冰上預(yù)冷；(2)取100 mg組織,加入勻漿管中；(3)于勻漿儀充分研磨直至無可見組織塊；(4)12 000 r/min離心10 min，取上清液；(5)加入250 μL三氯甲烷,顛倒離心管15 s,充分混勻,靜置3 min；(6)4 ℃ 下12 000 r/min離心10 min；(7)將400 μL上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,加入0.8倍體積的異丙醇,顛倒混勻；(8)-20 ℃ 放置15 min；(9)4 ℃下12 000 r/min離心10 min,管底的白色沉淀即為RNA；(10)吸除液體,加入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀；(11)4 ℃下12 000 r/min離心5 min；(12)將液體吸除干凈,將離心管置于超凈臺(tái)上吹3 min；(13)加入15 μL無RNA酶的水溶解RNA；(14)55 ℃ 孵育5 min；(15)使用Nanodrop 2000檢測RNA質(zhì)量濃度及純度：儀器空白調(diào)零后取2.5 μL待測RNA檢測吸光度值；(16)將RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋,使其最終質(zhì)量濃度為100～500 ng/μL。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 從細(xì)胞中提取總RNA,用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 s。接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min,變性 95 ℃ 15 s,退火 60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。miR-146b正向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCAT-3′,反向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCCTAT-3′；內(nèi)參基因U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用相對(duì)定量法(ΔΔCt法)計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量,表達(dá)倍數(shù)=2-ΔΔCt。在實(shí)驗(yàn)過程中,為了減少誤差,將每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測3次后取平均Ct值作為最終值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究計(jì)量數(shù)據(jù)并不滿足正態(tài)分布,故采用M(P25,P75)表示。假設(shè)檢驗(yàn)時(shí),配對(duì)樣本比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn),兩獨(dú)立樣本比較采用Mann-WhiteyU檢驗(yàn),多組間比較采用Kruskall-WallisH檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織和配對(duì)癌旁組織中miR-146b相對(duì)表達(dá)水平比較 對(duì)40例胃癌組織和配對(duì)癌旁組織中miR-146b的表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量PCR檢測,結(jié)果顯示miR-146b在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平為0.690(0.463,1.135),低于配對(duì)癌旁組織中的1.115(0.683,1.593),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.635,P=0.008)。

2.2胃癌組織中miR-146b的表達(dá)水平和臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、腫瘤分化程度、臨床分期和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者胃癌組織miR-146b相對(duì)表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而不同性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑和是否有血行轉(zhuǎn)移胃癌患者胃癌組織miR-146b相對(duì)表達(dá)水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織中miR-146b的表達(dá)水平和臨床病理特征的關(guān)系[M(P25,P75)]

續(xù)表1 胃癌組織中miR-146b的表達(dá)水平和臨床病理特征的關(guān)系[M(P25,P75)]

3 討 論

miR-146b是miR-146家族的成員之一,該家族包括miR-146a和miR-146b 2個(gè)成員,二者的結(jié)構(gòu)很接近,區(qū)別僅僅在于3′-末端2個(gè)核苷酸序列不同,因此它們的作用相似[13],均發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄后基因沉默子的作用,參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和細(xì)胞周期調(diào)控。miR-146b由miR-146b基因編碼,該基因定位于人類第10號(hào)染色體[14],miR-146b前體約由73個(gè)核苷酸組成,并包含一個(gè)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu),分別從其5′端臂和3′端臂加工為成熟的miR-146b-5p和miR-146b-3p[15]。miR-146b的作用機(jī)制十分復(fù)雜,目前仍不甚清楚,研究較為成熟的機(jī)制是miR-146b-表皮生長因子受體(EGFR)途徑,該途徑是在研究miR-146b與惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)。KATAKOWSKI等[16]研究發(fā)現(xiàn),惡性膠質(zhì)瘤患者10號(hào)染色體10q24-26區(qū)域經(jīng)常缺失,而miR-146b基因恰好在這個(gè)區(qū)域內(nèi),所以導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞中miR-146b的表達(dá)水平明顯下降,并且還發(fā)現(xiàn)miR-146b與人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞EGFR的mRNA 3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合,從而抑制了EGFR的表達(dá),使得腫瘤增殖能力和侵襲性減弱。

張效通[17]研究發(fā)現(xiàn),miR-146b在膀胱癌組織中低表達(dá),并通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b可以與含半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白3(CARMA3)mRNA的3′-UTR結(jié)合,抑制下游蛋白的表達(dá),從而抑制膀胱癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,提示miR-146b在膀胱癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。申翠蘋[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-146b可抑制宮頸癌細(xì)胞系Caski的增殖、侵襲和黏附能力,使細(xì)胞周期阻滯。閆美娜[19]研究發(fā)現(xiàn),miR-146b可以明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力,但是同時(shí)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖,增加了其對(duì)化療的敏感性。MITSUMURA等[20]發(fā)現(xiàn),下調(diào)或消融小鼠體內(nèi)miR-146b可引起小鼠造血系統(tǒng)惡性腫瘤,可能機(jī)制是miR-146b通過抑制激活核因子-κB的表達(dá),從而導(dǎo)致炎癥和腫瘤的發(fā)生。鄭建[21]研究顯示,miR-146b在早期和中晚期甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中均呈明顯高表達(dá),同時(shí)隨著腫瘤分期的增加,其表達(dá)水平有升高的趨勢,提示其在PTC中發(fā)揮著促癌基因的作用。因此,miR-146b不是單純發(fā)揮著促癌或抑癌作用,在不同的惡性腫瘤中其作用不同，甚至完全相反。在大多數(shù)惡性腫瘤中miR-146b發(fā)揮抑癌基因的作用,在少數(shù)惡性腫瘤(如甲狀腺乳頭狀癌等)中發(fā)揮促癌基因的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-146b在胃癌組織中表達(dá)下調(diào),推測其發(fā)揮抑癌基因的作用。

miR-146b作用的下游重要靶點(diǎn)之一是EGFR。LIU等[22]研究了miR-146b是否能致敏對(duì)EGFR的靶向藥物即酪氨酸激酶抑制劑(TKI)耐藥的肺癌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146b異位表達(dá)增強(qiáng)的肺癌細(xì)胞發(fā)生了TKI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,推測miR-146b可能是克服TKI耐藥的有用工具,這也從側(cè)面反映了miR-146b在肺癌中亦通過作用于EGFR發(fā)揮抑癌作用。CHOU等[23]研究發(fā)現(xiàn),miR-146b的異常表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的侵襲性和預(yù)后相關(guān),推測miR-146b的關(guān)鍵作用是作為一種致癌監(jiān)管分子,監(jiān)測細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤復(fù)發(fā)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同年齡、腫瘤分化程度、臨床分期和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織miR-146b的表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-146b通過復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控下游的分子,其參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制十分復(fù)雜,需要進(jìn)行大量的生物信息學(xué)分析及基礎(chǔ)研究才有可能逐步解析其作用機(jī)制。本研究的局限性在于研究對(duì)象均為青藏高原世居者,受海拔和高原低氧的影響,研究結(jié)果的代表性可能不強(qiáng),無法排除低氧對(duì)miR-146b表達(dá)的影響,仍需多地區(qū)、多中心、大樣本量的研究,以消除地域因素的影響,使得試驗(yàn)結(jié)果更具代表性,以便為胃癌的診斷與治療提供新的方法。