罕見A1Bw亞型伴不規(guī)則抗-B研究

潘家銘，許先國，吳泳倫，孫愛農(nóng)△

1.廣東省中山市中心血站檢驗科，廣東中山 528400；2.浙江省血液中心輸血醫(yī)學(xué)研究所，浙江杭州 310052

準(zhǔn)確鑒定獻(xiàn)血者血型對臨床血液正確發(fā)放和安全輸血至關(guān)重要[1]，輸血前應(yīng)正確鑒定供、受血者血型，而ABO亞型會使抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)異常、減弱或消失，導(dǎo)致血型正反定型不符，定型出現(xiàn)困難[2]。由于ABO亞型很多，不同的ABO亞型常呈現(xiàn)獨特的正反定型結(jié)果，筆者在血液檢驗工作中遇到1例A1Bw11亞型伴不規(guī)則抗-B標(biāo)本，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 獻(xiàn)血者，男，29歲，全自動血型儀(微孔板凝集法)ABO血型檢測結(jié)果正反定型不符。正定型：抗-A 4+、抗-B不凝集，A型；反定型：A、B細(xì)胞均不凝集，AB型。該獻(xiàn)血者自述曾在外地獻(xiàn)血，描述當(dāng)時當(dāng)?shù)夭晒┭獧C構(gòu)血液檢驗結(jié)果是A型，表明該標(biāo)本血型特殊，因此需進(jìn)一步研究。

1.2儀器與試劑 國產(chǎn)麥迪斯150-8型全自動血型儀購自深圳愛康生物科技有限公司；SHA-2型水浴恒溫振蕩器購自上海高致精密儀器有限公司；3種ABO-Rh血型定型檢測卡購自中山市生科試劑儀器有限公司(簡稱生科)、達(dá)亞美中國有限公司(簡稱達(dá)亞美)及西班牙Diagnostic Grifols S.A.公司戴安娜(DG)品牌(簡稱戴安娜)；抗人球蛋白微柱凝膠卡購自戴安娜；RhD(IgM)血型定型試劑購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；3種不同來源的單克隆抗-A、抗-B試劑分別購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司、長春博德生物技術(shù)有限公司、北京金豪制藥股份有限公司；ABO反定型、不規(guī)則抗體檢測試劑盒購自長春博德生物技術(shù)有限公司；單克隆抗-A1、-AB、-H均購自德國CE公司；Magcore自動核酸抽提儀、基因組DNA抽提試劑盒均購自中國臺灣 RBC Bioscience公司；9700型PCR擴增儀、3730 DNA測序儀和Big Dye?Terminator V3.1 測序試劑盒均購自美國ABI公司。所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.3方法

1.3.1血型血清學(xué)檢測 (1)ABO正反定型檢測：用鹽水試管法及3種ABO-Rh(CDE)檢測卡，于不同溫度下進(jìn)行ABO正反定型檢測,其中反定型加大1倍血漿量。(2)血漿不規(guī)則抗體篩查及鑒定：分別用鹽水試管法及間接抗人球微柱凝膠法進(jìn)行試驗。(3)紅細(xì)胞吸收及放散試驗：按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[3]操作，對比吸收前后血漿抗體效價變化，并把吸收后紅細(xì)胞在56 ℃進(jìn)行熱放散，放散液分別與標(biāo)準(zhǔn)A、B、O型紅細(xì)胞反應(yīng)。(4)血漿吸收及放散試驗：分別用1份A型及B型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞，與4倍該獻(xiàn)血者標(biāo)本血漿混合，4 ℃放置1 h，吸收后血漿與標(biāo)準(zhǔn)A、B、O型紅細(xì)胞反應(yīng)；同時將吸收后的A型和B型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞做放散試驗，取放散液與標(biāo)準(zhǔn)A、B、O型紅細(xì)胞反應(yīng)。(5)血漿不規(guī)則抗體滴度檢測：將獻(xiàn)血者標(biāo)本血漿倍比稀釋，與標(biāo)準(zhǔn)B型紅細(xì)胞 4 ℃反應(yīng)30 min，離心觀察結(jié)果。

1.3.2基因檢測 用Magcore自動核酸抽提儀進(jìn)行基因組DNA抽提，用PCR擴增儀擴增ABO基因第1～7外顯子序列，擴增產(chǎn)物直接測序，測序結(jié)果用SeqScape V2.5軟件進(jìn)行序列分析，依據(jù)堿基基本情況判定標(biāo)本基因型，步驟按試劑說明書和文獻(xiàn)[4]進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1ABO血型檢測結(jié)果 從正定型抗-B反應(yīng)結(jié)果來看，對于弱凝集的結(jié)果判斷，試管法比微柱凝膠卡反應(yīng)更敏感；試管法正定型抗-B在反應(yīng)溫度4 ℃及24 ℃時顯微鏡下可見微弱凝集，而37 ℃無凝集；反定型試管法用10份單份B細(xì)胞與該獻(xiàn)血者血漿反應(yīng)，24 ℃無凝集，但4 ℃放置30 min，離心觀察，肉眼均可見凝集(1+)。結(jié)果提示該獻(xiàn)血者可能紅細(xì)胞上有A1抗原、血漿內(nèi)有極弱抗-B。另外，ABO檢測卡于24 ℃反應(yīng)結(jié)果與全自動血型分析儀結(jié)果相同，但在4 ℃條件下用不同廠家檢測卡所做反定型結(jié)果有差異。見表1、2。

2.2血漿不規(guī)則抗體篩查鑒定結(jié)果 4 ℃及24 ℃鹽水試管法及37 ℃間接抗人球微柱凝膠法同時檢測，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號篩查細(xì)胞結(jié)果為陰性，可排除該獻(xiàn)血者血漿中ABO以外的不規(guī)則抗體存在。

表1 不同條件下鹽水試管法ABO正反定型結(jié)果

表2 3種ABO檢測卡正反定型結(jié)果

2.3紅細(xì)胞吸收及放散試驗 該獻(xiàn)血者標(biāo)本紅細(xì)胞對抗A吸收能力強、放散能力弱，對抗B吸收能力弱、放散能力強，疑似標(biāo)本紅細(xì)胞有正常A抗原和弱B抗原，顯示該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞具有ABO亞型的特征。見表3。

表3 紅細(xì)胞吸收及放散試驗結(jié)果

2.4血漿吸收及放散試驗 該獻(xiàn)血者血漿標(biāo)本中抗體僅可被B型細(xì)胞全部吸收干凈，證明其血漿中含不規(guī)則抗-B，但是吸收后的B型紅細(xì)胞放散試驗卻為陰性，可能由于血漿中抗-B效價太低的原因。

2.5血漿抗-B抗體效價 分別在鹽水試管法和抗人球蛋白介質(zhì)中檢測獻(xiàn)血者血漿抗-B效價，結(jié)果顯示鹽水試管法效價為1∶2，屬IgM，而抗人球蛋白中結(jié)果為陰性。

2.6基因檢測結(jié)果 DNA測序結(jié)果顯示，該獻(xiàn)血者標(biāo)本ABO基因與ABO*A1.01參考序列相比，外顯子區(qū)域存在c.297A/G、c.526C/G、c.657C/T、c.695T/C、c.703G/A、c.796C/A、c.803G/C、c.930G/A共8處變異，均為雜合變異。除c.695T/C外，其余位點符合ABO*A1.01/B.01雜合子特征。經(jīng)檢索c.695T>C為ABO*BW.11等位基因特征，該變異能導(dǎo)致232位亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?，故該獻(xiàn)血者ABO基因型為ABO*A1.01/BW.11，表明該獻(xiàn)血者為罕見A1Bw亞型伴不規(guī)則抗-B。

3 討 論

ABO血型亞型同屬ABO血型抗原，但抗原結(jié)構(gòu)和性能或抗原位點數(shù)有一定差異，主要是以正反定型不一致及抗原性弱為主要特征的多種亞型表型[5]。雖然ABO亞型在人群中的頻率不高，但由于臨床檢測人群數(shù)量較大，因此在臨床實際工作中常會遇到ABO亞型引起的血型定型或配血困難[6]。其中A亞型分為A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael等，依照A亞型的分類標(biāo)準(zhǔn)，B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel，將不符合這4類B亞型標(biāo)準(zhǔn)的其他弱表型統(tǒng)稱為Bw[7-8]。B亞型比A亞型少，Bw又是罕見的，它在人群中出現(xiàn)的概率非常低，甚至在血清學(xué)上難以被分類[8]。

本研究結(jié)果顯示，標(biāo)本紅細(xì)胞與抗-AB、-A1反應(yīng)呈強凝集，與抗-H為2+凝集，可以初步排除O型，提示紅細(xì)胞上含有A1抗原。所以在血型檢測時，當(dāng)發(fā)現(xiàn)正反定型不符時，可以增用抗-AB、抗-A1、抗-H參與檢測，這對血型的判斷有重要提示作用。結(jié)合紅細(xì)胞吸收及放散試驗，判斷該獻(xiàn)血者為A1B亞型，其血漿中存在低溫鹽水抗體，為不規(guī)則抗-B(IgM)，效價1∶2。本次血清學(xué)研究同時采用多種血清學(xué)方法進(jìn)行試驗，目的是利用不同方法間優(yōu)勢互補，提高準(zhǔn)確性，這在疑難血型的血清學(xué)鑒定中尤為重要；另外，發(fā)現(xiàn)不同廠家單克隆試劑對弱凝集反應(yīng)結(jié)果存在差異，這可能與不同克隆株單克隆抗血清對其檢出能力存在本質(zhì)差異有關(guān)[9]；血型血清學(xué)方法易受生理性、實驗操作、試劑、溫度、臨床疾病等多種因素影響，對于一些疑難血型標(biāo)本往往難以準(zhǔn)確定型[10]。結(jié)合基因檢測技術(shù)，確定該獻(xiàn)血者ABO血型表型為A1Bw，基因型為ABO*A1.01/BW.11。

該獻(xiàn)血者在既往獻(xiàn)血時ABO血型檢測結(jié)果有誤，可能誤以為其不規(guī)則抗-B與正定型“正”型相符。因此，筆者建議：(1)在正反定型不符或ABO抗體活性過低等可疑血型鑒定中，如果試驗結(jié)果無肉眼凝集，應(yīng)及時將細(xì)胞及血清至少在室溫和4 ℃孵育30 min，并用顯微鏡觀察，增加紅細(xì)胞吸收放散試驗，提高血型抗原檢測的敏感性；(2)提高自身業(yè)務(wù)水平，避免因技術(shù)性原因造成漏檢；(3)對凝集強度弱的標(biāo)本，可選擇不同廠家的試劑重復(fù)驗證；(4)對一些疑難問題必須及時請示上級主管醫(yī)生，進(jìn)一步檢查。

目前血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫中共記錄了40個Bw等位基因[11]，國內(nèi)曾報道有Bw11、03、07、14、33、39等，ABw等位基因曾報道有03、07、31、19、12等，而A1Bw11亞型較為罕見。A1Bw11血清學(xué)試驗與其他ABw亞型存在一定的差異，不同ABw亞型紅細(xì)胞與單克隆抗-B反應(yīng)凝集強度不一致，因此鏡檢十分重要。目前已有報道，大部分ABw亞型血漿中均存在抗-B抗體，可凝集B型紅細(xì)胞，但并不引起自身細(xì)胞凝集，其原因有待探究；而ABw11與Bw11血清學(xué)相似點在于紅細(xì)胞與單克隆抗-B反應(yīng)為±，血漿也存在不規(guī)則抗-B，所以對ABw亞型，如果紅細(xì)胞定型抗-B管弱凝集沒有被發(fā)現(xiàn)，同時反定型B細(xì)胞管4 ℃有凝集，ABO正反定型的假相符，容易誤判為A型。

該獻(xiàn)血者由于屬AB亞型，作為獻(xiàn)血者血液，其紅細(xì)胞可制備成洗滌紅細(xì)胞，供AB型受血者使用，但血漿因存在不規(guī)則抗-B使用應(yīng)謹(jǐn)慎，可作為A型血漿使用或直接報廢；假如作為患者，臨床輸血時使用洗滌O型紅細(xì)胞及AB型血漿。

根據(jù)馮晨晨等[12]報道，Bw11與A等位基因或O等位基因同時遺傳時競爭現(xiàn)象存在明顯差異，由于條件限制，未能對此獻(xiàn)血者家系中Bw11基因的遺傳展開調(diào)查。

影響血型鑒定的因素很多，包括抗原減弱、抗體減弱、ABO亞型、冷凝素干擾及ABO血型變異等[13]。血清學(xué)無法對血型準(zhǔn)確判讀時，基因檢測是準(zhǔn)確定型的最佳選擇[14]，但傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測仍然是血型鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，假如血清學(xué)鑒定首先發(fā)生錯誤，將可能導(dǎo)致ABO亞型漏檢，甚至引起輸血事故。所以日常工作中，準(zhǔn)確的血型血清學(xué)試驗分析是疑難血型鑒定的重要前提，同時將血清學(xué)檢測與基因檢測相結(jié)合，可提高血型鑒定的準(zhǔn)確性，為臨床輸血安全提供保障。