基于主成分分析的青熟酸棗果肉初生及次生代謝產(chǎn)物差異變化的研究

楊興晶，劉妍如*，唐志書*，宋忠興，常百金，趙艷婷，趙夢(mèng)利

1陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，咸陽 712083；2長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117

酸棗(Ziziphusjujubavar.spinosa)隸屬于鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)木本植物[1]，酸棗果肉、酸棗仁和酸棗葉等產(chǎn)品都有很高的藥用價(jià)值?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載酸棗果肉可以作為藥用，其具有止血止瀉的功能，主治出血、腹瀉等癥狀[2]。相比酸棗仁，酸棗果肉不僅具有藥用價(jià)值還具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，酸棗果肉中含有豐富的維生素C[3]、可溶性糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、小分子有機(jī)酸、萜類及皂苷類、黃酮類[4]、生物堿類[5]等成分，其中有鎮(zhèn)靜、催眠活性的三萜皂苷類化合物的含量高于酸棗仁[6]。

酸棗果肉具有改善睡眠、保肝、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力及改善心腦血管疾病[4]、抗氧化[7]等藥理作用，可開發(fā)甜味抑制、抗抑郁、保肝、抗菌等產(chǎn)品[6]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，中藥材在不同的生長階段，其體內(nèi)的成分類型以及含量都會(huì)發(fā)生很大的變化，造成此種現(xiàn)象的原因可能由于藥材植株或果實(shí)在生長的過程中，由于光照、水分以及外部條件刺激的不同，進(jìn)而影響其體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成[8,9]。Xiang等[10]對(duì)不同生長階段的貫葉金絲桃進(jìn)行測(cè)定，利用PCA分析出不同生長階段的貫葉金絲桃藥材的最佳采收階段；Yan等[11]檢測(cè)了不同成熟期的棗果營養(yǎng)物質(zhì)含量，分析了棗果成熟過程中營養(yǎng)物質(zhì)變化規(guī)律，結(jié)果都可系統(tǒng)、全面地評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量且為其適宜采收期提供科學(xué)依據(jù)。測(cè)定不同生長階段藥材中的成分類型，可確定其采收期，提高藥材中主要有效成分的含量，增強(qiáng)其藥用療效，還可為藥材質(zhì)量提供參考[12]。酸棗果肉在使用方面主要以果汁液體飲料為主[13]，不同成熟度的酸棗果肉成分類型對(duì)飲料風(fēng)味也有很大的影響。因此，分析不同成熟期酸棗果肉成分類型差異對(duì)成分分析、質(zhì)量控制和采收期有重要意義。

本研究采收了紅果期熟酸棗和青果期青酸棗。以UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)青、熟酸棗果肉的主要成分類型進(jìn)行分析，并結(jié)合PCA主成分分析方法，計(jì)算兩個(gè)青、熟酸棗果肉中的初生代謝物的差異，對(duì)差異初生代謝物與次生代謝物進(jìn)行含量測(cè)定，最后通過差異代謝物含量差異對(duì)生物合成途徑的進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1290型高效液相色譜(美國Agilent公司)；AB SCIEX 4500 Qtrap三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；Waters ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色譜(美國Waters公司)；Triple TOFTM5600三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(Sartorius科學(xué)儀器有限公司)；VaCo5型冷凍干燥機(jī)(德國Zirbus公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；TQ-200高速多功能粉碎機(jī)(上海市天祺盛世科技有限公司)，Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 材料

對(duì)照品表兒茶素(批號(hào)MUST-17060114，純度99.51%)購自成都曼斯特生物科技有限公司；兒茶素(批號(hào)HC019123198，純度98%)購自寶雞辰光生物科技有限公司；齊墩果酸(批號(hào)wkq16051205，純度98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司；金絲桃苷(批號(hào)111521-201809，純度94.9%)、蘆丁(批號(hào)100080-201811，純度91.7%)、槲皮素(批號(hào)100081-201610，純度99.1%)、熊果酸(批號(hào)110742-201421，純度93.8%)、酸棗仁皂苷B(批號(hào)110814-201809，純度96.2%)購自中國食品藥品檢定研究院；L-酪氨酸(批號(hào)0609-0109)、L-苯丙氨酸(批號(hào)624-200104)購自中國藥品生物制品檢定所。無水乙醇(分析級(jí)，安徽安特食品股份有限公司)；甲醇(分析級(jí)，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；乙腈(色譜級(jí)，德國Merck公司)；甲醇(色譜級(jí)，德國Merck公司)；甲酸(批號(hào)：H158A，美國Sigma-Aldrich公司)；水為超純水(密理博Milli-Q Integral 5超純水機(jī)制備)。

樣品為青果期青酸棗果實(shí)與紅果期熟酸棗果實(shí)(見表1)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院白吉慶副教授鑒定為鼠李科棗屬植物酸棗Zizyphusjujubavar.spinosa的果實(shí)。

表1 青、熟酸棗樣品的批號(hào)及產(chǎn)地

1.3 干燥方法

取各批次紅果期熟酸棗果實(shí)和青果期青酸棗果實(shí)進(jìn)行清洗，分別取各批次兩種果實(shí)適量，將果肉與果核分開，留下果肉進(jìn)行標(biāo)記，裝入不銹鋼托盤中均勻攤開，所有樣品先進(jìn)行-80 ℃冷凍處理6 h以上，再將冷凍后的樣品放入冷凍干燥儀進(jìn)行冷凍干燥72 h，干燥后粉碎，過4號(hào)篩，記為熟酸棗果肉(SSZ)和青酸棗果肉(QSZ)，裝袋保存。部分分類如圖1所示。

圖1 青、熟酸棗果實(shí)樣品

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取兒茶素1.52 mg、表兒茶素1.48 mg、槲皮素1.46 mg、金絲桃苷1.54 mg、蘆丁1.36 mg、酸棗仁皂苷 B 0.97 mg、齊墩果酸1.38 mg、熊果酸1.10 mg、L-苯丙氨酸1.02 mg、L-酪氨酸0.52 mg對(duì)照品置4 mL離心管中，分別加甲醇1.52、1.48、1.46、1.54、1.36、0.97、1.38、1.10、1.02、0.52 mL制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 供試品溶液的制備[14]

各精密稱取“1.3”項(xiàng)下熟酸棗果肉藥材粉末、青酸棗果肉藥材粉末約1.0 g(過4號(hào)篩)，分別置于100 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放至室溫，用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.5 成分表征色譜條件

1.5.1 液相條件

采用5600型質(zhì)譜儀進(jìn)行成分表征，色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸-水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～30 min，5%→95% B；30～35 min，95% B；35～38 min，95%→5% B；38～40 min，5% B；體積流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長254 nm。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子模式下，采用信息依賴采集(IDA)、動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)和高靈敏度模式采集數(shù)據(jù)。離子掃描范圍m/z100～2 000，正離子模式下源噴射電壓(ion spray voltage floating)為5 500 V，負(fù)離子模式下源噴射電壓為-4 500 V，裂解電壓(declustering potential，DP)為80 V，碰撞能量(collision energy，CE)為35 eV，正負(fù)離子模式下，霧化氣(ion source gas 1，GS1)和輔助氣(ion source gas 2，GS2)為氮?dú)?，均?0 psi，氣簾氣(curtain gas，CUR)為35 psi，霧化溫度(temperature，TEM)500 e。

1.6 定量色譜條件

1.6.1 液相條件

采用4500型質(zhì)譜儀進(jìn)行成分定量，色譜柱為ACQUITY UPLC?B×H C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸-水溶液(A)-乙腈溶液(B)，梯度洗脫程序?yàn)?～11 min，98%→70% A；11～13 min，70%→65% A；13～16 min，65%→55% A；16～19 min，55%→35% A；19～22 min，35%→15% A；22～26min，15%→0% A；26～32 min，0% A；32～35 min，0%→98% A；35～40 min，98% A。柱溫30 ℃；流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件

定量質(zhì)譜分析采用ESI負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，檢測(cè)模式為多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。離子化參數(shù)為離子噴霧電壓，負(fù)離子模式-4 500 V；霧化氣和輔助氣為氮?dú)?；離子源溫度550 ℃，輔助氣GS1，GS2溫度為60 ℃，氣簾氣溫度35 ℃，離子掃描范圍：100～1 000 Da，掃描速率：200 Da/s，化合物離子對(duì)，優(yōu)化后的采集參數(shù)：去簇電壓(declustering potential，DP)、碎裂能量(collision energy，CE)和碰撞池出口電壓(cell exit potential，CXP)等信息見表2，標(biāo)準(zhǔn)化合物、樣品、甲醇空白MRM提取離子流譜圖見圖2。

表2 青熟酸棗果肉中10種黃酮類、氨基酸、萜類化合物多反應(yīng)檢測(cè)參數(shù)

圖2 青熟酸棗果肉空白、樣品及10種對(duì)照品負(fù)離子模式MRM提取離子圖

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS 26.0用于統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有的圖表都是用GraphPad Prism 8繪制的，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

2 結(jié)果

2.1 成分表征

青、熟酸棗果肉化學(xué)成分表征IDA二級(jí)質(zhì)譜總離子流圖見圖3。通過Peakview 2.2查看采集數(shù)據(jù)，以AB SCIEX master view 1.1.0.0中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(TCM library 1.0)作為青酸棗果肉和熟酸棗果肉的成分匹配庫。通過比對(duì)精確質(zhì)量數(shù)、同位素峰度比以及碎片離子裂解規(guī)律等信息，初步鑒定出青酸棗果肉和熟酸棗果肉中共有的32個(gè)化學(xué)成分，其中對(duì)10個(gè)重要成分進(jìn)行分析(見表3)。

圖3 青、熟酸棗果肉化學(xué)成分表征IDA二級(jí)質(zhì)譜總離子流圖

表3 青、熟酸棗果肉中10個(gè)重要共有確定的成分

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.2 酸棗果肉差異性成分聚類分析及PCA

2.2.1 聚類分析

為了初步說明樣品與樣品間是否存在一定關(guān)系，本研究選用Cluster Analysis聚類分析進(jìn)行建模分析。首先對(duì)青、熟酸棗果肉樣品進(jìn)行色譜分析，再將處理后的峰面積導(dǎo)入MetaboAnalyst分析平臺(tái)(https://www.metaboanalyst.ca/)，最后采用Cluster Analysis聚類分析方法，對(duì)各批數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，得到樹狀圖結(jié)果見圖4A。結(jié)果表明，青、熟酸棗果肉樣品主要分為2類，青酸棗果肉樣品歸為一類、熟酸棗果肉樣品聚為一類。說明青酸棗果肉和熟酸棗果肉的樣品在成分上存在一定的差異。

圖4 青、熟酸棗果肉聚類與PCA、KEGG結(jié)果

2.2.2 PCA

為了更直觀地評(píng)價(jià)模型對(duì)樣品的分類能力，對(duì)各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，通過MetaboAnalyst分析平臺(tái)，采用PCA方法觀察樣品差異情況。本研究對(duì)青、熟酸棗果肉樣品進(jìn)行成分鑒定與色譜分析，將測(cè)定后的青酸棗、熟酸棗相同的成分的峰面積進(jìn)行處理，將處理并分組后的數(shù)據(jù)進(jìn)行采用PCA主成分分析，對(duì)各批數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

結(jié)果得到2個(gè)最大特征值的主成分1和主成分2。主成分1第一主成分的貢獻(xiàn)率為88.7%，包含差異信息最多，模型擬合能力較好。選取此2個(gè)主成分進(jìn)行模型預(yù)測(cè)能夠反映不同成熟度樣品的基本特征。以此2個(gè)主成分建立投影，得到散點(diǎn)圖(見圖4B)。由圖可以看出所有青酸棗果肉樣品聚在一起，所有熟酸棗果肉樣品聚在一起，這一結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。說明青、熟酸棗果肉在成分上有明顯的差異。通過MetaboAnalyst分析平臺(tái)將處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(P<0.05)與差異代謝物KEGG通路富集分析，t檢驗(yàn)得到48個(gè)差異代謝物(見圖4C、表4)，差異代謝物KEGG通路富集分析得到14條代謝途徑(見圖4D)。結(jié)果得到2個(gè)重要的差異代謝物L(fēng)-苯丙氨酸與L-酪氨酸與3個(gè)重要代謝途徑：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成代謝、苯丙氨酸代謝與酪氨酸代謝。

表4 青熟酸棗果肉中48個(gè)差異代謝物

續(xù)表4(Continued Tab.4)

2.3 差異代謝物定量方法學(xué)考察

根據(jù)PCA分析中得到的差異代謝物信息，對(duì)已鑒定得到的重要差異初生代謝物及其次生代謝物進(jìn)行定量方法學(xué)考察。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)

精密吸取“1.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制為不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化的液質(zhì)條件進(jìn)行測(cè)定。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按梯度體積稀釋，精密吸取9個(gè)稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物濃度(μg/mL)橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各成分的回歸方程和線性范圍。酸棗果肉中10個(gè)不同化合物的線性范圍為0.002 3～800.00 μg/mL，且相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明各對(duì)照品線性關(guān)系良好。各種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及方法定量限、檢測(cè)限見表5。

表5 10種黃酮類、氨基酸、萜類化合物同時(shí)測(cè)定方法線性方程、線性范圍、定量限和檢測(cè)限結(jié)果

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一酸棗果肉的供試品溶液，按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得兒茶素、表兒茶素、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、酸棗仁皂苷B、齊墩果酸、熊果酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸各色譜峰的峰面積，計(jì)算酸棗果肉中10種化合物峰面積的RSD在1.92%～6.18%之間，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一酸棗果肉的供試品溶液，按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、2、4、6、10、14、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)得兒茶素、表兒茶素、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、酸棗仁皂苷B、齊墩果酸、熊果酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸各色譜峰面積，計(jì)算酸棗果肉中10種化合物峰面積的RSD在1.15%～6.45%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一酸棗果肉藥材粉末5份，按“1.4.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液5份，按“1.6.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，測(cè)得兒茶素、表兒茶素、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、酸棗仁皂苷B、齊墩果酸、熊果酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸各色譜峰面積，計(jì)算酸棗果肉中10種化合物峰面積的RSD在1.48%～3.04%之間，表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量同一酸棗果肉的供試品溶液各0.5 mL，分別精密加入與酸棗果肉樣品含量等同量的混合對(duì)照品(兒茶素、表兒茶素、槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、酸棗仁皂苷B、齊墩果酸、熊果酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸)，在“1.6.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。各成分含量、加入量以及最后得到的平均回收率和RSD的結(jié)果均見表6。

表6 10種黃酮類、氨基酸、萜類化合物同時(shí)測(cè)定加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 差異成分含量測(cè)定

為了更準(zhǔn)確地應(yīng)用定性數(shù)據(jù)，針對(duì)PCA分析中得到的差異代謝物信息，將已鑒定得到的差異初生代謝物及其次生代謝物進(jìn)行定量分析，以精確研究青酸棗果肉與熟酸棗果肉成分的差異性，按“1.6.1”項(xiàng)下的色譜條件和“1.6.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定量分析(見表2)，結(jié)果見圖5。

含量測(cè)定結(jié)果得到青、熟酸棗果肉中差異初生代謝物及其次生代謝物(黃酮類化合物)的含量有較大差異(P<0.01)，三萜類成分熊果酸有差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，酸棗仁皂苷B及齊墩果酸的含量有差異(P<0.05)(見圖5)，此結(jié)果與PCA分析結(jié)果一致。

圖5 青、熟酸棗果肉中10種黃酮類、氨基酸、萜類化合物含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 酸棗中黃酮類成分的生物合成途徑分析及驗(yàn)證

根據(jù)“2.1”成分表征得到5個(gè)黃酮類成分，分別為蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、兒茶素、表兒茶素。黃酮類成分的合成主要以L-苯丙氨酸和L-酪氨酸為前體物質(zhì)通過不同的分支合成途徑合成黃酮類成分[17](見圖6)，通過對(duì)青酸棗果肉和熟酸棗果肉的代謝產(chǎn)物分析，得到兩個(gè)果肉中的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的含量有區(qū)別，熟酸棗果肉中的兩種代謝物的含量大于青酸棗果肉，通過含量測(cè)定得到熟酸棗果肉中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量要大于青酸棗果肉中的含量，也進(jìn)一步地驗(yàn)證了在酸棗果肉中，由青酸棗到熟酸棗變熟過程中黃酮類成分有明顯的變化。

圖6 黃酮類化合物合成途

但兒茶素和表兒茶素的含量在熟酸棗果肉中含量均降低，主要是因?yàn)閮翰杷睾捅韮翰杷刂饕植荚诠麑?shí)的果皮中，表兒茶素具有較強(qiáng)的澀味，兒茶素既具有澀味又具有苦味，是引起果實(shí)澀感的主要物質(zhì)[18,19]，因此在果實(shí)未成熟時(shí)含有較多的兒茶素和表兒茶素，在果實(shí)成熟的過程中兒茶素和表兒茶素的含量在逐漸降低，在果實(shí)完全成熟時(shí)含量最低，所以在青酸棗到熟酸棗的變化過程中兒茶素與表兒茶素的含量與其他黃酮類的含量呈相反變化。由于兒茶素與表兒茶素決定果實(shí)的苦澀味，說明其可為酸棗果肉在食用方面提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 酸棗中萜類成分分析及驗(yàn)證

根據(jù)“2.1”成分表征得到4個(gè)三萜類成分，分別為酸棗仁皂苷B、熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸，通過含量測(cè)定得到熟酸棗果肉中熊果酸和齊墩果酸的含量要小于青酸棗果肉中的含量，出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是這兩種代謝物有助于植物防御，如三萜類成分有抗真菌特性并能抗毒素產(chǎn)生[20]，因此決定了這兩種代謝物在青果中的含量要高于熟果。

4 結(jié)論

綜上所述，果實(shí)類的風(fēng)味變化是由兒茶素和表兒茶素的含量高低決定的，在酸棗成熟過程中兒茶素與表兒茶素呈逐漸下降的趨勢(shì)，但其他黃酮類成分又呈現(xiàn)整體上升趨勢(shì)，說明熟酸棗鎮(zhèn)靜催眠的作用可能強(qiáng)于青酸棗；而三萜類成分齊墩果酸和熊果酸在青酸棗果肉中的含量高于熟酸棗果肉，說明青酸棗中某些三萜類成分藥理活性可能強(qiáng)于熟酸棗。以上研究方法和結(jié)果可以為不同成熟度酸棗果肉的成分分析、質(zhì)量評(píng)價(jià)和采收期方面的研究提供技術(shù)支持和科學(xué)依據(jù)。