腎移植術(shù)后巨細(xì)胞病毒感染的檢測方法及研究進(jìn)展*

白敏鳳 綜述，尹利民 審校

1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650000；2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650000

巨細(xì)胞病毒(CMV)感染是影響腎移植效果的最常見的機(jī)會(huì)性感染之一。盡管目前有多種方法來檢測是否感染CMV，但由于近年來移植后CMV感染的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，因此快速檢測CMV從而采取有效的預(yù)防和治療措施十分關(guān)鍵。本文就腎移植術(shù)后CMV的檢測方法進(jìn)行綜述。

1 腎移植術(shù)后CMV感染及診斷

CMV感染是腎移植術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一[1]。CMV屬皰疹病毒β亞科，成熟的病毒顆粒直徑為150～200 nm，為具有包膜的雙鏈線性DNA病毒，基因組全長為225～240 kb，其翻譯后的產(chǎn)物超過200種蛋白質(zhì)[2]。這種病原體的感染在全世界范圍內(nèi)具有很高的流行率。盡管在有免疫能力的宿主中感染通常是無害的，但卻是器官移植接受者發(fā)病和死亡的主要原因。在不同的腎移植接受者中，有40%～100%的患者發(fā)生主動(dòng)感染[3]。CMV與腎移植后肺炎、肝炎、視網(wǎng)膜炎及腎移植后急、慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生有密切的聯(lián)系[4]。

CMV感染會(huì)對外周T細(xì)胞數(shù)量和表型有明顯影響，與移植腎的功能相關(guān)[5]。腎移植后CMV感染可導(dǎo)致直接損害和間接損害，直接損害包括CMV綜合征，具體表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、肌痛、關(guān)節(jié)痛、厭食等，以及入侵組織產(chǎn)生肺炎、肝炎、腦炎、視網(wǎng)膜炎、腎炎等；間接損害包括細(xì)菌和(或)真菌的感染、移植腎的功能和總體存活，比如間質(zhì)性腎炎、腎動(dòng)脈狹窄或血栓性微血管病變及腎移植后急性排斥反應(yīng)、慢性排斥反應(yīng)等[6]。

CMV 復(fù)制存在于組織、血液或其他體液中，與癥狀無關(guān)，可通過核酸檢測(NAT)、抗原檢測和病毒培養(yǎng)法來檢測 CMV 的復(fù)制。根據(jù)所使用的方法，血液中的 CMV 復(fù)制可以稱為 CMV DNAemia或 RNAemia、CMV 抗原血癥(抗原檢測法)和 CMV 病毒血癥(培養(yǎng)法)[7]。CMV 感染的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，CMV與免疫系統(tǒng)存在多種相互作用，這由多種機(jī)制介導(dǎo)，包括病毒對人白細(xì)胞抗原表達(dá)、細(xì)胞因子產(chǎn)生和黏附分子的影響。這些相互作用可以解釋 CMV 感染繼發(fā)細(xì)菌和真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)增加，以及 CMV 感染與急性和(或)慢性移植物抗宿主病(GVHD)的關(guān)聯(lián)[2]。器官移植術(shù)后檢測 CMV 的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子測定、抗原血癥檢測、組織病理學(xué)、病毒培養(yǎng)和血清學(xué)檢測等[8]。目前，臨床上常規(guī)的CMV檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或間接免疫熒光試驗(yàn)(IF)通過檢測血清中的 IgG、IgM 抗體，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測移植術(shù)后CMV的感染。目前，臨床對于腎移植后CMV感染最主要的預(yù)防包括“先發(fā)制人”的策略和預(yù)防策略兩種方式。但是，對活動(dòng)性感染或疾病的有效治療，以及采取“先發(fā)制人”的策略都需要準(zhǔn)確、早期的診斷，因此需要快速且準(zhǔn)確的CMV感染診斷方法[3]。

2 腎移植術(shù)后CMV的檢測方法

2.1病毒培養(yǎng)法 對于實(shí)體器官移植(SOT)接受者，病毒培養(yǎng)法對CMV 感染的診斷具有高度特異性[8]。此方法通過采集器官移植接受者的外周血白細(xì)胞、血漿、支氣管灌洗液、組織、腦脊液和尿液，將標(biāo)本接種于人成纖維細(xì)胞后，通過觀察細(xì)胞的病理變化來判斷是否存在CMV感染。最初病毒培養(yǎng)法采用傳統(tǒng)組織試管培養(yǎng)(噬斑測定)，由于試管培養(yǎng)費(fèi)力，并且可能需要數(shù)周才能進(jìn)行病毒分離和檢測，因此，其在臨床實(shí)踐中的實(shí)用性有限[9]；隨后，使用殼瓶離心培養(yǎng)技術(shù)對其進(jìn)行了改進(jìn)，縮短了周轉(zhuǎn)時(shí)間(48 h)。盡管病毒培養(yǎng)法對 CMV 感染的診斷具有高度特異性，但與較敏感和快速的分子檢測法相比，病毒培養(yǎng)法由于靈敏度低和周轉(zhuǎn)時(shí)間長而使用較少[8,10]。對于尿液或口腔分泌物，由于對CMV的特異性較差(相對于病毒脫落)，病毒培養(yǎng)法不適用[1]。尤其對于腎移植術(shù)后CMV感染患者，由于病毒培養(yǎng)時(shí)間長，不能對早期CMV感染及時(shí)診斷，而且培養(yǎng)過程可能出現(xiàn)污染，造成假陰性，這可能導(dǎo)致診治不及時(shí)而影響腎移植效果。

2.2組織病理學(xué)檢查 組織病理學(xué)檢查仍然是診斷組織浸潤性 CMV 疾病的金標(biāo)準(zhǔn)[9,11]。細(xì)胞和細(xì)胞核的增大及嗜堿性細(xì)胞質(zhì)包裹體(又稱為巨細(xì)胞)的存在表明CMV的存在[11]，或者通過免疫組織化學(xué)染色、原位雜交檢測到細(xì)胞內(nèi)病毒。但由于該方法需要進(jìn)行侵入性操作才能獲得用于 CMV 診斷的組織標(biāo)本，因此，通過組織病理學(xué)檢查診斷組織浸潤性 CMV 疾病逐漸減少[8]。如果同種異體排斥反應(yīng)是診斷考慮因素，建議進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。在臨床上，很難將CMV感染與同種異體排斥反應(yīng)區(qū)分開，有時(shí)兩種情況并存，因此可能需要病理活檢來診斷[11]。組織病理學(xué)檢查對于區(qū)分繼發(fā)于 CMV 和同種異體移植排斥的腎臟改變很有效[12]。當(dāng)懷疑CMV感染但血液中CMV核酸檢測呈陰性時(shí)，需要進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，如在某些胃腸道CMV感染病例中[8,13]。重復(fù)組織病理學(xué)檢查證明，從受累器官(如胃腸道)清除CMV感染在大多數(shù)情況下是不必要的，除非在最初診斷時(shí)有嚴(yán)重的組織受累[8,14]。因此，由于是侵入性操作，腎移植后患者通常情況下不必做組織病理學(xué)檢查，但當(dāng)無法區(qū)分CMV感染和同種異體移植排斥的腎臟改變，或者有嚴(yán)重組織受累時(shí)，此檢查具有一定意義。

2.3血清學(xué)檢測 血清學(xué)檢測CMV IgM和IgG是證明在有免疫能力的宿主中感染CMV的最常見檢測方法。常用的血清學(xué)方法有ELISA、IF、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、放射免疫試驗(yàn)(RIA)、免疫印跡(WB)等。CMV 在感染過程中(急性或近期感染)早期誘導(dǎo)IgM抗體的產(chǎn)生，隨后則是 IgG抗體(既往或潛在的感染)。但I(xiàn)gM抗體通常在感染后10～15 d才可檢出，不利于早期診斷，而且由于CMV在人群中隱性感染率很高，約半數(shù)以上的健康成人血清CMV IgG抗體陽性，因此，CMV抗體IgM和IgG的檢測對于器官移植后CMV感染的診斷均無臨床價(jià)值[15]。但當(dāng)CMV IgG的滴度升高4倍以上時(shí)，提示CMV活動(dòng)性感染[16]。器官移植后可使用 CMV 血清學(xué)測定 CMV 血清陰性 SOT 接受者的持續(xù)敏感性，盡管其預(yù)測能力僅為中等[17]。在解釋 SOT 后的 CMV 血清學(xué)結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮到移植期間或移植后接受血液制品(包括靜脈注射用免疫球蛋白)的患者，由于被動(dòng)轉(zhuǎn)移抗體可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果[8]。移植中CMV血清學(xué)檢測可用于供體和候選移植物的移植前篩選。供體和受體的 CMV血清學(xué)檢測有助于將器官移植后的 CMV 疾病風(fēng)險(xiǎn)分為高風(fēng)險(xiǎn)(CMV D+/R-)、中風(fēng)險(xiǎn)(CMV D+/R+，CMV D-/R+)和低風(fēng)險(xiǎn)(CMV D-/R-)[11]。因此，CMV IgM抗體和IgG抗體檢測可以對供體和受體是否感染過CMV進(jìn)行初篩，而由于IgM出現(xiàn)延遲或IgG的普遍性，容易造成假陰性結(jié)果，這些因素都限制了血清抗體檢測在CMV感染診斷過程中的作用。

2.4抗原血癥檢測 機(jī)體感染 CMV后，可在外周血白細(xì)胞中檢測到 CMV抗原，稱為CMV抗原血癥。抗原血癥測定法是一種快速定量方法，可通過使用針對 CMV 基質(zhì)蛋白 pp65(UL83)的單克隆抗體直接對血液標(biāo)本中的多形核白細(xì)胞(PMN)進(jìn)行免疫染色來檢測 CMV 抗原[9]。有研究表明，pp65 抗原血癥在指導(dǎo)先發(fā)治療、快速敏感地診斷 CMV 疾病及指導(dǎo)治療反應(yīng)方面與CMV NAT法相當(dāng)[8，18]。在病毒復(fù)制過程中，會(huì)產(chǎn)生3種類型的抗原，即刻早期抗原(IEA)，早期抗原(EA)和晚期抗原(LA)[19]。IEA在感染后 1～3 h出現(xiàn)在被感染細(xì)胞的細(xì)胞核中，并在潛伏感染期間持續(xù)存在。EA在感染后 3 h甚至在 DNA 合成開始之前就出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中。 LA是結(jié)構(gòu)蛋白，僅在 DNA 合成后出現(xiàn)，因此與主動(dòng)感染相關(guān)。pp65抗原是早期抗原之一[19]。CMV pp65抗原(6.5 kb)是病毒的被膜蛋白，由位于CMV衣殼和包膜之間的磷酸化蛋白構(gòu)成，占病毒蛋白的15%，在CMV DNA復(fù)制前就有合成，在出現(xiàn)臨床癥狀前2～10 d內(nèi)可明顯增高，CMV pp65抗原陽性提示體內(nèi)活動(dòng)性CMV復(fù)制完成，是CMV活動(dòng)性感染的早期標(biāo)志性產(chǎn)物[20]。早在1988年VAN DER 等[21]建立了采用葡聚糖沉淀分離白細(xì)胞、固定、間接免疫過氧化物酶染色的直接檢測腎移植接受者外周血白細(xì)胞中 CMV 抗原的方法，并于之后進(jìn)行了一系列改進(jìn)。有研究提出使用流式細(xì)胞術(shù)檢測CMV pp65抗原[22]。隨后，ESSA等[23]通過對CMV流式細(xì)胞儀檢測與抗原血癥檢測比較發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀檢測具有與抗原血癥檢測大致相同的靈敏度。與熒光標(biāo)記法相比，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確，操作更加簡單易行，還可以減少因人為操作原因造成的熒光，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性[20]?？乖Y檢測的缺點(diǎn)在于需要在8 h內(nèi)送檢標(biāo)本，否則會(huì)影響檢出率，而且對外周血白細(xì)胞數(shù)量有一定要求，白細(xì)胞數(shù)量不足也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但由于pp65抗原在DNA合成之前就出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，與NAT法相比，更能早期診斷腎移植后CMV活動(dòng)性感染，而且也有很高的靈敏度和特異度。目前，越來越多的實(shí)驗(yàn)室通過CMV抗原血癥檢測來指導(dǎo)腎移植術(shù)后抗病毒治療的時(shí)機(jī)及監(jiān)測抗病毒藥物的療效，pp65抗原血癥檢測對于腎移植后的CMV感染有較大的臨床意義。

2.5細(xì)胞免疫測定 CMV感染可以導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能受到抑制，而T淋巴細(xì)胞是反映人體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[20]。免疫監(jiān)測通過測定非特異性和 CMV 特異性 T 細(xì)胞的數(shù)量和功能，可幫助SOT 后 CMV 風(fēng)險(xiǎn)分層和管理[8，24]。 非特異性指標(biāo)，如絕對淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和非特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)與SOT后CMV疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[8，25]。器官移植后，CMV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的復(fù)蘇被認(rèn)為是保護(hù)CMV復(fù)發(fā)的重要因素[20]。評估 CMV 特異性 T 細(xì)胞反應(yīng)，包括干擾素-γ 釋放測定(IGRA)[26]、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定法(ELISPOT)[27]，以及使用流式細(xì)胞術(shù)對干擾素-γ(或其他細(xì)胞因子)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)等方法[8]。有研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞免疫測定在CMV風(fēng)險(xiǎn)評估中的潛在作用[8]。總之，無論采用何種檢測方法，缺乏足夠的CMV特異性CD4+和(或)CD8+T細(xì)胞免疫與CMV疾病、治療失敗和CMV復(fù)發(fā)的較高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。因此，可以通過對腎移植后的患者細(xì)胞免疫進(jìn)行監(jiān)測，幫助腎移植后CMV風(fēng)險(xiǎn)分層和管理，但對于早期檢測CMV感染的診斷有一定限制。

2.6定量核酸檢測技術(shù)(QNAT) QNAT是對血清和白細(xì)胞中的CMV DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，并通過定量分析CMV DNA的表達(dá)情況判斷CMV感染的狀況[20]。由于其高靈敏度和高通量，用于血液中 CMV DNA 的定量 PCR已成為首選的診斷測試方法，廣泛用于臨床中CMV感染診斷，確定何時(shí)開始先發(fā)性抗病毒治療(PET)，以及監(jiān)測感染和(或)疾病進(jìn)程[1，28]。定量PCR法在非血液標(biāo)本中的應(yīng)用已取得了重要進(jìn)展，以診斷特定部位的 CMV疾病(如CMV感染所致胃腸道疾病和肺炎)[28]。病毒載量增加率是CMV疾病風(fēng)險(xiǎn)的重要標(biāo)志，CMV病毒載量上升越快，CMV疾病風(fēng)險(xiǎn)越高，CMV復(fù)制程度與臨床疾病的嚴(yán)重程度直接相關(guān)[8，11]。但是，CMV QNAT的主要缺點(diǎn)是缺乏適用于各種臨床適應(yīng)證的閾值。 雖然世界衛(wèi)生組織(WHO)校準(zhǔn)國際標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施已明顯改善了各種檢測方法中病毒載量的一致性程度，但跨 PCR 檢測平臺(tái)/檢測方法的可變性問題仍然存在[8，28]。最近的研究已經(jīng)確定了 CMV定量PCR 分析的擴(kuò)增子大小和 DNA 提取方法會(huì)影響變異性，標(biāo)品類型(如血漿與全血與外周血單核細(xì)胞)也極大地影響了變異性[28]。因此，建議移植中心與各自的臨床實(shí)驗(yàn)室合作，為各種臨床應(yīng)用定義和驗(yàn)證相關(guān)的中心特異性和試驗(yàn)特異性病毒載量閾值[8]。數(shù)字 PCR 等較新的方法學(xué)有望降低 CMV DNA 的可變性，但尚未廣泛使用[29]。盡管CMV NAT法是目前首選的腎移植后CMV感染診斷的方法，但對于早期診斷CMV活動(dòng)性感染，該方法不如CMV抗原血癥檢測。

3 腎移植術(shù)后CMV檢測的進(jìn)展

3.1核酸序列依賴擴(kuò)增法(NASBA) NASBA是一項(xiàng)以RNA模板進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增并能實(shí)時(shí)觀測結(jié)果的檢測方法，目前該方法已廣泛用于多種病原微生物的檢測。CMV可通過該方法檢測到CMV mRNA pp67 的存在。mRNA pp67 的存在表明病毒復(fù)制活躍，其是CMV感染的標(biāo)志[9]。但這種方法靈敏度較低且RNA容易變異，相比抗原血癥檢測及QNAT使用逐漸減少[9-10]。

3.2雜交捕獲技術(shù) 雜交捕獲技術(shù)利用RNA 探針與CMV目的DNA雜交，靶標(biāo)探針復(fù)合物(稱為 DNA-RNA雜合體)被雜合體特異的抗體捕獲，然后通過發(fā)光計(jì)測量所得信號(hào)(化學(xué)發(fā)光)。該測定法比細(xì)胞培養(yǎng)測定法更靈敏，并且具有與抗原血癥測定法相似的敏感性和特異性[10]。對于移植后CMV的診斷還需進(jìn)一步研究。

3.3測序 下一代測序技術(shù)(NGS)可以同時(shí)檢測和量化移植受者中的多種病毒，包括CMV，其結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)QNAT相當(dāng)[30]。外周血快速全基因組測序(rWGS)已用于檢測急性感染中的微生物DNA。rWGS 可能是一種檢測CMV感染的快速、靈敏的方法，能盡早檢測CMV，并及時(shí)指導(dǎo)開始抗病毒治療，有助于改善患者的預(yù)后[31]。但該方法的不足在于成本高，檢測通量低，過程復(fù)雜。

3.4基因芯片技術(shù) 標(biāo)本DNA通過PCR擴(kuò)增熒光標(biāo)記后，與固定在支持物上的寡核苷酸探針雜交，通過檢測熒光信號(hào)獲得相關(guān)位點(diǎn)的基因型信息。該方法靈敏度和準(zhǔn)確度高，簡便快速，對CMV的早期診斷率有較大提升，但存在成本昂貴、技術(shù)復(fù)雜等問題。

3.5成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)技術(shù) CRISPR是當(dāng)前極具潛力的研究領(lǐng)域之一，對于檢測移植后CMV感染有較大前景，該技術(shù)成本低、使用方便、速度快，可實(shí)現(xiàn)頻繁檢測和早期診斷[32]。

4 小結(jié)與展望

CMV與腎移植后肺炎、肝炎、視網(wǎng)膜炎及腎移植后急、慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生有密切的聯(lián)系，早期檢測CMV感染對于指導(dǎo)腎移植后CMV的更昔洛韋“先發(fā)制人”療法治療具有關(guān)鍵作用，對改善移植腎功能、提高腎移植接受者存活率有重要意義。病毒培養(yǎng)技術(shù)由于耗時(shí)長，應(yīng)用逐漸減少；血清學(xué)檢測抗體出現(xiàn)時(shí)間影響早期診斷；CMV抗原血癥檢測與QNAT具有很高的靈敏度和特異度，是目前較常用的檢測方法，對于指導(dǎo)治療腎移植后CMV感染有重要的臨床意義。新型檢測方法(如CRISPR)有較大的應(yīng)用前景，有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。