pH值對(duì)“L-抗壞血酸-L-半胱氨酸-甘氨酸”體系揮發(fā)性物質(zhì)形成的影響

馮 亮，余 科，楊 艷，劉雙雙，余愛(ài)農(nóng)

（湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北 恩施 445000）

風(fēng)味是食品品質(zhì)的基本屬性之一，也是影響消費(fèi)者喜好的關(guān)鍵因素[1-3]。食品的特征風(fēng)味形成途徑較多，有些在加工過(guò)程中形成，其中較為重要的一類反應(yīng)是美拉德反應(yīng)[4-6]。美拉德反應(yīng)的本質(zhì)是氨基酸與羰基化合物之間的反應(yīng)。由于L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，ASA）具有潛在的羰基結(jié)構(gòu)且廣泛存在于食物中，因此對(duì)于其美拉德反應(yīng)的研究成為熱點(diǎn)[7-14]。目前，多數(shù)研究?jī)H限于2 組分美拉德反應(yīng)，即L-抗壞血酸與1 種氨基酸的反應(yīng)，這種模擬反應(yīng)比較簡(jiǎn)單[15-17]。而食品工業(yè)中涉及的美拉德反應(yīng)較為復(fù)雜，各反應(yīng)物之間相互作用，使得實(shí)際結(jié)果與模擬結(jié)果存在很大差異。研究L-抗壞血酸與2 種及以上的氨基酸并存的美拉德反應(yīng)模擬體系，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

食品中的美拉德反應(yīng)受多方面因素影響，其中最直接的影響因素是氨基酸種類[18-19]，是否有含硫氨基酸參與反應(yīng)，對(duì)體系揮發(fā)性化合物的形成影響很大[20-21]。其次是反應(yīng)環(huán)境，其中pH 值對(duì)美拉德反應(yīng)中揮發(fā)性物質(zhì)形成與分布的影響至關(guān)重要[22-23]。本研究主要關(guān)注美拉德復(fù)雜體系的反應(yīng)因素，特別是反應(yīng)體系在不同pH 值條件下對(duì)揮發(fā)性化合物的生成與釋放的影響。選取普通氨基酸代表——甘氨酸 （Glycine，Gly） 和含硫氨基酸代表——L-半胱氨酸（L-cysteine，Cys），兩者都是食品工業(yè)中非常重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，如用作食品調(diào)味劑、面粉改良劑等[24-25]。以這2 種氨基酸為反應(yīng)模型，考察它們與L-抗壞血酸之間的美拉德反應(yīng)，模擬食品工業(yè)中美拉德反應(yīng)的復(fù)雜反應(yīng)體系。在對(duì)它們自降解及2 組分體系相互反應(yīng)的基礎(chǔ)上，探討pH 值對(duì)L-抗壞血酸-L-半胱氨酸-甘氨酸3組分體系揮發(fā)性物質(zhì)形成與分布的影響，并探討各揮發(fā)物質(zhì)可能的生成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

L-抗壞血酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純級(jí)，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C5-C20正構(gòu)烷烴、3-氯-2，5-二甲基吡嗪，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；試驗(yàn)用水均為自制二次蒸餾水。

DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器，河南予華儀器有限公司；P160001 厚壁耐壓瓶，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；20 mL 頂空瓶、CONCEPT 多功能樣品前處理系統(tǒng)，德國(guó)PAS 公司；SZ-93 自動(dòng)雙重蒸餾水器，上海亞榮生化儀器廠；BS-124S 電子天平、PB-21 pH 計(jì)，德國(guó)賽多利斯公司；GC6890N-MS5975I 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5（30 m） 毛細(xì)管色譜柱，美國(guó)安捷倫公司；65 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷DVB/CAR/PDMS 固相萃取頭，美國(guó)Supelco 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 反應(yīng)液的配制 根據(jù)課題組之前的報(bào)道[8-10]，發(fā)現(xiàn)提高反應(yīng)溫度和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間有利于揮發(fā)性化合物的生成，因此本研究選擇固定的反應(yīng)時(shí)間120 min 和溫度150 ℃，用磷酸鹽緩沖溶液配制不同pH 值 （4.5，5.8，7.0，8.0，9.5） 的反應(yīng)溶液，各體系原料濃度為0.05 mol/L。試驗(yàn)分組如表1所示。每組試驗(yàn)平行反應(yīng)3 次，結(jié)果取平均值。

表1 試驗(yàn)列表Table 1 Experiment list

1.2.2 檢測(cè)分析方法 采用多功能前處理系統(tǒng)和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-GCMS）聯(lián)用分析技術(shù)，對(duì)反應(yīng)液的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，檢測(cè)方法與條件參數(shù)參考課題組之前的報(bào)道[8-10]。

采用內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)定量。通過(guò)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（3-氯-2，5-二甲基吡嗪）的標(biāo)準(zhǔn)曲線[A=37885.51C+8863280，式中，C——質(zhì)量濃度（mg/L），R2=0.9996]，結(jié)合檢測(cè)樣品的峰面積，計(jì)算各揮發(fā)性化合物的濃度。

在相同萃取及GC-MS 參數(shù)條件下，對(duì)C5-C20正構(gòu)烷烴進(jìn)行檢測(cè)，依此計(jì)算各物質(zhì)的保留指數(shù)（Linear Retention index，RI）。各樣品GC-MS 分析結(jié)果與NIST 20 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比篩選，然后對(duì)比樣品保留指數(shù)以及文獻(xiàn)報(bào)道保留指數(shù)，部分化合物用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，最終確定化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 自降解反應(yīng)

由于各原料自降解過(guò)程所產(chǎn)生的物質(zhì)是其發(fā)生美拉德反應(yīng)的基礎(chǔ)，因此對(duì)各物質(zhì)的自降解研究就顯得尤為重要。同時(shí)單獨(dú)分析各原料物質(zhì)的自降解揮發(fā)性產(chǎn)物，有利于探究復(fù)雜美拉德反應(yīng)體系揮發(fā)性物質(zhì)的生成機(jī)制[26]。經(jīng)試驗(yàn)初探分析，發(fā)現(xiàn)甘氨酸比較穩(wěn)定，受熱無(wú)揮發(fā)性物質(zhì)生成[27]。在此主要探討L-抗壞血酸和L-半胱氨酸自降解過(guò)程揮發(fā)性物質(zhì)的生成情況，如表2所示。

表2 L-抗壞血酸、L-半胱氨酸自降解揮發(fā)性物質(zhì)的生成Table 2 The volatile formation form the self-degradation reaction of ASA and Cys

（續(xù)表2）

由于L-抗壞血酸具有五元環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，很容易發(fā)生水解開(kāi)環(huán)，繼而發(fā)生裂解反應(yīng)。由表2可知，L-抗壞血酸在不同pH 值條件下生成了不同種類和含量的揮發(fā)性物質(zhì)。在酸性條件下，L-抗壞血酸主要生成糠醛以及呋喃類化合物；當(dāng)溶液pH值逐漸升高，趨于中、堿性時(shí)，L-抗壞血酸自降解主要生成環(huán)戊烯酮類化合物以及2，5-二甲酰呋喃。

L-半胱氨酸是含硫氨基酸的代表，因硫的原子半徑比較大，其最外層電子受原子核影響較小，反應(yīng)活性高。從表2可知，L-半胱氨酸自降解產(chǎn)物主要以噻吩類化合物為主，且大多數(shù)化合物在酸、堿條件下均可生成。一些簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)化合物如3-乙基噻吩和噻吩-2-硫醇，更容易在酸性環(huán)境下生成。

2.2 2 組分美拉德反應(yīng)

基于L-抗壞血酸與氨基酸的美拉德反應(yīng)報(bào)道較多，由于甘氨酸與L-半胱氨酸的2 組分反應(yīng)中甘氨酸并不活躍，L-半胱氨酸為主要反應(yīng)原料，因此本試驗(yàn)主要討論L-抗壞血酸與甘氨酸、L-抗壞血酸與L-半胱氨酸2 組分美拉德反應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)生成情況，如表3～4 所示。

2.2.1 L-抗壞血酸/甘氨酸美拉德反應(yīng) L-抗壞血酸與甘氨酸的美拉德反應(yīng)生成的揮發(fā)性物質(zhì)如表3所示。

表3 L-抗壞血酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)的生成Table 3 The volatile formation in Maillard reaction of ASA/Gly

（續(xù)表3）

從表3可知，L-抗壞血酸與甘氨酸經(jīng)美拉德反應(yīng)生成的揮發(fā)性物質(zhì)除少數(shù)吡啶、吡咯和呋喃類化合物外，其它主要為吡嗪類衍生物，而且pH值對(duì)此體系揮發(fā)生物質(zhì)的生成與分布影響較大。與表2對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，揮發(fā)性物質(zhì)主要來(lái)自L-抗壞血酸的自降解產(chǎn)物，而在堿性條件下主要為吡嗪類化合物。這說(shuō)明在酸性條件下，甘氨酸不能提供美拉德反應(yīng)所需氨基前體物，而堿性條件下可以。

2.2.2 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng) 與L-半胱氨酸有關(guān)的美拉德反應(yīng)模型常用來(lái)模擬研究肉香味化合物的形成，肉香味的來(lái)源主要是其反應(yīng)生成了一些含硫揮發(fā)性化合物。不同pH 值條件下L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng)生成的揮發(fā)性物質(zhì)如表4所示。

表4 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)生物質(zhì)的生成Table 4 The volatile formation in Maillard reaction of ASA/Cys

（續(xù)表4）

由表4可知，L-抗壞血酸與L-半胱氨酸反應(yīng)生成的揮發(fā)性化合物主要是含硫的噻吩、噻唑、硫醇類化合物，以及含氮的吡嗪化合物。噻吩類化合物作為主要生成物，在酸、中、堿性條件下均有生成，這可能與硫元素有較好的化學(xué)活性有關(guān)。吡嗪類化合物是美拉德反應(yīng)的標(biāo)志性化合物，主要在堿性條件下生成，這可能是由于吡嗪的生成需要氨基前體化合物，而氨基前體化合物在堿性條件下更容易生成。

綜合分析表3和表4可知，氨基前體物在堿性條件下更容易生成，吡嗪類化合物的生成依賴于氨基前體物的生成。

2.3 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)

L-抗壞血酸、L-半胱氨酸和甘氨酸是3 種各具代表性的化合物，用來(lái)模擬美拉德復(fù)雜反應(yīng)體系有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。3 組分體系生成的揮發(fā)性化合物如表5所示。

表5 L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)揮發(fā)生物質(zhì)的生成Table 5 The volatile formation in Maillard reaction of ASA/Cys/Gly

（續(xù)表5）

分析表5發(fā)現(xiàn)，3 組分復(fù)雜美拉德反應(yīng)體系的揮發(fā)性物質(zhì)主要是噻吩、噻唑和吡嗪類化合物，且體系的pH 值對(duì)各化合物的分布及生成有較大影響。噻吩類化合物在不同pH 值體系中均能生成；在酸性條件下，主要生成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的噻吩類化合物和硫醇類化合物，幾乎沒(méi)有吡嗪類化合物生成。這與L-抗壞血酸/L-半胱氨酸2 組分反應(yīng)體系比較相似，其原因可能是由于甘氨酸在酸性條件下比較穩(wěn)定，沒(méi)有參與到反應(yīng)中去；在中堿性條件下，主要生成物是噻吩和噻唑類化合物，而吡嗪類化合物僅有少量生成。相比于L-抗壞血酸/甘氨酸體系有大量吡嗪類化合物生成，說(shuō)明噻吩和噻唑類化合物的生成與吡嗪類化合物的生成具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，且噻吩和噻唑的生成占有較大優(yōu)勢(shì)。

由于L-抗壞血酸/L-半胱氨酸2 組分體系和L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸3 組分體系在揮發(fā)性物質(zhì)的生成種類分布上有相似之處，其揮發(fā)性物質(zhì)的生成機(jī)制可能也類似，因此對(duì)比分析了兩體系的揮發(fā)性物質(zhì)生成情況雷達(dá)圖，如圖1所示。

圖1 不同pH 值條件下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart of Maillard reaction products under different pH values

整體來(lái)看，2 個(gè)體系生成物的種類分布非常相似，生成物均以噻吩、噻唑、硫醇和吡嗪類化合物為主，其中，噻吩和硫醇類化合物的含量較高。在3 組分體系中由于甘氨酸的參與，氮源更加豐富，吡嗪類物質(zhì)濃度可能會(huì)提高，然而對(duì)比表3～5數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，3 組分體系吡嗪類化合物的濃度并沒(méi)有明顯增加，而含硫化合物的含量有大幅增加。此結(jié)果表明含硫化合物的生成相比于吡嗪類化合物的生成在各反應(yīng)體系中具有更大優(yōu)勢(shì)。

2.4 反應(yīng)機(jī)理分析

根據(jù)不同條件下的試驗(yàn)結(jié)果，提出了L-抗壞血酸、L-半胱氨酸體系揮發(fā)性化合物可能的生成機(jī)制，如圖2所示。

圖2 L-抗壞血酸、L-半胱氨酸自降解揮發(fā)性物質(zhì)的生成及其產(chǎn)物相互作用機(jī)制Fig.2 The volatile formation form the self-degradation of ASA and Cys and the reaction mechanism between different products

L-抗壞血酸是一個(gè)五元內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，很容易水解開(kāi)環(huán)、脫羧，生成阿拉伯糖或木糖等五碳糖結(jié)構(gòu)。五碳糖進(jìn)一步裂解，生成羥基乙醛、乙二醛、1，3-丁二酮、甲醛和乙醛等帶有活潑羰基的結(jié)構(gòu)，這些小分子作為活性中間體會(huì)進(jìn)一步相互反應(yīng)，最終生成各種揮發(fā)性化合物。L-半胱氨酸是兩性化合物，大部分以離子形態(tài)存在。加熱時(shí)，L-半胱氨酸發(fā)生Strecker 降解，生成氨氣、硫化氫以及巰基乙醛，進(jìn)一步降解生成甲醛、乙醛等小分子活性物質(zhì)。L-半胱氨酸也可以通過(guò)脫羧生成2-氨基乙硫醇，再脫去硫化氫、氨氣生成乙炔。乙炔在硫化氫作用下發(fā)生加成反應(yīng)生成噻吩，噻吩再與各種小分子反應(yīng)生成各種噻吩衍生物。

吡嗪、噻吩和噻唑類化合物的生成如圖2c 所示。含有羰基的活性中間體組成目標(biāo)分子的碳骨架，再由含有雜原子的硫化氫、氨氣取代，最后經(jīng)過(guò)脫水、環(huán)化、還原等步驟生成目標(biāo)分子。

各揮發(fā)性化合物在酸、中、堿性條件下的生成機(jī)理如圖3所示。在酸性條件下生成的揮發(fā)性化合物種類相對(duì)較少，主要為噻吩和硫醇類化合物。噻吩類化合物由噻吩母體結(jié)構(gòu)與甲醛、乙醛發(fā)生取代反應(yīng)，生成噻吩衍生物；而硫醇類化合物則是硫化氫取代氧原子生成的。在中、堿性條件下，吡嗪、噻吩和噻唑均有生成，由于各自側(cè)基結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致最終的揮發(fā)性物質(zhì)種類繁多。這些化合物側(cè)基多為甲基、乙基和乙?；贁?shù)側(cè)基為大于2個(gè)碳數(shù)的飽和/不飽和烴基。此反應(yīng)過(guò)程涉及較多的親核加成、取代、脫水及消去反應(yīng)等。其中，多為2-羥基乙醛、乙二醛及其衍生物與氨氣、硫化氫間的親核加成或親核取代反應(yīng)，生成含氮、硫的中間產(chǎn)物，然后經(jīng)過(guò)脫水環(huán)化、還原反應(yīng)生成吡嗪、噻吩、噻唑、硫醇類化合物。

圖3 酸、中、堿性條件下?lián)]發(fā)性物質(zhì)生成機(jī)制Fig.3 The formation mechanism of different volatile under acid，medium and alkaline conditions

3 結(jié)論

3 組分復(fù)雜美拉德反應(yīng)體系與單組分及2 組分反應(yīng)體系在揮發(fā)性物質(zhì)種類與分布上有較大區(qū)別；反應(yīng)體系中吡嗪類化合物和含硫類化合物存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。從生成物的種類、分布與含量等分析發(fā)現(xiàn)，L-抗壞血酸自降解主要生成呋喃類化合物；L-半胱氨酸自降解主要生成噻吩類化合物；L-抗壞血酸/甘氨酸美拉德反應(yīng)主要生成豐富的吡嗪類化合物；L-抗壞血酸/L-半胱氨酸美拉德反應(yīng)主要生成噻吩、噻唑、吡嗪、硫醇類化合物，吡嗪類化合物種類和濃度較少；L-抗壞血酸/L-半胱氨酸/甘氨酸3 組分美拉德反應(yīng)生成物的分布與L-抗壞血酸/L-半胱氨酸2 組分體系比較相似，而3 組分體系生成的物質(zhì)含量更多。從反應(yīng)機(jī)制上看，不含硫氨基酸的美拉德反應(yīng)生成物主要為吡嗪類物質(zhì)；而含硫氨基酸的美拉德反應(yīng)生成物主要為含硫的噻吩、噻唑以及硫醇類化合物；當(dāng)這2 種氨基酸同時(shí)存在發(fā)生美拉德反應(yīng)時(shí)，二者存在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，然而由于硫原子反應(yīng)活性較高，生成物仍以含硫化合物為主，伴有少量吡嗪類化合物存在。