低溫貯藏對血橙不同部位果肉中類胡蘿卜素酯的影響

劉慧娟，謝 姣

（貴州醫(yī)科大學 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室 公共衛(wèi)生與健康學院 貴陽 550025）

血橙（Citrus sinensis L． Osbeck） 屬于甜橙類，塔羅科血橙為其常見的血橙品種之一，其果肉呈紅色血絲或血斑狀，具有特有的玫瑰香氣[1-3]。近年來，血橙因富含花青素、類胡蘿卜素、抗壞血酸、多酚等天然活性物質，且肉質細軟、化渣性好而備受消費者青睞[4-6]。脂溶性類胡蘿卜素和水溶性花青素是柑橘類水果中2 種主要的紅色色素[3，7-8]。其中，類胡蘿卜素屬于萜類化合物[9]，鑲嵌于葉綠體和有色體內，其種類繁多，且每年會有新的類胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)[10-11]。類胡蘿卜素的合成受復雜因素的影響，如溫、濕度等外界條件[12-13]。類胡蘿卜素的穩(wěn)定性差，在光、熱、酸等外界條件作用下可發(fā)生氧化、異構等[14]，如臍橙果皮和果肉中的類胡蘿卜素含量受貯藏溫度的影響，且存在明顯的組織特異性[15]。目前人體無法合成類胡蘿卜素，只能依靠飲食攝入，其具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤、抗慢病、增強免疫力等多方面潛在功效[16-17]。近年來，類胡蘿卜素的多樣性組成引起人們的廣泛關注。

血橙果肉的著色屬于低溫依賴型[18-20]，目前鮮有關于長時低溫貯藏對血橙不同部位果肉中類胡蘿卜素酯變化的研究。鑒于此，本研究以不同低溫貯藏期血橙不同部位的果肉為研究對象，采用常用代謝物檢測方法UPLC-API-Q TRAP-MS/MS（超高效液相色譜-大氣壓化學離子源-三重四極桿-線性離子阱質譜，簡稱超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法），系統(tǒng)分析血橙中類胡蘿卜素酯的種類和含量變化，為解析低溫貯藏血橙果肉中類胡蘿卜素酯的多樣性組成及其變化提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塔羅科血橙 （Citrus sinensis L.Osbeck），重慶江津錦橙實業(yè)有限公司。選擇45 個無病蟲害的健康果實作為樣品（生物學重復3 次），分別貯藏0，30，60，90 d（貯藏溫度9 ℃，相對濕度85%），去皮處理后分別沿著果實橫切面赤道左右8 mm 切分，即得到果蒂、赤道和果頂處果肉，立即于-80℃保存，備用。

甲醇、乙腈、乙醇、甲基叔丁基醚均為色譜純級，德國Merck 公司；化合物標準品（色譜純級），美國Sigma-Aldrich 和捷克共和國Olchemim 公司。

1.2 儀器與設備

FD-1A-80 冷凍干燥機，江蘇恒敏儀器制造有限公司；MM400 Retsch 研磨儀，德國萊馳公司；ExionLCTMAD 超高校液相色譜儀（UPLC）和Applied Biosystems 6500 Quadrupole Trap 串聯(lián)質譜儀（MS/MS），美國ABSCIEX 公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC-API-MS/MS 樣品前處理 參考Geyer 等[21-23]的方法并加以修改。將血橙凍干樣品用研磨儀在30 Hz 條件下研磨1 min 至粉末。取50 mg 粉末樣品，分別加入800 μL 正己烷∶丙酮∶乙醇混合提取液（體積比1∶2∶2）和200 μL 蒸餾水，取混合溶液500 μL （含0.01%二叔丁基對甲酚，g/mL）渦旋提取20 min 后12 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液。重復提取4 次后合并上清液，濃縮至干。濃縮后的樣品用100 μL 甲醇∶甲基叔丁基醚混合復溶溶液 （體積比1∶1） 進行復溶后，再加入同體積復溶液的蒸餾水，振蕩混勻后于4 ℃，12 000 r/min 條件下離心5 min。將上清液樣品過0.22 μm 濾膜后，保存于棕色進樣瓶中，以待LC-MS/MS 分析。

1.3.2 UPLC-API-MS/MS 條件

1.3.2.1 UPLC 條件 參考Geyer 等[21-23]的方法并加以修改。YMC C30 色譜柱 （2 mm×100 mm×3 μm）；流速0.8 mL/min；柱溫28 ℃；進樣量2 μL。以甲醇∶乙腈（體積比3∶1）且加入0.01%BHT 和0.1%甲酸的混合液為流動相A，以甲基叔丁基醚（含0.01%BHT）為流動相B，以甲醇為洗針液。利用梯度洗脫進行UPLC 分析，程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Liquid chromatography gradient elution conditions

1.3.2.2 API-MS/MS 條件 參考Geyer 等[21-23]的方法并加以修改。API6500 Q TRAP LC/MS/MS 系統(tǒng)配置一個渦輪離子噴霧接口，在正離子模式下運行，并由Analyst 1.6.3 軟件（AB Sciex）控制。APCI 源操作參數(shù)如下：離子源APCI+；源溫度350℃；簾氣（CUR）25.0 psi；碰撞氣（CAD）中等。優(yōu)化射入電壓（DP）和碰撞電壓（CE），確定各多反應監(jiān)測模式（MRM）離子對的DP 和CE 參數(shù)。根據(jù)在此期間洗脫的類胡蘿卜素酯，對每個時期特定的一組MRM 離子對進行檢測。

1.3.3 血橙果肉類胡蘿卜素酯的定性和定量分析 基于類胡蘿卜素酯標準品對血橙果肉類胡蘿卜素酯進行定性分析。借助三重四極桿質譜的多反應監(jiān)測模式（MRM）分析血橙果肉中類胡蘿卜素酯，在該模式下，目標物質前體離子即母離子的篩選由四極桿完成，以排除其它分子質量物質對應的離子，初步排除干擾。經(jīng)碰撞室誘導電離后，前體離子斷裂，碎片離子形成。特征碎片離子由三重四極桿過濾選出，以排除非目標離子，進一步排除干擾，保證定量的精確性和重復性。不同樣品類胡蘿卜素質譜分析數(shù)據(jù)獲取后，對所有的類胡蘿卜素色譜峰峰面積積分，并對其中同一物質在不同樣本中的色譜峰進行積分校正；利用軟件Analyst1.6.3 處理質譜數(shù)據(jù)，采用標準曲線方程計算各化學成分的含量（以μg/g 鮮重計）。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

應用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用鄧肯多重比較進行差異分析，其中，P＜0.05 表示差異顯著。利用R 語言（含vegan包2.5.4，stats 包3.5.0 和ggplot2 包3.2.0） 進行多變量主成分分析；運用Graphpad Prism 7.0、Photoshop 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 血橙果肉類胡蘿卜素酯的鑒定

血橙不同部位果肉中類胡蘿卜素酯成分由UPLC-API-Q TRAP-MS/MS 分析完成，根據(jù)類胡蘿卜素酯保留時間與離子對的信息，對每種類胡蘿卜素在不同樣本中檢測到的質譜峰進行校正，以確保定性、定量的準確。質譜數(shù)據(jù)則由Analyst 1.6.3 軟件處理。圖1為血橙果肉中類胡蘿卜素酯各組分總離子流圖（Total ions current，TIC）。

圖1 血橙果肉中類胡蘿卜素酯各組分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of components for carotene esters of blood orange pulp

對血橙果肉中類胡蘿卜素酯的定性分析結果見表2，共發(fā)現(xiàn)34 種類胡蘿卜素酯，包括7 種葉黃素酯，1 種新色素棕櫚酸酯，1 種玉紅黃質棕櫚酸酯，12 種紫黃質酯，9 種玉米黃質酯以及4 種β-隱黃質酯。

表2 UPLC-ESI-MS/MS 定性分析血橙果肉類胡蘿卜素酯Table 2 Identification of the carotene esters of blood orange by UPLC-ESI-MS/MS

（續(xù)表2）

2.2 血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯變化的定量分析

配制不同濃度的類胡蘿卜素標準品溶液，獲取各濃度標準品溶液的質譜峰強度數(shù)據(jù)，計算不同類胡蘿卜素酯的標準曲線方程及相關系數(shù)，見表3。

表3 類胡蘿卜素酯標準品標準曲線Table 3 Calibration equations of authentic standard for the carotene esters

（續(xù)表3）

基于積分峰面積和標準曲線方程對34 種血橙果肉類胡蘿卜素酯進行定量分析，如表4分析結果所示，玉紅黃質棕櫚酸酯和β-隱黃質棕櫚酸酯在果蒂、赤道和果頂中含量均最高，其次是β-隱黃質油酸酯、β-隱黃質肉豆蔻酸酯和β-隱黃質月桂酸。此外，新鮮采摘的血橙赤道中玉紅黃質棕櫚酸酯、β-隱黃質棕櫚酸酯、β-隱黃質油酸酯、β-隱黃質肉豆蔻酸酯和β-隱黃質月桂酸的含量均高于果蒂和果頂。果蒂中葉黃素肉豆蔻酸酯、葉黃素棕櫚酸酯、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、葉黃素二棕櫚酸酯、葉黃素二油酸酯、葉黃素油酸酯、新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質棕櫚酸酯、紫黃質月桂酸酯、紫黃質肉豆蔻酸酯、紫黃質棕櫚油酸酯、紫黃質二月桂酸酯、紫黃質-肉豆蔻酸酯-發(fā)酸酯、紫黃質-肉豆蔻酸酯-月桂酸酯、紫黃質二肉豆蔻酸酯、β-隱黃質月桂酸、β-隱黃質肉豆蔻酸酯、β-隱黃質棕櫚酸酯及β-隱黃質油酸酯的含量隨低溫貯藏時間的延長而呈上升趨勢，且0 d 和90 d 組間存在顯著性差異。低溫貯藏期間，赤道和果頂中類胡蘿卜素酯含量變化不明顯，且2 個部位果肉中類胡蘿卜素酯含量在不同貯藏時間組間無顯著性差異。

90 d 0.12±cde 0.00 0.20±d 0.10 0.05±bc 0.01 0.04±de 0.01 0.85±cd 0.20 0.13±abcd 0.07 0.02±abc 0.03 0.75±bc 0.11 0.41±abc 0.08 0.38±bcde 0.05 0.90±abc 0.09 0.05±d 0.04 1.03±bcde 0.09 13.60±d 1.71 13.60±cd 2.51 48.30±e 6.52 18.23±ef 3.57頂果60 d 30 d 0.09±0.13±abcd 0.03 de 0.04 0.18±0.18±bc 0.03 bc 0.00 0.03±0.07±ab 0.01 c 0.02 0.03±0.04±bcd 0.01 e 0.01 0.52±0.79±ab 0.13 bc 0.15 0.09±0.11±abc 0.05 abcd 0.02 0.00±0.01±ab 0.00 abc 0.01 0.55±0.75±ab 0.07 bc 0.16 0.39±0.46±abc 0.05 bcd 0.06 0.29±0.41±ab 0.06 bcde 0.04 0.88±0.99±abc 0.06 d 0.17 0.01±0.04±ab 0.01 bc 0.02 0.86±1.11±abcd 0.09 de 0.15 8.37±13.10±c 1.02 d 2.48 7.04±11.47±ab 0.93 c 1.27 36.17±46.50±c 3.43 de 4.54 13.67±18.57±cd 1.46 ef 1.76 0 d 90 d 0.08±0.09±abc 0.03 abcd 0.03 0.13±0.11±ab 0.03 ab 0.07 0.03±0.04±a 0.01 ab 0.01 0.03±0.02±bcd 0.00 ab 0.00 0.42±0.47±a 0.19 ab 0.13 0.00±0.25±a 0.00 de 0.09 0.00±0.04±a 0.00 bc 0.05 0.36±1.17±a 0.08 de 0.17 0.23±0.59±a 0.07 cd 0.09 0.21±0.45±a 0.06 cde 0.05 0.61±0.80±a 0.05 abc 0.25 0.00±0.02±a 0.00 ab 0.01 0.78±0.68±ab 0.21 a 0.07 4.08±18.07±a 0.38 e 2.98 4.33±14.73±a 0.20 d 1.82 24.13±34.00±ab 3.35 c 2.10 9.39±14.47±abc 1.74 de 2.78道赤60 d 30 d 0.06±0.09±a 0.01 abcd 0.00 0.11±0.11±ab 0.03 ab 0.03 0.04±0.04±ab 0.01 ab 0.00 0.01±0.02±a 0.00 ab 0.01 0.53±0.55±ab 0.13 abc 0.18 0.24±0.25±cde 0.12 cde 0.05 0.04±0.04±bc 0.02 abc 0.03 1.43±1.39±e 0.27 e 0.36 0.52±0.60±bcd 0.05 cd 0.19 0.51±0.42±e 0.11 bcde 0.10 0.88±0.75±abc 0.20 abc 0.18 0.02±0.01±ab 0.02 a 0.01 0.96±0.69±abcde 0.24 a 0.02 14.80±13.90±d 2.07 d 2.49 13.10±11.50±cd 2.52 c 1.78 36.40±30.63±c 8.86 abc 3.73 13.57±11.63±cd 2.72 abcd 1.89 0 d 0.11±bcde 0.01 0.11±ab 0.01 0.03±ab 0.00 0.02±bc 0.01 0.68±abc 0.20 0.13±abcd 0.06 0.00±ab 0.00 0.80±bc 0.20 0.63±d 0.19 0.47±de 0.07 0.83±abc 0.18 0.00±a 0.00 1.07±cde 0.11 7.04±abc 0.66 7.68±b 1.26 33.40±bc 4.07 12.77±bcd 1.93蒂果90 d 60 d 30 d 0.15±0.11±0.07±e 0.03 abcde 0.03 ab 0.01 0.17±0.15±0.07±bc 0.03 bc 0.01 a 0.00 0.07±0.03±0.04±c 0.01 a 0.01 ab 0.01 0.03±0.02±0.01±cde 0.01 ab 0.00 a 0.00 1.11±0.75±0.49±d 0.26 bc 0.21 ab 0.05 0.34±0.13±0.17±e 0.18 abcd 0.06 bcd 0.06 0.06±0.02±0.03±c 0.01 abc 0.02 abc 0.03 1.76±0.99±0.72±f 0.27 cd 0.16 bc 0.10 0.91±0.53±0.55±e 0.06 bcd 0.15 bcd 0.09 0.66±0.42±0.35±f 0.13 bcde 0.03 bcd 0.05 1.01±0.92±0.70±d 0.12 bc 0.12 ab 0.12 0.00±0.00±0.00±a 0.00 a 0.00 a 0.00 1.22±1.09±0.73±e 0.23 cde 0.21 a 0.06 20.33±9.21±7.64±e 2.94 c 1.73 bc 0.99 14.60±8.25±6.33±d 2.26 b 1.92 ab 0.14 46.40±37.87±23.17±de 7.77 cd 7.20 a 3.31 20.23±12.31±8.52±f 4.67 abcd 2.81 ab 0.86）。（P＜0.05義意學計統(tǒng)有異差示表母0 d 0.08±abc 0.00 0.12±ab 0.03 0.03±ab 0.01 0.02±ab 0.00 0.66±abc 0.09 0.07±ab 0.02 0.00±a 0.00 0.49±ab 0.05 0.36±ab 0.07 0.31±abc 0.07 0.75±abc 0.12 0.00±a 0.00 0.81±abc 0.12 4.71±ab 0.53 4.38±a 0.44 22.43±a 2.91 7.94±a 1.07字標肩同不）4表（續(xù)物合化號編-酯酸蔻豆肉-質黃紫18酯酸櫚棕酯酸櫚棕二質黃紫19-酯酸蔻豆肉-質黃紫20酯酸油酯酸油二質黃紫21酯酸櫚棕質黃米玉22酯酸桂月二質黃米玉23-酯酸桂月-質黃米玉24酯酸蔻豆肉酸蔻豆肉二質黃米玉25酯-酯酸桂月-質黃米玉26酯酸櫚棕酸蔻豆肉-質黃米玉27酯酸櫚-棕酯酯酸櫚棕二質黃米玉28-酯酸櫚棕-質黃米玉29酯酸脂硬-棕酯酸-油質黃米玉30酯酸櫚酸桂月質黃隱β-31酯酸蔻豆肉質黃β-隱32酯酸櫚棕質黃隱β-33酯酸油質黃β-隱34行一”；同差準標±值均“平為值數(shù)中：表注

2.3 血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯主成分分析

主成分分析方法（PCA）用于分析低溫貯藏期血橙不同部位果肉中類胡蘿卜素酯的變化特征，分析結果顯示4 個主成分貢獻總方差的91.88%，如圖2a 所示，PC1 和PC2 分別貢獻總方差的58.66%和18.26%。由圖可知，低溫貯藏0 d 和30 d 果蒂樣品（即Ste1 和Ste2）、低溫貯藏0 d 和60 d果頂樣品（Sty1 和Sty3）位于右上部分，低溫冷藏0 d 赤道樣品（即Eq1） 位于右下部分，表明Ste1、Ste2、Sty1、Sty3 和Eq1 與PC1 呈正相關，果蒂低溫貯藏60 d 和90 d（即Ste3 和Ste4）以及果頂?shù)蜏刭A藏30 d 和90 d 樣品（即Sty2 和Sty4）位于左上部分，赤道低溫貯藏30，60 d 和90 d 樣品（即分別為Eq2、Eq3、Eq4）位于左下部分，表明Ste3、Ste4、Eq2、Eq3、Eq4、Sty2 和Sty4 與PC1 呈負相關。此外，Ste1、Ste3、Ste4、Sty1、Sty2、Sty3、Sty4 以 及Eq1與PC2 呈正相關，而Eq2、Eq3、Eq4 以及Ste2 與PC2 呈負相關。以上結果表明，不同低溫貯藏期果蒂、果頂和赤道通過PCA 分析已完成分離并表現(xiàn)出差異顯著性。從PC2 變量圖（圖2b）可知，新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質棕櫚酸酯、紫黃質酯（即紫黃質月桂酸酯、紫黃質肉豆蔻酸酯、紫黃質棕櫚油酸酯、紫黃質二肉豆蔻酸酯、紫黃質-肉豆蔻酸酯-棕櫚酸酯、紫黃質二棕櫚酸酯、紫黃質-肉豆蔻酸酯-油酸酯、紫黃質二油酸酯）、玉米黃質酯（即玉米黃質棕櫚酸酯、玉米黃質二棕櫚酸酯、玉米黃質-棕櫚酸酯-硬脂酸酯、玉米黃質-油酸酯-棕櫚酸酯）、β-隱黃質酯 （即β-隱黃質棕櫚酸酯、β-隱黃質油酸酯） 與PC2 呈正相關，且紫黃質月桂酸酯、紫黃質肉豆蔻酸酯、紫黃質棕櫚油酸酯、紫黃質二肉豆蔻酸酯與Ste4 較為接近；新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質棕櫚酸酯、紫黃質-肉豆蔻酸酯-棕櫚酸酯、紫黃質-肉豆蔻酸酯-油酸酯、玉米黃質棕櫚酸酯、玉米黃質二棕櫚酸酯、玉米黃質-油酸酯-棕櫚酸酯、β-隱黃質棕櫚酸酯、β-隱黃質油酸酯與Sty2 較為接近；紫黃質二棕櫚酸酯、紫黃質二油酸酯與Sty4 較為接近；玉米黃質-棕櫚酸酯-硬脂酸酯與Ste3 較為接近。紫黃質二丁酸酯與PC1 呈正相關，且與Ste1、Eq1、Sty1、Sty3 較為接近。以上結果表明，除葉黃素酯外，不同貯藏期血橙不同部位果肉中的絕大多數(shù)酯類（如新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質棕櫚酸酯、紫黃質酯、玉米黃質酯、β-隱黃質酯）發(fā)生了主要變化。

圖2 血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯主成分分析Fig.2 PCA of components for carotene esters at different parts of blood orange pulp

3 結論

本研究利用UPLC-API-Q TRAP-MS/MS 對低溫貯藏期血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯變化進行分析，分析結果顯示在血橙果肉中共鑒定出34 種類胡蘿卜素酯?；谕鈽朔ǎ藴是€方程）對各類胡蘿卜素酯含量進行定量分析，分析結果顯示在血橙果蒂、赤道和果頂中含量最高的類胡蘿卜素酯均為β-隱黃質棕櫚酸酯和玉紅黃質棕櫚酸酯，其次是β-隱黃質油酸酯。此外，研究結果顯示在低溫貯藏過程中，血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯含量發(fā)生改變，并且在果蒂中多種類胡蘿卜素酯含量隨冷藏時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢。另外，主成分分析結果顯示不同低溫貯藏期果蒂、果頂和赤道的果肉中類胡蘿卜素酯表現(xiàn)出顯著性差異，且不同貯藏期血橙不同部位果肉中的絕大多數(shù)酯類（如新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質棕櫚酸酯、紫黃質酯、玉米黃質酯、β-隱黃質酯）發(fā)生了變化。已有研究顯示，冷藏可能導致柑橘類水果非揮發(fā)性成分的變化[18-19，24]，而果蒂中類胡蘿卜素酯在冷藏過程中的顯著增加可能與代謝相關酶的冷依賴性激活有關。本研究系統(tǒng)分析了不同低溫貯藏時間對血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯組成及含量的影響，為血橙營養(yǎng)價值研究提供參考。