當(dāng)歸揮發(fā)油改善阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶機(jī)制初探

王虎平

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；2甘肅省方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，蘭州 730000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)作為一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，由多種因素(包括生物和社會心理因素)共同作用誘發(fā)。其中神經(jīng)遞質(zhì)改變、氧化應(yīng)激及β淀粉樣蛋白沉積等已成為明確誘因，且形成相互影響的級聯(lián)惡化反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)、激發(fā)了AD的發(fā)生發(fā)展。

當(dāng)歸作為“十大隴藥”、甘肅道地藥材，課題組在前期研究中已初步探明了其防治AD的作用[1，2]。為了推進(jìn)當(dāng)歸防治AD的有效組部位、組分的細(xì)化研究，課題組將遴選當(dāng)歸的明確部位(組分)多糖、揮發(fā)油及阿魏酸進(jìn)行有效組分及組分配伍研究，進(jìn)一步優(yōu)選防治AD的當(dāng)歸核心部位或組分。本實驗基于神經(jīng)遞質(zhì)改變、氧化應(yīng)激及β淀粉樣蛋白沉積等發(fā)病學(xué)說，研究當(dāng)歸主要活性部位當(dāng)歸揮發(fā)油防治AD的作用及其初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠70只，雌雄各半，3月齡，體重200±20 g，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜醫(yī)研究所實驗動物場提供，許可證號：SCXK(甘)2015-0001-62000600000198。

1.2 試劑與儀器

當(dāng)歸揮發(fā)油(水蒸氣蒸餾法提取，藁本內(nèi)酯含量40 %)由甘肅省輕工業(yè)科學(xué)研究所友情提供；Aβ25-35購于(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，批號：20160509)；Rat APP ELISA KIT(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：1069820)；Rat Aβ1-42ELISA KIT(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：1069821)；Rat Ach ELISA KIT(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：1069818)；Rat ChAT ELISA KIT(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：1069819)；AChE試劑盒(南京建成生物化學(xué)試劑有限公司，批號：20161218)；MDA試劑盒(南京建成生物化學(xué)試劑有限公司，批號：20161221)；SOD試劑盒(南京建成生物化學(xué)試劑有限公司，批號：20161221)；考馬斯亮藍(lán)蛋白測試盒(南京建成生物化學(xué)試劑有限公司，批號：20161220)；鹽酸多奈哌齊(安理申)(衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，批號：1604043)購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；青霉素160萬單位(華北制藥股份有限公司，批號：F6057301)購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號：WMT-100)；酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM-9602)；紫外分光光度計(日本島津，型號：UV-120-02)；數(shù)字恒溫水浴鍋(江蘇正基儀器有限公司，型號：HH-S2)；臺式高速冷凍離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備有限公司，型號：CT14RD)；HANGPING電子秤(上海精科公司天平儀器廠，型號：JY4001)。大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司，型號：WT-200)；牙科鉆(韓國世新公司，型號：STRONG-90)；微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)。

1.3 造模與給藥

實驗大鼠在SPF級實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力篩選，剔除不合格大鼠。將合格的大鼠隨機(jī)選取10只(雌雄各半)為假手術(shù)組，其余大鼠全部以10 %水合氯醛(350 mg/kg)行腹腔注射麻醉，參考《大鼠腦立體定位圖譜》[3]在海馬CA1區(qū)注射已孵化好的Aβ25-35溶液(假手術(shù)組大鼠等位點注射同劑量生理鹽水)2 μL復(fù)制模型。假手術(shù)組及所有造模動物在手術(shù)后，皆用碘伏擦拭傷口并涂青霉素粉末100 000 U。30 ℃恒溫室內(nèi)單籠留置至蘇醒后放回大籠，并每天肌肉注射青霉素100 000 U/只，連續(xù)7天。造模大鼠7天后進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測試，篩選造模成功的50只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性(安理申)組、當(dāng)歸揮發(fā)油低、中、高劑量組等5組，每組10只。

精密量取當(dāng)歸揮發(fā)油適量，以吐溫-80為乳化劑，分散于生理鹽水中，采用研磨法制成O/W型乳劑，作為供試藥物，其中當(dāng)歸揮發(fā)油濃度分別為低劑量組0.002 2 mL/mL，中劑量組0.004 4 mL/mL，高劑量組0.008 8 mL/mL。精密稱取安理申在研缽中研為粉末，充分溶解于生理鹽水中，制成0.045 mg/mL的溶液，作為陽性藥物。精密量取生理鹽水，加入同比例吐溫-80乳化劑，制成生理鹽水混懸液，作為空白對照給藥。

造模第7天篩選分組后開始給藥。模型組與假手術(shù)組大鼠灌胃生理鹽水(吐溫-80)混懸液2 mL/100 g·d-1，當(dāng)歸揮發(fā)油低(濃度0.002 2 mL/mL)、中(濃度0.004 4 mL/mL)、高劑量組(濃度0.008 8 mL/mL)及陽性組(濃度0.045 mg/mL)大鼠分別灌胃各組對應(yīng)藥液2 mL/100 g·d-1，連續(xù)28天。

1.4 Morris水迷宮行為學(xué)測試

1.4.1 定位航行實驗

Morris水迷宮水池按方位分為四個象限，將逃生平臺放置在固定象限。測試時將大鼠面向池壁從四個象限各自的固定入水點放入水中，記錄其入水后尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。如果大鼠在2 min內(nèi)沒有找到平臺，則記為120 s。共歷時4天，每日更換入水象限進(jìn)行測試。

1.4.2 空間探索實驗

Morris水迷宮實驗第5天撤走水下逃生平臺，任選1個象限入水點將大鼠放入水池，讓大鼠在無平臺情況下憑記憶尋找平臺位置。記錄大鼠入水后首次經(jīng)過原平臺位置的潛伏期及120 s內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)及在原平臺象限的游泳時間百分比。

1.5 血清ACh、ChAT、AChE、SOD、MDA及海馬組織APP、Aβ1-42測定

空間探索實驗結(jié)束后，各組大鼠自由飲水、禁食12 h，然后腹主動脈取血，4 ℃、10 000 r/min離心3 min，取血清以ELISA法測定乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)含量及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)活性、比色法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，然后處死動物，迅速取出腦組織，分離海馬，加生理鹽水制成10%的勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，吸取上清液以ELISA法測定β淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein，APP)、β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein 1-42，Aβ1-42)含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示后，代入Graphpad Prism8.0軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)對比，采用獨立樣本t檢驗，制做圖形表現(xiàn)結(jié)果間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；P<0.01為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 動物死亡情況

由于手術(shù)造模創(chuàng)傷較大，且每只動物每天灌胃給藥，實驗周期較長，各組出現(xiàn)了不同程度的動物死亡。其中模型組、假手術(shù)組各死亡2只，當(dāng)歸揮發(fā)油低、中劑量組各死亡1只，陽性組死亡3只。

2.2 Morris水迷宮試驗測定學(xué)習(xí)記憶能力結(jié)果

2.2.1 對AD模型大鼠定位航行能力的影響

模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限滯留時間較少，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)治療后當(dāng)歸揮發(fā)油各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度縮短，目標(biāo)象限滯留時間均有不同程度增多，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)(見圖1、2)。

圖1 各組大鼠逃避潛伏期

圖2 各組大鼠目標(biāo)象限滯留時間百分比

2.2.2 對AD模型大鼠空間探索能力的影響

模型組大鼠首次到達(dá)原逃生平臺位置的潛伏時間明顯延長，穿越原平臺位置的次數(shù)、在目標(biāo)象限滯留時間較少，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)治療后當(dāng)歸揮發(fā)油各劑量組大鼠首次到達(dá)原平臺位置的潛伏期明顯縮短，穿越原平臺位置的次數(shù)均有不同程度提升，在目標(biāo)象限滯留時間均有不同程度增多，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)(見圖3、4、5)。

圖3 各組大鼠首次到達(dá)原平臺位置潛伏期

圖4 各組大鼠穿越原平臺位置次數(shù)

圖5 各組大鼠目標(biāo)象限滯留時間百分比

2.3 對AD模型大鼠血清ACh含量與ChAT、AChE活性的影響

模型組大鼠血清ACh含量與ChAT活性明顯降低，AChE活性明顯增強(qiáng)，與假手術(shù)組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)治療后當(dāng)歸揮發(fā)油各劑量組大鼠血清ACh含量提高，ChAT活性增強(qiáng)，AChE活性減弱，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)(見圖6～8)。

圖6 各組大鼠血清ACh水平

圖7 各組大鼠血清ChAT水平

圖8 各組大鼠血清AChE水平

2.4 對AD模型大鼠血清SOD活性、MDA水平的影響

模型組大鼠血清SOD活性顯著降低，MDA水平明顯增高，與假手術(shù)組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)治療后當(dāng)歸揮發(fā)油各劑量組大鼠血清SOD活性顯著增強(qiáng)，高劑量組大鼠MDA水平明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)(見圖9、10)。

圖9 各組大鼠血清SOD活性

圖10 各組大鼠血清MDA水平

2.5 對AD模型大鼠海馬APP、Aβ1-42含量的影響

模型組大鼠海馬組織APP、Aβ1-42含量明顯增高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)治療后當(dāng)歸揮發(fā)油各組大鼠海馬組織APP、Aβ1-42含量明顯降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)(見圖11)。

圖11 各組大鼠APP、Aβ1-42蛋白含量

3 討論與結(jié)論

AD作為神經(jīng)系統(tǒng)常見的一種退行性疾病，已躍居全球十大死因之列。中醫(yī)藥防治AD歷史久遠(yuǎn)，文獻(xiàn)記錄豐富，且現(xiàn)代研究表明中醫(yī)藥治療AD具有明顯的療效和安全性。當(dāng)歸甘補(bǔ)辛散而性情溫和，不僅能補(bǔ)血、活血，還可疏達(dá)肝氣、調(diào)暢氣機(jī)。如《景岳全書·本草正》指出：“當(dāng)歸，其味甘而重，故專能補(bǔ)血；其氣輕而辛，故又能行血。補(bǔ)中有動，行中有補(bǔ)，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也?！蠹s佐之以補(bǔ)則補(bǔ)，故能養(yǎng)營養(yǎng)血，補(bǔ)氣生精，安五臟，強(qiáng)形體，益神志，凡有形虛損之病，無所不宜。”《藥鑒》云：“當(dāng)歸氣溫，味辛甘，氣味俱輕，可升可降，陽也。多用，大益于血家，諸血證皆用之。但流通而無定，由其味帶辛甘而氣暢也，隨所引導(dǎo)而各至焉。入手少陰，以其心主血也；入足太陰，以其脾裹血也；入足厥陰，以其肝藏血也?！笨梢姡?dāng)歸氣血同調(diào)，補(bǔ)虛通滯，是補(bǔ)血活血、調(diào)肝導(dǎo)滯之要藥，符合AD“痰瘀虛”三大病機(jī)?，F(xiàn)代研究亦表明，當(dāng)歸具有抗自由基氧化、抗衰老作用[4]，可緩解腦缺血后細(xì)胞的凋亡[5]，減輕癡呆小鼠記憶缺失[1]，顯示出對AD的潛在防治作用。當(dāng)歸揮發(fā)油是其重要的藥效部位，含有苯酞類、酚類、萜烯類等化合物。已證實多類化合物具有保護(hù)神經(jīng)、改善學(xué)習(xí)記憶的能力，如對苯酞類化合物中常見的藁本內(nèi)酯的研究顯示，藁本內(nèi)酯可通過促進(jìn)清除Aβ沉積的途徑保護(hù)神經(jīng)元[6]。Liu等[7]預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物，認(rèn)為當(dāng)歸揮發(fā)油的核心靶點位于海馬、大腦皮層、基底節(jié)等區(qū)，且與神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。由于當(dāng)歸揮發(fā)油中部分化合物不穩(wěn)定，易發(fā)生異構(gòu)化和降解反應(yīng)[8]，為盡可能保證當(dāng)歸揮發(fā)油的穩(wěn)定性，極大程度還原其對腦神經(jīng)的作用，本次實驗采用當(dāng)歸揮發(fā)油灌胃的方式探究其對AD大鼠的作用。

本研究以海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35溶液復(fù)制AD模型，從神經(jīng)遞質(zhì)改變、氧化應(yīng)激及β淀粉樣蛋白沉積等角度探討了當(dāng)歸揮發(fā)油對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油可顯著縮短模型大鼠逃避潛伏期，延長目標(biāo)象限滯留時間，縮短首次到達(dá)原逃生平臺位置潛伏時間，增多跨原平臺次數(shù)，并可顯著提升血清ACh含量與ChAT、SOD活性，降低血清AChE活性、MDA水平及海馬APP、Aβ1-42含量，較好地改善了模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，表明其對AD具有一定的防治作用。

眾多研究表明，老年斑(senile plaques，SP)是AD的核心病理表現(xiàn)，由APP裂解為Aβ后進(jìn)一步聚合而成。Aβ1-42與Aβ1-40是APP的裂解產(chǎn)物，其中Aβ1-42更容易聚集,具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。當(dāng)腦內(nèi)Aβ1-42產(chǎn)生與清除機(jī)制的平衡遭到破壞，導(dǎo)致Aβ1-42在腦內(nèi)過多堆積，呈現(xiàn)出彌散型斑塊即SP；Aβ1-42的聚積還可促使氧化應(yīng)激、破壞機(jī)體膽堿能系統(tǒng)等進(jìn)一步誘發(fā)或加速AD的發(fā)生發(fā)展。由于APP、Aβ尤其是Aβ1-42的大量堆砌將會激發(fā)多種機(jī)制、通過多種途徑促成AD的發(fā)生，因此APP、Aβ的含量測定成為衡量AD病情的指標(biāo)之一。本研究表明當(dāng)歸揮發(fā)油可降低APP、Aβ1-42含量，其中當(dāng)歸揮發(fā)油與APP含量存在量效關(guān)系，當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量對Aβ1-42的抑制最強(qiáng)。當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量降低APP含量效果最佳，但此時Aβ1-42含量卻高于當(dāng)歸揮發(fā)油低、中劑量組，在今后的研究中可進(jìn)一步探索當(dāng)歸揮發(fā)油抑制APP、Aβ1-42含量的最佳濃度、高劑量當(dāng)歸揮發(fā)油是否在抑制APP表達(dá)的同時激活其他促進(jìn)Aβ1-42產(chǎn)生的通路，以及降低APP含量是否存在有效范圍。

機(jī)體在自然衰老的過程中神經(jīng)元會產(chǎn)生大量自由基[9]，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，形成具有細(xì)胞毒性的終極產(chǎn)物MAD，引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，亦能促進(jìn)Aβ的毒性和聚集，促使AD老年斑的形成[10]。而膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與大腦記憶的形成、貯存亦密切相關(guān)，直接影響著學(xué)習(xí)、記憶的能力[11]。其中乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于腦組織，由膽堿、乙酰輔酶A在ChAT的催化下合成，在AChE的切割下分解?？梢姡珻hAT和AchE的活性反映了ACh在腦中合成與代謝的速率，是維持Ach含量動態(tài)平衡的矛盾二體[12]。因此，ChAT催化活性的降低和AChE裂解活性的增強(qiáng)會引發(fā)乙酰膽堿的減少甚至缺失，必將導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知功能下降，記憶能力喪失。本研究表明，當(dāng)歸揮發(fā)油可顯著提升血清ACh含量與ChAT，降低血清AChE活性，其中中劑量當(dāng)歸揮發(fā)油對ChAT的作用弱于低、高劑量組，但當(dāng)歸揮發(fā)油與Ach水平存在量效關(guān)系。高劑量當(dāng)歸揮發(fā)油提升SOD活性，降低MDA水平效果最佳?，F(xiàn)從膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)與氧化角度證實當(dāng)歸揮發(fā)油對AD的作用，與此前用當(dāng)歸水煎液干預(yù)AD模型小鼠的結(jié)果一致[1]，因此當(dāng)歸揮發(fā)油可能是起效的主要成分之一。本實驗僅探討了當(dāng)歸揮發(fā)油對AD的治療作用，其在體內(nèi)外的吸收代謝規(guī)律及改善膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)及提升抗自由基氧化能力等機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

綜上所述，當(dāng)歸揮發(fā)油可有效改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與促進(jìn)Aβ的代謝、改善膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)及提升抗自由基氧化能力等多通路及相互間級聯(lián)作用相關(guān)。