中藥中寡糖分離分析方法研究進(jìn)展

劉妍妍，劉建飛，邢連喜，邸多隆*

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；3西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069；4陜西功能食品工程中心有限公司，西安710000

隨著2012年糖科學(xué)領(lǐng)域路線圖[1]的繪制，該領(lǐng)域已經(jīng)成為生命科學(xué)的前沿。越來越多的科學(xué)家認(rèn)識(shí)到多糖作為生命過程中不可或缺的信息和功能分子，在細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育過程中擔(dān)任著關(guān)鍵角色。美國功能性糖組學(xué)國際聯(lián)合會(huì)(Consortion of Function Glycomics，CFG)向美國國立衛(wèi)生研究院匯報(bào)其研究成果時(shí)指出，動(dòng)物、植物和微生物中糖鏈結(jié)構(gòu)與功能研究是未來糖生物學(xué)研究的重要方向，必將為人類疾病的研究和治療帶來新的希望。2018年由中國海洋大學(xué)、中國科學(xué)院上海藥物研究所和上海綠谷制藥聯(lián)合研發(fā)的治療阿爾茨海默癥新藥“甘露寡糖二酸(GV-971)”以其新穎的作用模式與獨(dú)特的多靶點(diǎn)作用特征，為阿爾茨海默癥藥物研發(fā)開辟了新路徑，并有望引領(lǐng)糖類藥物研發(fā)新的浪潮[1]。GV-971的成功研發(fā)使人們更加清晰地認(rèn)識(shí)到糖類正在改變?nèi)祟悓?duì)生命現(xiàn)象和疾病的認(rèn)識(shí)。糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜功能多樣，契合復(fù)雜疾病治療的標(biāo)準(zhǔn)需求，糖類藥物有望引領(lǐng)治療復(fù)雜疾病的創(chuàng)新前沿[2]。寡糖也是糖類研究的一個(gè)重要組成部分，寡糖是2～10個(gè)相同或不同的單糖通過糖苷鍵連接形成直鏈或支鏈的一類碳水化合物，構(gòu)成單元主要為五碳或六碳糖，以葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)和甘露糖(mannose)等最為常見?，F(xiàn)代研究表明：寡糖具有降血糖[3,4]、抗創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙[5]、抗腫瘤[6,7]、抗菌[8]、免疫增強(qiáng)[9-11]、調(diào)節(jié)腸道菌群[12]、抗抑郁[13]、增強(qiáng)造血功能[14]、抗病毒[15]等多種藥理、生理活性。從中藥資源種類多樣性和其潛在的藥理活性而言，中藥寡糖的研究具有重大意義和發(fā)展前景。該篇內(nèi)容綜述了中藥寡糖在提取純化、分離分析、結(jié)構(gòu)鑒定三個(gè)方面的研究進(jìn)展，以期為寡糖的現(xiàn)代藥物研究和臨床應(yīng)用以及功效產(chǎn)品創(chuàng)制提供科學(xué)參考。

1 中藥寡糖提取方法研究進(jìn)展

寡糖多為水溶性糖，通常采用水提法、水提醇沉法、回流提取法、超聲提取法、微波提取法、酶解法或多種方法聯(lián)用的方式來提取。巴戟天低聚糖是一種較為常見的中藥寡糖，一般采用水提法進(jìn)行提取，但由于中藥提取液中除含有低聚糖外，還含有部分多糖及蛋白質(zhì)，因此采用水提法需要加入乙醇沉淀多糖；另一種提取方法為回流提取法，利用寡糖易溶于乙醇而多糖、可溶性蛋白質(zhì)不溶于乙醇的性質(zhì)，采用乙醇為提取溶劑可得到純度更高的寡糖并簡化操作步驟；采用乙醇提取的另一原因是巴戟天低聚糖在水中不穩(wěn)定，在不同pH水溶液中提取變化差異較大，低聚糖會(huì)被水解或者產(chǎn)生較多新的未知成分，而低聚糖在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%或以上時(shí)的溶媒中較為穩(wěn)定[16]，因此40%乙醇經(jīng)常被用作巴戟天寡糖的提取溶劑。

Zhou等[17]以95%乙醇為提取溶劑對(duì)桂花寡糖進(jìn)行提取，在最優(yōu)條件下，桂花寡糖的提取率為90.29%。該方法操作簡便、精密度高，且桂花寡糖的收率穩(wěn)定。Ma等[18]用水提醇沉法制得4個(gè)不同產(chǎn)地的粗黨參低聚糖，經(jīng)Sephadex G-25純化得到精制的黨參低聚糖，其中山西產(chǎn)黨參提取率為34%、甘肅產(chǎn)黨參1號(hào)和素花黨參為16%，四川產(chǎn)黨參為13%。Liu等[19]使用超聲波輔助提取山藥低聚糖，得率提高了3.91%。Norazlina等[20]采用微波輔助法從檸檬草葉片中提取木糖，提取率可達(dá)到2.91 g/L。Guo等[21]采用超聲-微波輔助提取法優(yōu)化了蓮子低聚糖的提取工藝，蓮子低聚糖提取10 min時(shí)，最高得率可達(dá)10.53%，而用熱水浸提法提取蓮子低聚糖時(shí)間為66 min，得率僅為8.09%[22]；Deng等[23]通過酶解來提高瓊膠寡糖水解度，得到新瓊四糖和少量新瓊二糖，還原糖含量為4.652 mg/mL，這說明酶解反應(yīng)不僅可以得到某一特定聚合度的寡糖，還可通過控制酶解程度，同時(shí)得到多個(gè)聚合度的寡糖，該工作為功能性瓊膠寡糖的酶解制備和應(yīng)用提供科學(xué)參考。Zhao等[24]探索了酶法和超聲提取法聯(lián)用提取靈芝寡糖的最佳工藝，先探索了最佳酶解條件，然后利用超聲處理酶解后的樣液，優(yōu)化超聲條件，在最佳優(yōu)化條件下靈芝寡糖最高得率為61.64%，比原料液中提高了1.76%，因此就寡糖產(chǎn)量而言，該方法可以作為寡糖提取的一種有效方案。與巴戟天寡糖相同，石莼可溶性糖粗提液中也夾雜許多的多糖及可溶性蛋白質(zhì)，Li[25]采用超聲輔助酶法先對(duì)寡糖進(jìn)行提取，對(duì)提取液進(jìn)行濃縮后采用醇沉法去除多糖和蛋白質(zhì)，得到石莼功能性寡糖，提取率為2.38%。

以上內(nèi)容表明，寡糖的提取正在從傳統(tǒng)的高料液比、長時(shí)間、操作復(fù)雜及低效率向低料液比、短時(shí)間、操作簡單及多種提取方法的聯(lián)用進(jìn)行轉(zhuǎn)變，與傳統(tǒng)方法相比，寡糖的提取效率、提取純度也有明顯提高。寡糖提取方法比較見表1。

表1 寡糖提取方法比較

2 中藥寡糖分離方法研究進(jìn)展

寡糖的分離方法主要有膜分離法、液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。寡糖分離方法總結(jié)見表2。

表2 寡糖分離方法總結(jié)

2.1 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)是利用機(jī)械篩分的原理選擇性從溶液中分離目標(biāo)物質(zhì)的方法，具有不損害樣品生物活性、分離效率高、能耗低、無污染等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中藥寡糖的分離。Zhao等[26]采用納濾膜NF-3A、NF-2A構(gòu)建了恒容滲濾方法分離純化大豆低聚糖發(fā)酵液，收率可達(dá)83.2%，純度可達(dá)77.9%。Cai等[27]采用微濾、超濾、納濾膜建立了整合集成膜分離系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)從猴頭菌中分離得到粗寡糖，含量為14.84%，純度為63.71%。Nabarlatz等[28]采用商業(yè)薄膜聚合超濾膜純化杏仁殼水解得到的低聚木糖，占回收非揮發(fā)性產(chǎn)物的58.3%。用膜過濾技術(shù)分離寡糖時(shí)，要根據(jù)目標(biāo)分離物的分子大小選擇適宜孔徑的濾膜，孔徑大的微濾只是簡單的粗過濾，過濾精度較低；超濾法一般被用來除蛋白質(zhì)或其他大分子物質(zhì)，而納濾膜可除去一些小分子糖類。膜分離法分離寡糖收率較高，而且可獲得純度較高的寡糖，但該方法不適合分離分子量相近的寡糖。同時(shí)，該技術(shù)對(duì)設(shè)備要求和膜的要求較高，操作復(fù)雜，還受到壓力、溫度、時(shí)間等多種因素的影響。

2.2 液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)

液相色譜法是寡糖分離分析應(yīng)用最廣泛的方法，根據(jù)所選色譜柱的不同可具體劃分為凝膠排阻色譜法、親水作用色譜法、陰離子交換色譜法、石墨化碳柱色譜法、反相高效液相色譜法等。

2.2.1 凝膠色譜法(gel chromatography，GFC)

凝膠色譜法是根據(jù)被分離化合物的分子大小不同實(shí)現(xiàn)分離，分子量小的可以進(jìn)入材料的孔隙，因此保留時(shí)間較長，最后被洗脫出來；而分子量大的化合物則與之恰好相反。凝膠色譜法按照流動(dòng)相的不同又分為凝膠過濾色譜法(gel filtration chromatography，GFC)和凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography，GPC)。寡糖分離最常用的色譜填料有葡聚糖凝膠G(Sephadex G)、羥丙基葡聚糖凝膠LH-20(Sephadex LH-20)和聚丙烯酰胺凝膠(Bio gel P)。Pan等[29]將采用聚丙烯酰胺凝膠柱從黃精寡糖同系物中分離得到了具有抗病毒作用的聚合度單一的呋喃型直鏈黃精四糖，提示聚丙烯酰胺凝膠Bio Gel P2可以有效分離聚合度1～5的寡糖，并且添加碳酸氫銨可以減少填料的特異性吸附，改善分離性能。Wei等[30]依次采用大孔吸附樹脂柱層析、活性炭柱層析和Sephadex LH-20凝膠柱層析法從黃精低聚糖浸膏部位分離得到純度92.6%，平均相對(duì)分子質(zhì)量為1 471 Da的均一性寡糖。經(jīng)鑒定該寡糖為單一葡萄糖組成的D-吡喃葡聚糖，分子中葡萄糖主要通過1→3和1→4苷鍵連接，構(gòu)型多為β-糖苷鍵，也存在少量α-糖苷鍵。Jiang等[31]對(duì)猴頭菌醇沉部位采用Sephadex G-25凝膠色譜純化，得到了寡糖Hep-1-3，經(jīng)檢測其含量為91%，該方法分離效果顯著，但分離時(shí)間長，洗脫劑消耗量大。Hao等[32]采用Sephadex G-50凝膠柱層析分離純化，獲得了水溶性的牛蒡寡糖BOS-2，該寡糖含量為98%，分子量為2 134 Da，是一種由葡萄糖和果糖1∶12組成，聚合度為13的菊糖構(gòu)型的低聚果糖。凝膠色譜法是分離純化寡糖最常用的方法，寡糖經(jīng)過離子交換柱、大孔樹脂或者活性炭層析柱進(jìn)行粗分后，采用適宜的凝膠材料對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化，均可得到純度更高的均一性寡糖，而且凝膠柱色譜可根據(jù)分子量大小選擇適宜的凝膠填料，洗脫液一般為水，操作簡單。但該色譜材料容易被污染，而且隨著分離時(shí)間增加，流速也會(huì)減慢。

2.2.2 親水作用色譜法(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)

在組成糖鏈的單糖結(jié)構(gòu)中有大量的羥基存在，這使得糖鏈具有較強(qiáng)的親水性。由此研究者們發(fā)明了一種以材料表面官能團(tuán)與糖鏈之間的親水作用為基礎(chǔ)的親水作用色譜法(HILIC)。其中，分離糖類的固定相一般包括化學(xué)鍵合的二醇基、氨基、糖基、環(huán)糊精、聚乙二醇、嵌入酰胺或者氨基甲酸酯的烷基，以及聚合物鍵合相，如聚琥珀酰亞胺型PolyHydroxyethyl A、PolyCAT A 和PolySulfoethyl A，聚磷酸膽堿型KS-polyMPC等[33-35]。Zhai等[36]開發(fā)了一種新型3-氨基苯硼酸功能化二氧化硅固定相，該材料對(duì)極性化合物保留率高、選擇性高且具有質(zhì)譜相容性。同時(shí)，硼酸與順式二羥基產(chǎn)生可逆性吸附和解析，因此可特異性分離含有順式二羥基的糖類化合物。用于親水作用液相色譜時(shí)，新型3-氨基苯硼酸功能化二氧化硅固定相在分離殼寡糖方面表現(xiàn)出很好的HILIC特性，其分配和吸附雙模式組合機(jī)制，為糖類的分離分析提供了新的思路[37]。Yang[38]采用高效液相色譜法對(duì)比了巴戟天根頭、根中、根尖這3個(gè)部位寡糖的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)10株巴戟天相同部位中耐斯糖平均含量分別為45.76、59.31、65.04 mg/g。Liang[39]采用固相萃取(stationary phase extraction，SPE)下的HILIC模式對(duì)澤蘭提取物進(jìn)行分離，采用Click TE-Cys(100 mm×4.6 mm.id)色譜柱，分離出了蔗糖、棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖和筋骨草糖。該方法使得低豐度的寡糖得到了有效富集，大幅度降低了洗脫餾分的復(fù)雜程度，還可除去單糖、蔗糖及其他非寡糖類化合物，在上樣后可直接采用70%乙腈洗脫以達(dá)到純化寡糖的目的。

Yuan等[40]利用低共熔溶劑作為硅烷化和自由基鏈轉(zhuǎn)移聚合反應(yīng)介質(zhì)，可控制備了一種葡萄糖量子點(diǎn)鍵合硅膠親水色譜固定相，該固定相對(duì)糖基化合物等極性分析物具有較好的保留能力和分離選擇性，并成功用于枸杞樣品中果糖和葡萄糖含量測定，結(jié)果顯示果糖濃度為3.4 mg/mL，葡萄糖濃度為2.2 mg/mL。碳量子點(diǎn)修飾的液相色譜固定相以其獨(dú)特的優(yōu)勢為糖類的分離提供了一個(gè)更優(yōu)選擇。Yang等[41]制備了一種基于巰基-烯烴點(diǎn)擊化學(xué)的聚丙烯酰胺型親水作用色譜，成功將β-1,4-低聚半乳糖分離為DP 2～7的6個(gè)峰，分離度高，峰形良好。這一研究結(jié)構(gòu)表明TE-UPAM固定相可以被很好地應(yīng)用到極性化合物的分離當(dāng)中。Fu等[42]發(fā)現(xiàn)中性糖類化合物在麥芽糖色譜柱上的具有典型的HILIC特點(diǎn)，同時(shí)采用頂替吸附-液相相互作用模型對(duì)糖類化合物的保留行為進(jìn)行定量描述，并將保留公式，通過優(yōu)化梯度的半制備HILIC進(jìn)一步純化了地黃洗脫液，得到了15個(gè)以上的峰，通過重復(fù)進(jìn)樣獲得了毫克級(jí)化合物。Jiang等[43]考察了松三糖、棉子糖在兩性離子親水作用色譜柱Click TE-Cys上的色譜保留行為，在流動(dòng)相為70%乙腈時(shí)，單糖、二糖、三糖按照極性由小到大依次被洗脫。這說明糖類化合物的極性越大，保留時(shí)間則越長。這可能是由于HILIC流動(dòng)相中水相比例的降低，緩沖鹽轉(zhuǎn)移到了水相中，增加了其極性和厚度，使得溶質(zhì)在水相中的分配系數(shù)增大，因此保留時(shí)間延長[44,45]。作者結(jié)合該數(shù)據(jù)建立了糖在Click TE-Cys色譜柱上的保留行為回歸方程，該結(jié)果有助于親水作用色譜材料的系統(tǒng)評(píng)價(jià)和評(píng)價(jià)方法的建立。Wang等[46]利用物理涂敷的方法將親水聚合物以凝膠方式層層組裝于硅膠表面，成功制備了一種親水性色譜新材料。色譜性能評(píng)價(jià)表明:該材料表現(xiàn)出典型的親水色譜分離機(jī)理，親水分離范圍很寬(乙腈體積75%～95%)，其最高柱效能達(dá)到168 133 塔板/米?？疾炝嗽摴潭ㄏ鄬?duì)10種糖標(biāo)準(zhǔn)品(D-核糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、肉蓯蓉糖和果糖)的分離效果，發(fā)現(xiàn)10種糖按照極性在3層PAM-Sil固定相中完全分離。此外，對(duì)果糖和葡萄糖等異構(gòu)體也可分離；由此說明PAM-Sil固定相對(duì)于大極性化合物具有更好的分離選擇性。Fu等[47]采用二乙烯基砜活化化學(xué)方法制備了以谷胱甘肽為親水性基團(tuán)的硅基HILIC材料(命名為SiO2-DVS-GSH)。在HILIC模式下，用寡糖對(duì)新材料的分離性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以低聚果糖為研究對(duì)象，色譜分析結(jié)果表明低聚果糖的聚合度(DP)在2～26之間，分離良好，峰形良好。由于HILIC模式的主要保留機(jī)制是分析物在流動(dòng)相和HILIC固定相上的“富水層”之間的分配相互作用[48]，隨著DP的增加，分析物與SiO2-DVS-GSH表面“富水層”之間的相互作用增強(qiáng)；因此，可以對(duì)DP較高的低聚果糖進(jìn)行洗脫。

賓陽縣大陸村以古辣香米產(chǎn)業(yè)特色與美麗宜居鄉(xiāng)村建設(shè)相結(jié)合，以成熟的產(chǎn)業(yè)鏈和標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)村互動(dòng)，農(nóng)旅結(jié)合，把大陸村打造成“稻花鄉(xiāng)里”示范村。農(nóng)旅融合是未來鄉(xiāng)村旅游發(fā)展的方向，是農(nóng)民增收的一個(gè)重大支撐點(diǎn)。2016年啟動(dòng)了廣西賓陽萬頃香米產(chǎn)業(yè)示范區(qū)項(xiàng)目，該項(xiàng)目是自治區(qū)政府扶持賓陽縣重點(diǎn)打造的15萬畝涉優(yōu)質(zhì)香米種植示范區(qū)，并計(jì)劃在3到5年內(nèi)建設(shè)成為自治區(qū)級(jí)水稻種植產(chǎn)業(yè)示范區(qū)和自治區(qū)級(jí)休閑農(nóng)業(yè)和鄉(xiāng)村旅游示范區(qū)，同時(shí)該項(xiàng)目也是目前賓陽縣最大的規(guī)劃農(nóng)業(yè)與旅游融合、統(tǒng)籌城鄉(xiāng)發(fā)展的項(xiàng)目。

HILIC是以極性固定相和水溶性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相對(duì)極性化合物(如糖類)進(jìn)行分離的一種方法，具有正相色譜和反相色譜完全不同的分離特性。HILIC的固定相上鍵合的基團(tuán)不同，其保留機(jī)制也會(huì)有所不同。隨著固定相種類的增多，HILIC也得到了快速發(fā)展，在極性化合物的分離中應(yīng)用廣泛并具有顯著的優(yōu)勢，比如可以分離含有復(fù)雜糖鏈的糖類化合物，在分離聚合度較高的寡糖時(shí)也具有很高的分辨率。根據(jù)以上內(nèi)容我們不難看出，親水色譜材料種類豐富，在糖類化合物的分離分析中存在很大的潛力，可以為寡糖的分離提供更多、更優(yōu)的選擇。

2.2.3 離子交換色譜法(ion-exchange chromatography，IEC)

離子交換色譜法是以離子交換劑為固定相、利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相色譜分離技術(shù)。離子交換色譜固定相上的離子基團(tuán)可與待分離組分的某種基團(tuán)結(jié)合，當(dāng)用流動(dòng)相洗脫時(shí)，寡糖按照結(jié)合能力從小到大的順序依次被洗脫下來，而達(dá)到分離的目的。離子交換色譜法具有樣品用量少、分離效率高、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，適用于在高pH的流動(dòng)相下，分離酸性寡糖，但是其定性能力差，可與其他色譜法聯(lián)用提高分離純化效果。高效離子交換色譜-脈沖安培檢測法(high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)，固定相一般為離子交換樹脂，通常與脈沖安培檢測器(pulsed amperometric detection，PAD)聯(lián)用，待測組分生成的離子隨著流動(dòng)相通過離子交換樹脂，與樹脂中可交換的離子基團(tuán)發(fā)生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動(dòng)相與固定相之間形成分配來實(shí)現(xiàn)分離。

Qiu等[49]采用陽離子樹脂-陰離子樹脂-活性炭聯(lián)用的方法，以10%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分離得到水蘇糖，該方法的研究有效地解決了從地黃中直接分離制備單體難度大、制備繁瑣、單體純度低等問題，得到了純度較高的四糖(水蘇糖)單體，該實(shí)驗(yàn)為制備地黃寡糖中各個(gè)單體提供了一定的研究基礎(chǔ)。Ballance等[50]選用半制備離子型Pac-AS4A柱分離酸水解得到的褐藻膠寡糖，得到聚合度為5的寡糖，寡糖的純度為96%。Li等[51]采用Pharmacia柱分離酶解法制備的褐藻膠寡糖，得到包括二糖和三糖的6種寡糖。Peng等[52]采用TSK-GEL-DEAE-2SW柱分離褐藻膠寡糖混合物，分離得到12個(gè)褐藻膠寡糖組分，各組分的純度均高于97%。Hu等[53]采用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析對(duì)木耳寡糖進(jìn)行分離純化，該色譜柱主要功能是脫蛋白作用，其脫蛋白率可以達(dá)到96%，是一種理想的分離純化方法。

Ma等[54]采用HPAEC-PAD對(duì)巴戟天中的蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖進(jìn)行了檢測，這4種寡糖分離度良好。該實(shí)驗(yàn)中采用了Hamilton RCX-10色譜柱(4.1 mm×250 mm，7 μm)，填料為PS-DVB/三甲基銨交換樹脂，交換容量可達(dá)到0.35 meq/mg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于PRP-X100，可用于等度和梯度洗脫碳水化合物；對(duì)聚合度小于3的碳水化合物可以快速實(shí)現(xiàn)等度分離；基于堿性條件下不同糖類化合物會(huì)帶不同的電荷，針對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的濃度來分離各種糖類化合物。Alyassin等[55]使用CarboPac PA200色譜柱對(duì)16種濃度均為20 mg/mL糖的標(biāo)準(zhǔn)品混合物進(jìn)行了分析，采用NaOH和CH3COONa水溶液梯度洗脫的HPAEC-PAD方法，可以在CarboPac PA200柱上同時(shí)分離16種標(biāo)準(zhǔn)的單糖、低聚木糖、阿拉伯低聚糖和糖醛酸，發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫可實(shí)現(xiàn)較高的分離度。CarboPac PA200為陰離子交換柱，無需衍生，可實(shí)現(xiàn)快速、重復(fù)分離；填充材料為疏水性聚合物薄殼型陰離子交換樹脂，在pH 0～14范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，同時(shí)，堿性水溶液的線性梯度洗脫不僅提高了寡糖色譜柱的分離性，而且提高了分離度，且這種洗脫液有利于糖類在金電極上的陽極氧化，在較長時(shí)間下仍可有效分離低聚糖。Chen等[56]采用HPAEC-PAD對(duì)DP為2～6的5種殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分離和檢測，建立殼寡糖的保留因子與聚合度的關(guān)系，根據(jù)建立的相關(guān)關(guān)系對(duì)未知的殼寡糖進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明，殼寡糖聚合度的對(duì)數(shù)值與其保留因子的對(duì)數(shù)值具有線性關(guān)系，利用線性回歸方程對(duì)鑒定出樣品中的4種未知?dú)す烟欠謩e為殼七糖、殼八糖、殼九糖和殼十糖,且測量誤差≤5.66%。

2.2.4 石墨化碳色譜法(graphitized carbon chromatography，GCC)

石墨化碳液相色譜是一種常用于分離寡糖和糖結(jié)合物的分離方法，石墨化碳材料對(duì)寡糖具有良好的保留和分離選擇性,尤其適用于寡糖異構(gòu)體的分離，并且石墨化碳柱容量大，適合寡糖的制備性分離[57]。與糖類HPLC分析中常用的正相、反相和陰離子交換柱的分離原理不同，GCC的保留機(jī)制為填充劑和樣品疏水相，電子供、受體之間的相互作用；分離機(jī)制與化合物分子空間結(jié)構(gòu)和分子極性密切相關(guān)，化合物分子與石墨化碳結(jié)合越緊密，在色譜柱上的保留越強(qiáng)。Harrison等[58]通過聯(lián)用GCC和線性離子阱質(zhì)譜，將13C標(biāo)記的蔗糖和蔗果三糖作為底物，通過2種酶催化合成果聚糖，結(jié)合其二級(jí)與三級(jí)質(zhì)譜的碎裂模式，建立了分離和鑒定果聚糖異構(gòu)體的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MSn)方法。Fu等[59]為了降低樣品的復(fù)雜性，增加低聚糖含量，對(duì)地黃粗提物進(jìn)行了石墨化碳固相萃取處理。先用5%、10%、15%的乙腈處理石墨化碳，再用50%的乙腈(含0.1%甲酸)洗脫，由于單糖不保留在石墨化碳柱上，因此用水即可去除粗提樣品中的單糖和大部分非寡糖類化合物，使高純度地黃寡糖得到有效富集。

2.2.5 反相液相色譜法(reversed-phase liquid chromatography，RPLC)

2.2.6 快速蛋白質(zhì)液相色譜-示差折光檢測法(fast protein liquid chromatography-refractive index detection，F(xiàn)PLC-RID)

FPLC-RID自動(dòng)化程度高、分離效率高、無需化學(xué)試劑即可監(jiān)測碳水化合物的分離，相比傳統(tǒng)的FPLC，可用來檢測沒有紫外吸收的化合物，該方法擴(kuò)大了糖類化合物的檢測范圍。Zong等[62]使用FPLC在0.2、0.3、0.4、0.5 mL這4個(gè)流速下對(duì)聚合度3～5的寡糖進(jìn)行了純化，在最佳分離條件下，DP 3～5的低聚糖得率分別為1.72、7.52、0.51%。該方法可快速、高效、自動(dòng)地為地黃及其制品中寡糖RFOs的定性、定量分析提供依據(jù)。

2.3 毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)

毛細(xì)管電泳法是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的分離技術(shù)，具備快速、高效、高靈敏度、分離效率高、樣品與溶劑消耗量少等優(yōu)勢，在糖類分析中得到較好的應(yīng)用。毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis，CZE)是CE最簡便，應(yīng)用最廣泛的分離模式，但是該模式只適合于分離硫酸化、乙酰化和磷酸化等點(diǎn)電荷的糖類。對(duì)于中性寡糖，由于其不帶電荷，無熒光基團(tuán)或發(fā)色基團(tuán)，CE分離分析這些寡糖時(shí)常需衍生化或形成絡(luò)合物使之帶上熒光基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或電荷。

Guo等[63]采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)對(duì)板藍(lán)根多糖進(jìn)行衍生化，通過HPCE分離分析，結(jié)果表明電泳作用可以使板藍(lán)根寡糖組分按照分子量大小進(jìn)行分離。該技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)很好地分離低聚糖，操作簡單高效；樣品制備采用熒光發(fā)色團(tuán)標(biāo)記低聚糖，以此來排除非還原糖[64]。對(duì)于不帶電荷的糖類除了上述方法以外，也可以使用含硼酸根的化合物與糖絡(luò)合帶電或者使其在強(qiáng)堿條件下電離。糖的羥基具有酸性，可在強(qiáng)堿條件下解離，其中，還原糖半縮醛上的羥基酸性最強(qiáng)，相對(duì)其他位置的羥基更容易解離。Yang和Guo等[65,66]對(duì)比在酸性與堿性緩沖液條件下北沙參和南沙參水解的寡糖片段的分離效果，結(jié)果表明，在酸性條件下，結(jié)構(gòu)相似的寡糖分離度較低，而堿性條件可促進(jìn)糖與硼酸根絡(luò)合，結(jié)構(gòu)相似的寡糖能被更有效地分離，最終所得圖譜更具特征性，且堿性環(huán)境下電滲流增加，縮短了分析檢測時(shí)間。pH升高可增加電泳分離度，但強(qiáng)堿條件下糖會(huì)發(fā)生差向異構(gòu)化和降解反應(yīng)[67]，會(huì)導(dǎo)致基線漂移和峰形變差[68]，因此要控制pH在合理范圍內(nèi)。由于糖在堿性條件下帶負(fù)電，采用CE進(jìn)行陰離子分析時(shí)，也可以加入陽離子表面活性劑作為電滲流改性劑，用來改變電滲流的方向并提高樣品的分離度。

3 中藥寡糖結(jié)構(gòu)分析方法研究進(jìn)展

3.1 紫外光譜法(ultraviolet spectroscopy，UV)

UV主要用于判斷寡糖中是否含有紫外吸收基團(tuán)，但寡糖的紫外吸收通常較弱，因此，利用UV法進(jìn)行寡糖含量測定時(shí)，需要將寡糖轉(zhuǎn)變?yōu)樘侨┧嵫苌?。UV測定的是寡糖經(jīng)過無機(jī)酸水解脫水產(chǎn)生的糠醛(戊糖)或糠醛衍生物(如羥甲基糠醛)與酚類化合物縮合生成的有色物質(zhì)。Wu等[69]用3,5-二硝基水楊酸(DNS)作為顯色劑，通過斑點(diǎn)顯色情況判斷寡糖的有無和種類，另外，展開劑的種類、配比、展開條件的不同都會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生影響，該方法操作簡便，結(jié)果直觀，也較為常用，經(jīng)常被用來做定性分析。

3.2 紅外光譜法(infrared spectroscopy，IR)

紅外光譜在寡糖的結(jié)構(gòu)分析中主要用于官能團(tuán)以及糖苷鍵構(gòu)型的確定。寡糖的紅外圖譜主要特征峰有：3 300 cm-1處的一個(gè)強(qiáng)寬峰，對(duì)應(yīng)-OH的伸縮振動(dòng)，在2 936 cm-1附近有一個(gè)弱的伸縮帶，對(duì)應(yīng)-CH單鍵的伸縮振動(dòng)；1 740 cm-1處的吸收峰代表糖醛酸的存在；1 640 cm-1和1 100 cm-1的吸收峰表示分別對(duì)應(yīng) C=O和C-O的伸縮振動(dòng)；在1 400 cm-1左右的吸收表示-CH的彎曲振動(dòng)；1 200～1 000 cm-1區(qū)域的強(qiáng)吸收代表C-O-C糖苷鍵的存在，C-C和C-OH鍵的伸縮振動(dòng)，1 024 cm-1附近的吸收峰對(duì)應(yīng)于寡糖的一個(gè)吡喃糖單元；930 cm-1和820 cm-1附近的典型吸收峰表明存在β型和α型糖苷鍵的呋喃糖環(huán)[70]。

3.3 氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)

氣相色譜是鑒定寡糖糖苷鏈連接方式的主要手段之一。Bai等[71]采用氣相色譜法對(duì)水提醇沉得到的黨參寡糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，將黨參寡糖在120 ℃下用2 mol三氟乙酸(trifluoroacetic Acid，TFA)直接水解2 h，除去TFA之后，水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為糖醇乙酸酯后進(jìn)行氣相色譜分析。GC-MS分析結(jié)果表明，黨參寡糖的主要單糖組成為果糖和葡萄糖(α-Glcp、β-Glcp、β-Fruf、β-Fru)，摩爾比為1.21∶1，對(duì)寡糖甲基化衍生后采用GC-MS進(jìn)行分析，糖苷鍵連結(jié)方式為→1-α-D-Glcp,→2)-β-D-Fruf-1(→和β-D-Fruf-(2→。

3.4 高效薄層色譜法(high performance thin-layer chromatography，HPTLC)

Zhou等[72]采用HPTLC對(duì)巴戟天水提液中的成分進(jìn)行定性分析，確定巴戟天藥材及其產(chǎn)品中的3種寡糖分別為耐斯糖、1F-果呋喃基耐斯糖、蔗果三糖；通過對(duì)比顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸和苯胺-鄰苯二甲酸的顯色效果，發(fā)現(xiàn)只有在α-萘酚-硫酸做顯色劑時(shí)，顯色反應(yīng)靈敏，斑點(diǎn)清晰，而且容易控制。因此，在該實(shí)驗(yàn)中將α-萘酚-硫酸作為顯色劑。

3.5 質(zhì)譜法(mass spectrometry，MS)

MS技術(shù)是寡糖結(jié)構(gòu)分析最常用的方法，早期主要利用GC-MS來分析糖類的組成和連接方式，隨著電離技術(shù)的發(fā)展，電子轟擊質(zhì)譜(EI-MS)、快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、電噴霧-質(zhì)譜(electron spray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)等軟電離技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于寡糖的分子量和糖殘基的連接順序的研究起到了很大的推動(dòng)作用。一般用來測定大分子量寡糖的是MALDI-TOF MS和ESI-MS，其中MALDI-TOF MS測量的分子量能夠達(dá)到100 000 Da。ESI-MS作為一種軟電離技術(shù)，可獲得多電荷的分子離子[M+nH]n+或[M-nH]n-，擴(kuò)大可測定的分子量范圍，對(duì)寡糖分子量和單糖組成種類進(jìn)行分析可進(jìn)一步推斷寡糖的聚合度；在ESI-MSn中寡糖發(fā)生糖苷鍵斷裂的機(jī)理為，未衍生的寡糖在斷裂過程中發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，斷裂后形成的不飽和六元環(huán)容易發(fā)生跨環(huán)裂解，產(chǎn)生具有表征其結(jié)構(gòu)信息的特征碎片[73]。寡糖的連接鍵構(gòu)型、連接順序可通過ESI-MS的二級(jí)碎片結(jié)構(gòu)得到，二者的聯(lián)合應(yīng)用也使得寡糖的定性定量分析更加快捷高效。因其所具有的高靈敏度、高精確度和快速定性等特點(diǎn)，ESI-MS已成為寡糖結(jié)構(gòu)分析的重要技術(shù)之一。Luo等[74]對(duì)純化的銀耳寡糖TPH-1還原末端采用PMP進(jìn)行衍生，ESI-MS分析結(jié)果顯示，質(zhì)荷比m/z687.1處為二糖連接兩分子PMP的分子離子峰，應(yīng)為[Glc A-Man-(PMP)2]的分子離子峰；m/z510.9處為甘露糖連接兩分子PMP，應(yīng)為[Man-(PMP)2]的分子離子峰。說明TPH-1為分子量356 Da的二糖，二糖的還原末端為Man，非還原末端為Glc A。Pu等[75]基于UPLC-QTOF MS(負(fù)離子模式)推斷出了遠(yuǎn)志中的6個(gè)蔗糖酯類化合物和15個(gè)低聚糖酯類化合物，通過產(chǎn)生的分子離子峰、丟失基團(tuán)以及碎片離子的質(zhì)荷比，判斷該化合物為阿魏酸與蔗糖成酯接連而成。Zhang等[76]以NaOH為填料制備固相甲基化柱，以CH3I為甲基化試劑，采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合固相甲基化技術(shù)對(duì)不同生長環(huán)境人參中寡糖的甲基化產(chǎn)物進(jìn)行了測定，通過對(duì)比與寡糖對(duì)照品相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片信息，證明人參中存在6種還原寡糖(麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖)和3種非還原寡糖(蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖)，而且該方法可以同時(shí)測定人參中9種寡糖的含量，為人參中寡糖的分布提供了測定方法。Luan等[77]采用FAB-MS對(duì)比了遠(yuǎn)志生品、蜜炙遠(yuǎn)志、甘草制遠(yuǎn)志、清水煮遠(yuǎn)志、遠(yuǎn)志木心中黃花遠(yuǎn)志素A、遠(yuǎn)志蔗糖酯A和遠(yuǎn)志蔗糖酯C的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明遠(yuǎn)志寡糖酯類成分性質(zhì)不穩(wěn)定，在炮制過程中酯鍵發(fā)生了水解，與前期研究中遠(yuǎn)志甘草汁煮制后多種寡糖酯類成分和遠(yuǎn)志皂苷B含量降低，小分子有機(jī)酸含量增加的結(jié)論相吻合。Li等[78]對(duì)水提醇沉得到的人參低聚糖進(jìn)行過甲基化處理，分離并鑒定出了12種低聚糖，采用UHPLC-Q-Orbitrap/MS對(duì)低聚糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，其中Erlose為人參中首次報(bào)道的非還原性低聚糖，首次鑒定出了麥芽糖、蔗糖、麥芽糖三糖、丙酮和聶氏糖5種低聚糖。[M+NH4]+和[M+Na]+分別在m/z676.38和681.33有高強(qiáng)度的離子峰，[M+H]+在659.35處有低強(qiáng)度離子峰；低聚糖[M+Na]+的數(shù)據(jù)也為人參結(jié)構(gòu)鑒定提供了更多的結(jié)構(gòu)信息片段。

3.6 核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)

核磁共振(NMR)技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)較為成熟，是糖類結(jié)構(gòu)解析的重要方法之一，可判斷糖類化合物的種類、糖與糖的連接位置、糖殘基數(shù)目、糖苷鍵構(gòu)型、糖與糖的連接順序等[79]。NMR不需標(biāo)準(zhǔn)品即可進(jìn)行定性分析，因此特別適用于分析結(jié)構(gòu)未知的糖類，但待測組分必須是高純度且重量在毫克級(jí)以上的化合物，且對(duì)化合物定性前，目標(biāo)化合物需要進(jìn)行分離純化。糖類化合物的NMR圖譜可選用四甲基硅烷或丙酮作為參比標(biāo)準(zhǔn)，測定溶劑多為重水(D2O)，在氘代吡啶、氘代二甲亞砜等非質(zhì)子溶劑中，糖類化合物的譜圖分辨率較好。NMR技術(shù)是糖類化合物結(jié)構(gòu)研究的重要方法之一，該技術(shù)的應(yīng)用可使糖類化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究更加準(zhǔn)確高效，以便于更好地揭示糖類物質(zhì)的作用機(jī)制以及生物活性。Xiao等[80]將從竹子中分離得到的木糖寡糖采用NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，取15 mg木糖寡糖樣品進(jìn)行成分分析，結(jié)果表明竹粉中木糖含量為18.2%、阿拉伯糖、半乳糖含量分別為0.8%、0.2%，甘露糖、葡萄糖醛酸的含量均為0.1%。經(jīng)過自動(dòng)水解后，低聚糖含量為56.6%。Wang等[81]通過DEAE-Cellulose 52和Sephacryls-100過濾柱從牛膝提取液種連續(xù)分離得到一種新型寡糖ABW90-1，并通過單糖分析、甲基化分析、IR和NMR等手段對(duì)其進(jìn)行了表征。該寡糖由(2→6)-β-D-呋喃果糖(Fruf)和2→1)-β-D-Fruf殘基組成，末端為Glc和Fru殘基。寡糖結(jié)構(gòu)解析方法比較見表3。

表3 寡糖結(jié)構(gòu)解析方法比較

4 總結(jié)展望

本文綜述了中藥寡糖的提取分離，純化以及結(jié)構(gòu)表征方面的研究進(jìn)展。

寡糖在提取時(shí)，應(yīng)該考慮溶劑對(duì)目標(biāo)寡糖組分的溶解性，寡糖在提取溶劑中的穩(wěn)定性，寡糖得率，寡糖純度，提取時(shí)間，溶劑用量，溶劑環(huán)保性和安全性，所采用的設(shè)備是否方便操作等因素。目前，寡糖的提取溶劑較為常見的是水和乙醇-水溶液，采用水作為提取溶劑時(shí)，一部分多糖和蛋白質(zhì)也會(huì)一起提取出來，給分離和純化帶來了一定難度，另外一些寡糖在水溶液也不穩(wěn)定。因此，寡糖提取的另一種溶劑為乙醇-水溶液，但該方法的缺點(diǎn)是乙醇消耗量較大，而且對(duì)于藥品的提取溶劑來說，并不是一種理想的溶劑。由此可見，目前對(duì)于寡糖來說，其提取溶劑的種類還是存在局限性，亟需發(fā)現(xiàn)新的溶劑系統(tǒng)，以適應(yīng)不同種類寡糖的提取要求，在探索新的提取方法的同時(shí)，以高品質(zhì)目標(biāo)寡糖的得率為目標(biāo)，將傳統(tǒng)方法與新方法、新設(shè)備的優(yōu)勢進(jìn)行結(jié)合，探索出一種綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的提取方法。

寡糖的分離方法主要有膜分離法、液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。常規(guī)膜分離技術(shù)有微濾、超濾、納濾、反滲析，以及結(jié)合電化學(xué)技術(shù)的電滲析、連續(xù)電除鹽等。膜分離法分離效率高、能耗低、無污染，可實(shí)現(xiàn)分子級(jí)過濾過濾過程簡單、易于控制，兼有分離、濃縮、純化和精制的功能，在化合物分離純化除雜方面具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢，缺點(diǎn)是該技術(shù)對(duì)設(shè)備要求和膜的要求較高，操作復(fù)雜，還受到壓力、溫度、時(shí)間等多種因素的影響。新型膜分離技術(shù)對(duì)膜的工作性能，膜通量、減輕膜污染、降低壓力驅(qū)動(dòng)消耗，甚至降低成本，簡化膜的制造技術(shù)，延長單個(gè)膜的使用時(shí)間都提出了更高的要求。目前新型膜分離技術(shù)也已經(jīng)產(chǎn)生，包括滲透汽化膜、液膜和動(dòng)態(tài)膜等。柱色譜法在寡糖分離純化方面應(yīng)用極為廣泛，根據(jù)分離材料、流動(dòng)相、分離原理等不同，又分為凝膠排阻色譜法、親水作用色譜法、陰離子交換色譜法、石墨化碳柱色譜法、反相高效液相色譜法等。該方法的重點(diǎn)是分離材料，可以根據(jù)寡糖的性質(zhì)選擇合適的分離材料，以達(dá)到最佳的分離純化效果，而且目前糖類化合物的分離材料一直是研究的熱點(diǎn)，在天然產(chǎn)物應(yīng)用方面也已經(jīng)較為成熟，因此寡糖的分離純化會(huì)變得更加快捷高效，且具有更多的選擇性。電泳法分離寡糖可采用柱前衍生，不經(jīng)衍生的直接和間接紫外檢測，激光誘導(dǎo)熒光檢測，電極脈沖安培檢測這四種方法，此外，間接紫外檢測還可以對(duì)無法衍生化的非還原性寡糖及醛糖酸進(jìn)行鑒定。目前CE在藥物分析方面仍然具有特色和優(yōu)勢，并顯示出較大的發(fā)展空間，但是仍舊存在多個(gè)重要瓶頸問題比如靈敏度、重復(fù)性、定性能力等等，這些問題也亟需改進(jìn)和突破。

寡糖的結(jié)構(gòu)鑒定一般采用紫外和薄層色譜可對(duì)具有熒光或可以顯色的糖類進(jìn)行簡單定性，紅外吸收光譜法主要鑒定寡糖中糖環(huán)骨架和官能團(tuán)，一般用于寡糖結(jié)構(gòu)的初步表征；質(zhì)譜法一般用于測定寡糖糖鏈和分子量，是寡糖結(jié)構(gòu)鑒定的重要方法之一；核磁共振波譜法是利用特定的原子核在給定的磁場中，只吸收特定射頻輻射形成核磁共振信號(hào)，從而進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，通過糖殘基中各位點(diǎn)元素的化學(xué)位移產(chǎn)生的信號(hào)可以獲得寡糖的結(jié)構(gòu)信息，通過信號(hào)峰面積的積分可得到殘基的相對(duì)含量。寡糖的純度、分子量及其連接位置、連結(jié)方式等特征可以通過GC、MS、NMR以及各種方法聯(lián)用來進(jìn)行測定。寡糖糖鏈具有復(fù)雜性和多樣性，以上測定方法對(duì)多糖的性質(zhì)、純度、或用量等方面存在一定要求，也正是由于各種結(jié)構(gòu)表征方法存在的種種限制，因此未來發(fā)展趨勢一定是多種方法聯(lián)合應(yīng)用，寡糖的分離分析也是如此，因此寡糖的提取方法、分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)表征方法的不斷發(fā)展，對(duì)其寡糖的開發(fā)及應(yīng)用有著深遠(yuǎn)的意義。合理可行的方案一定可以實(shí)現(xiàn)寡糖高效制備、快速分離和精準(zhǔn)表征，使得中藥中的寡糖在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。