碳酸酐酶Ⅸ聯(lián)合TFE3 對成人Xp11.2 易位性腎癌的診療作用

張林林，黃吉煒，陳勇輝，張 進，黃翼然

（1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科,山東泰安 271000；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科,上海 200120)

Xp11.2 易位/TFE3 基因融合相關(guān)性腎癌(renal cell carcinoma associated with Xp11.2 translocations/TFE3 gene fusions，簡稱Xp11.2 易位性腎癌)，是一種罕見的腎細胞癌，1986 年由DE JONG 等[1]首次報道，直到2004 年WHO 腎臟腫瘤分類中將其列為一種獨立腎癌亞型[2]。Xp11.2 易位性腎癌的診斷依據(jù)主要來源于組織形態(tài)學(xué)、免疫組化、分子生物學(xué)三個層面。目前TFE3 免疫組化強陽性仍是用于臨床診斷篩選的普遍方法[3]。單純依靠TFE3 抗體腫瘤細胞核彌漫強陽性表達診斷Xp11.2 易位性腎癌容易漏診或者誤診，所以需要尋找一些類似于TFE3 特異性強、檢測方便的指標共同輔助Xp11.2 易位性腎癌的診斷篩選。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase，CAⅨ）是碳酸酐酶家族中的一員，作為腫瘤相關(guān)抗原，在腎癌中選擇性表達[4]，但在Xp11.2 易位性腎癌中的表達情況報道較少。本次研究經(jīng)病理學(xué)、免疫組化及熒光原位雜交檢測(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)確診為成人Xp11.2 易位性腎癌患者中CAⅨ的表達情況，并且研究CAⅨ聯(lián)合TFE3 在診斷篩選Xp11.2易位性腎癌中的作用，為腎細胞癌的臨床診斷中更好地分辨Xp11.2 易位性腎癌提供幫助。

1 資料與方法

1. 1 患者資料回顧性分析山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院2013年2 月—2017 年9 月收治的經(jīng)病理學(xué)、免疫組化及FISH 證實的24 例成人Xp11.2 易位性腎癌（其中有2例TFE3 弱陽性Xp11.2 易位性腎癌）及24 例成人腎透明細胞癌（其中挑選6 例TFE3 強陽性腎透明細胞癌及2 例TFE3 弱陽性腎透明細胞癌，余16 例腎透明細胞癌為隨機挑選）的臨床病理資料。兩組男性25例，女性23 例；中位年齡42（20～69）歲。兩組患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

1. 2 免疫組化結(jié)果判讀采用半定量計數(shù)方法[5]：①染色強度評分：0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。CAⅨ為細胞膜或胞質(zhì)染色；②陽性細胞所占的百分比評分：在高倍視野（×400）下，檢測每張切片的10 個代表性區(qū)域，其中每個區(qū)域計算100 個細胞，然后計算染色細胞百分率，0 分為陽性細胞＜5%，1 分為陽性細胞6%～25%，2 分為26%～50%，3 分為51%～75%，4 分為＞75%。兩種評分相加作為判斷結(jié)果：≤3 分為陰性，4～5 分為弱陽性（+），6～7 分為強陽性（++）。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對Xp11.2 易位性腎癌及腎透明細胞癌的CAⅨ表達結(jié)果采用例(%)表示，組間表達差異比較采用χ2檢驗或者Fisher’s確切概率法，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 兩組患者TFE3 及CA Ⅸ表達情況24 例Xp11.2 易位性腎癌患者中CA Ⅸ陽性者1 例（4.17%），且為弱陽性；24 例透明細胞性腎細胞癌患者中CAⅨ陽性者22 例（91.67%），其中強陽性者19例（79.17%），弱陽性者3 例（12.50%），兩者CAⅨ陽性率有差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表1）。CAⅨ在6 例TFE3 高表達透明細胞性腎細胞癌中全部彌漫強陽性表達（100%）。TFE3 高表達的腎透明細胞癌與TFE3 高表達的Xp11.2 易位性腎癌中兩者CAⅨ陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 Xp11.2 易位性腎癌組與透明細胞性腎細胞癌組TFE3 及CAⅨ表達比較 [例(%)]

通過CAⅨ聯(lián)合TFE3 診斷提示：如果TFE3 強陽性，CAⅨ陰性，提示Xp11.2 易位性腎癌；如果TFE3弱陽性，CA Ⅸ陰性提示Xp11.2 易位性腎癌；如果TFE3 弱陽性，CAⅨ陽性提示透明細胞性腎細胞癌；如果TFE3 陰性，CAⅨ陽性提示透明細胞性腎細胞癌；如果TFE3、CAⅨ均弱陽性或TFE3 強陽性、CAⅨ弱陽性則需要基因檢測確診。

2. 2 腎透明細胞癌與Xp11. 2 易位性腎癌患者影像學(xué)及病理圖片比較見圖1A～J。

圖1 腎透明細胞癌與Xp11.2 易位性腎癌患者影像學(xué)及病理圖像比較

影像學(xué)腎臟增強CT 顯示Xp11.2 易位性腎癌皮質(zhì)期增強不明顯，透明細胞性腎癌則相反（圖1 A、F）。Xp11.2 易位性腎癌大體形態(tài)與透明細胞癌類似，切面多為棕黃色，質(zhì)軟，可有壞死、出血（圖1 B、G）。Xp11.2 易位性腎癌鏡下其最具特征性的組織病理學(xué)表現(xiàn)為由透明細胞及嗜酸性細胞組成的乳頭狀結(jié)構(gòu)伴砂礫體，少數(shù)還可見含嗜酸性顆粒胞漿的腫瘤細胞組成的巢狀結(jié)構(gòu)[6]（圖1H）。常規(guī)HE 染色很難區(qū)分Xp11.2 易位性腎癌與透明細胞性腎癌（圖1C、H）。在免疫組織化學(xué)上，Xp11.2 易位性腎細胞癌TFE3 抗體腫瘤細胞核彌漫強陽性表達（圖1 J），而CAⅨ陰性表達（圖1 I）；而腎透明細胞癌TFE3 陰性表達（圖1E），CAⅨ呈強陽性表達（圖1D）。FISH檢測腫瘤細胞出現(xiàn)一對分離信號（粗箭頭）或者單個紅、黃信號（細箭頭），提示中TFE3 分離探針提示陽性（圖2）。

圖2 Xp11.2 易位性腎癌患者FISH 檢測圖

3 討 論

Xp11.2 易位性腎癌是腎癌的罕見類型，2016 年第4 版WHO 分類系統(tǒng)中將其與t（6；11）易位相關(guān)性腎細胞癌共同歸類為MiT 家族易位相關(guān)性腎細胞癌[7]。目前該類腫瘤的發(fā)病機制及特點有如下報道：①Xp11.2 易位性腎癌中X 染色體在p11.2 區(qū)與其他染色體發(fā)生平衡易位形成新的TFE3 融合基因，目前涉及的融合基因已經(jīng)明確的有12 種[8]，包括ASPL、

PRCC、SFPQ、CLTC、NONO、RBM10、PARP14、LUC7L3、KHSRP、DVL2、MED15 和GRIPAP1，其中以t(X;17)(P11;q25)引起的ASPL-TFE3 和t(X;1)(P11;q21)導(dǎo)致的PRCC-TFE3 最為常見[9-10]。TFE3融合基因的持續(xù)表達和轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致其下游的腫瘤相關(guān)靶基因持續(xù)轉(zhuǎn)錄，推動腎小管向腎細胞癌方向的惡性轉(zhuǎn)化[11]。②TFE3 融合蛋白還可協(xié)同E2F2、LEF-1、ETS1 等轉(zhuǎn)錄因子，共同激活周期蛋白（Cyclin）E 等細胞周期調(diào)控蛋白，促進細胞的持續(xù)分裂，導(dǎo)致腫瘤形成[6]。③BARROCA 等[12]發(fā)現(xiàn)該類腫瘤的發(fā)病與P21、cyclin D1、cyclin D3 導(dǎo)致的強烈免疫反應(yīng)使細胞周期調(diào)節(jié)失控有關(guān)。④有報道指出該類腫瘤的發(fā)生與兒童時期接觸化療藥物有一定關(guān)系[13]。在發(fā)病率上，目前大部分文獻報道認為該類腫瘤是一種主要累及兒童及青少年的腎臟腫瘤。有研究報道Xp11.2易位性腎癌占成年人所有腎癌比例的1.6%～5.0%[14]。ARGANI 等[15]認為成人腎細胞癌的發(fā)病人數(shù)遠高于兒童，故成人Xp11.2 易位性腎癌患者總數(shù)應(yīng)該明顯多于兒童。KOMAI 等[16]認為成人Xp11.2易位性腎癌與常見類型的腎細胞癌在大體形態(tài)及常規(guī)HE 染色上類似，細胞遺傳學(xué)檢測不作為常規(guī)檢查，從而很大部分該類腎癌被誤診、漏診，導(dǎo)致其在成人中的發(fā)生率可能被嚴重低估。

徐曉晨等[17]就影像學(xué)方面報道12 例Xp11.2 腎細胞癌增強掃描CT 值平均提高約31.75 Hu，而對照組12 例腎透明細胞癌CT 值平均提高88.3Hu，強化幅度明顯小于透明細胞癌。在組織學(xué)形態(tài)方面，Xp11.2 易位性腎癌大體形態(tài)與普通腎細胞癌類似，腫瘤界限相對清楚，假包膜常見，剖面多呈棕黃色，部分區(qū)域可見出血、壞死、鈣化或囊性改變，腫瘤細胞由透明細胞和( 或) 嗜酸性細胞構(gòu)成，呈乳頭狀、腺泡狀或巢狀結(jié)構(gòu)排列，核濃縮，核仁明顯，水泡狀染色質(zhì)，砂粒體和玻璃樣小體常見，胞界清楚。隨著Xp11.2易位性腎癌不斷得到廣泛認識，新的病理形態(tài)不斷被報道，但至今未形成一致共識。在免疫組化學(xué)診斷上，TFE3 抗體腫瘤細胞核彌漫強陽性表達已經(jīng)成為診斷Xp11.2 易位性腎細胞癌的最重要依據(jù)。KLATTE 等[10]回顧性分析了848 例患者的臨床資料，免疫組化檢測胞核TFE3 蛋白強陽性者17 例，但是最終經(jīng)遺傳學(xué)分析確診Xp11.2 易位性腎癌僅2 例，提示TFE3 蛋白不應(yīng)作為該類型腎癌確診的標志物，確診需依靠細胞遺傳學(xué)。YANG 等[18]報道了少數(shù)的腎透明細胞癌免疫組化可強陽性表達TFE3，并報道其比例為0.4%，提示應(yīng)用TFE3 免疫組化法診斷Xp11.2 易位性腎細胞癌存在潛在陷阱。有研究總結(jié)TFE3 蛋白假陽性的出現(xiàn)可能有以下幾種原因: ①與自動免疫組化儀的使用有關(guān)，因為30 min 的孵育方式可能提高TFE3 的敏感度而降低其特異性[19]；②抗體濃度過高；③弱陽性TFE3 可能是由于全長TFE3 蛋白表達而非易位導(dǎo)致的嵌合蛋白表達[20]。假陰性的結(jié)果可能有以下2 點原因[21]：①組織固定不佳或修復(fù)液的pH 值不適合造成；②并非所有TFE3 免疫組化都陽性表達。根據(jù)以上報道單純依靠TFE3 抗體腫瘤細胞核彌漫強陽性表達容易漏診或者錯診。腫瘤細胞核型分析或者反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)基因測序檢測診斷準確，但是一般均需要新鮮標本，技術(shù)要求較高，并且費用高，故很難對每個腎腫瘤患者常規(guī)檢測。KIM 等[22]首先報道利用熒光原位雜交技術(shù)檢測TFE3 基因斷裂從而診斷Xp11.2 易位性腎癌。因為采用FISH 檢測診斷時操作方法簡單，不需要新鮮組織及細胞生長，石蠟固定的組織也可以檢測，故近年被推崇為診斷的金標準。對于FISH 檢測，有文獻報道 融 合 亞 型 NONO-TFE3、RBM10-TFE3 和GRIPAP1-TFE3 的融合基因間螺距相對較小，此時FISH 呈假陰性結(jié)果，而TFE3 免疫組化為陽性結(jié)果[23-25]。因此我們發(fā)現(xiàn)單純依靠免疫組化及FISH 檢測均存在一定的漏診或者誤診率，所以在日常腎癌診斷中，我們?nèi)孕枰獙ふ乙恍╊愃芓FE3 特異性強的指標共同輔助篩選Xp11.2 易位性腎癌。

碳酸酐酶是一組含鋅離子的酶，具有14 種以上的同工酶。CAⅨ是碳酸酐酶家族異構(gòu)體之一，其定位于細胞膜上，廣泛分布于人體各種組織及器官，對細胞增殖的調(diào)控、轉(zhuǎn)化方面起著重要作用。文獻報道CAⅨ在肺癌、胃癌、宮頸癌和乳腺癌等多種腫瘤中高表達[26-29]。BUI 等[30]對224 例腎透明細胞癌患者研究發(fā)現(xiàn)，93% 的腎細胞癌標本為CA Ⅸ染色陽性，且80%為強陽性。唐曉龍等[31]對63 例腎癌組織研究發(fā)現(xiàn)CAⅨ在腎癌組織中異常高表達，在癌旁組織中低表達或不表達。Xp11.2 易位相關(guān)性腎細胞癌一般不表 達CA Ⅸ[32-33]。 ARGANI 等[32]通 過 研 究21 例Xp11.2 易位相關(guān)性腎細胞癌，發(fā)現(xiàn)57%的Xp11.2 易位相關(guān)性腎細胞癌局灶CAⅨ陽性。YANG 等［18］通過20 例Xp11.2 易位相關(guān)性腎細胞癌、7 例TFE3 表達強陽性腎透明細胞癌CAⅨ免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)10%的Xp11.2 易位相關(guān)性腎細胞癌局灶CAⅨ陽性，而7 例TFE3 表達強陽性透明細胞性腎細胞癌全部呈彌漫性CAⅨ陽性，并且提出CAⅨ是鑒別TFE3 強陽性的腎透明細胞癌與Xp11.2 易位性腎細胞癌的良好標志物。本研究發(fā)現(xiàn)24 例Xp11.2 易位性腎癌患者中1 例（4.17%）CAⅨ為弱陽性；6 例TFE3 高表達腎透明細胞癌中全部CAⅨ彌漫強陽性表達(100%)。24例腎透明細胞癌患者中CAⅨ陽性者22 例（91.67%），強陽性者19 例（79.17%），弱陽性者3 例（12.50%）；在Xp11.2 易位性腎癌組與透明細胞癌組CAⅨ陽性率有顯著性差異（P＜0.01）。同時TFE3 表達的腎透明細胞癌與TFE3 高表達的Xp11.2 易位性腎癌中兩者CAⅨ陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。從本研究來看CAⅨ在Xp11.2 易位相關(guān)性腎細胞癌表達率較低，在腎透明細胞癌中高表達，符合文獻報道。

本研究認為單純依靠CAⅨ或者是TFE3 來篩選Xp11.2 易位相關(guān)性腎細胞癌均存在漏診或者誤診可能。如果CAⅨ聯(lián)合TFE3，我們可以發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律：如果TFE3 強陽性、CAⅨ陰性，提示Xp11.2 易位性腎癌；如果TFE3 弱陽性、CAⅨ陰性提示Xp11.2 易位性腎細胞癌；如果TFE3 弱陽性、CAⅨ陽性提示腎透明細胞癌；如果TFE3 陰性，CAⅨ陽性提示腎透明細胞癌。如果TFE3、CAⅨ均弱陽性，則需要基因檢測確診；如果TFE3 強陽性、CAⅨ弱陽性則需要基因檢測，進一步確診。CAⅨ聯(lián)合TFE3 有助于Xp11.2易位性腎癌診斷篩選，同時也避免了大量常規(guī)采用基因篩選診斷帶來的經(jīng)濟及技術(shù)困難。

CAⅨ是一個用于鑒別透明細胞性腎細胞癌與Xp11.2 易位性腎癌的免疫組化標志物。在日常腎細胞癌診療工作中，常規(guī)采用免疫組化學(xué)CAⅨ聯(lián)合TFE3 有助于篩選透腎明細胞癌與Xp11.2 易位性腎癌，值得在臨床上廣泛推廣。