單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在膀胱癌研究中的應(yīng)用與展望

鄭 越，楊曉峰

（山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原030000）

膀胱癌（bladder cancer,BC）的90%～95% 為尿路上皮癌（urothelial cell carcinoma,UCC），在所有腫瘤中的突變頻率中排列第三[1-2]。臨床上按照腫瘤浸潤(rùn)膀胱壁深度可以分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non muscular invasive bladder cancer,NMIBC）、肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer,MIBC）。根據(jù)分子分型可分為管腔型、基底型和鱗狀型[3]。雖然新一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing,NGS）已廣泛地展示了BC 的基因表達(dá)圖譜，但這只是腫瘤樣本在某一時(shí)段的總體批量分析，反映的是整體混合細(xì)胞的平均表達(dá)譜[3]，掩蓋了不同群體細(xì)胞的差異特征，忽略了某些基因的隨機(jī)性表達(dá)[4]，從而限制了對(duì)BC 機(jī)制的深入研究。對(duì)于具有高度異質(zhì)性的BC 細(xì)胞，單細(xì)胞測(cè)序（single cell sequencing,SCS）技術(shù)能夠從單個(gè)細(xì)胞水平分析實(shí)體腫瘤和體液中細(xì)胞亞群、細(xì)胞間相互作用，以及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等病理生理的機(jī)制，闡述腫瘤內(nèi)部復(fù)雜多樣的細(xì)胞表型和分化差異，為新的診療方案提供理論基礎(chǔ)。本文結(jié)合SCS 在腫瘤方面的應(yīng)用，闡述SCS 在BC 中的研究進(jìn)展。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用

單細(xì)胞RNA（轉(zhuǎn)錄組）測(cè)序技術(shù)（single cell sequencing,scRNA-seq）在2009 年首次出現(xiàn)，開啟了SCS 發(fā)展的時(shí)代[5]。隨后的十幾年里，相繼出現(xiàn)了單細(xì)胞DNA（基因組）測(cè)序[6]融合DNA-RNA 的多種模式單細(xì)胞測(cè)序[7]以及采用微流控液滴法，篩選與帶有條形碼（barcode）、分子標(biāo)簽（unique molecular index,UMI）、引物及酶的凝膠珠（Gel Beads）相結(jié)合的單個(gè)細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，能夠在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)分析數(shù)千個(gè)單細(xì)胞中mRNA 表達(dá)和擴(kuò)增建立文庫(kù)的單細(xì)胞RNA 測(cè)序（Drop-seq）[8]。Drop-seq 的出現(xiàn)極大地提高了細(xì)胞測(cè)序效率，節(jié)省了SCS 成本和時(shí)間，促使scRNA-seq水平的研究得到了飛躍發(fā)展。10X Genomics 是當(dāng)前最新的SCS 技術(shù)，也是在Drop-seq 的基礎(chǔ)上，數(shù)分鐘內(nèi)就能檢測(cè)上萬的細(xì)胞量，擴(kuò)大了篩選范圍，以發(fā)掘更多潛在的細(xì)胞表型[9]。十多年來，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)不斷地創(chuàng)新和發(fā)展，并且廣泛地應(yīng)用于mRNA、基因組、染色質(zhì)、DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色體構(gòu)像等方面[10]，以應(yīng)對(duì)不同的科研需求。

scRNA-seq 常用于分析轉(zhuǎn)錄組中差異基因的表達(dá)（differential gene expression,DGE）[11]，比如：動(dòng)物胚胎發(fā)育、組織器官再生和植物細(xì)胞發(fā)育等生物生理學(xué)現(xiàn)象的研究；神經(jīng)系統(tǒng)損傷、器官組織疾病、病毒入侵導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和組織細(xì)胞改變等病理生理學(xué)特征的探討；以及癌癥組織的起源發(fā)展、惡性程度、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和耐藥性機(jī)制形成等。

2 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在BC 的應(yīng)用進(jìn)展

2. 1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在BC 發(fā)生機(jī)制及異質(zhì)性的應(yīng)用BC 具有高度的異質(zhì)性，其形成與腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（intratumoral heterogeneity,ITH）相關(guān)，后者調(diào)控著BC 的遺傳方向和基因組特征[3]。LI 等[12]關(guān)于小鼠正常膀胱上皮細(xì)胞scRNA-seq 的研究發(fā)現(xiàn)，ASPM基底樣細(xì)胞群具有增殖更新的能力，能夠在受到創(chuàng)傷應(yīng)激后分化成其他上皮細(xì)胞，推測(cè)并證實(shí)是其他亞群的祖細(xì)胞。SANTO 等[13]通過對(duì)人類膀胱的scRNAseq 揭示了帶有CD49fhigh基底尿路上皮細(xì)胞群通過Notch 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)自我更新和分化潛能的特征，進(jìn)一步說明基底細(xì)胞群是膀胱其他細(xì)胞亞群的祖細(xì)胞。而人類膀胱癌干細(xì)胞（human bladder cancer stem cells,BCSCs）與膀胱上皮干細(xì)胞（bladder epithelial stem cells,BESCs）和膀胱上皮非干細(xì)胞（bladder cancer non-stem cells,BENSCs）存在轉(zhuǎn)化關(guān)系，且ARID1A、GPRC5A 和MLL2 是BCSCs 的 關(guān) 鍵 調(diào) 控基因，提示BCSCs 很可能來自BCSC 或BCNSC[14]。

正常膀胱基底細(xì)胞存在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）現(xiàn)象，而T1 期BC 基底細(xì)胞中出現(xiàn)的EMT 促進(jìn)了癌細(xì)胞向固有層的浸潤(rùn)[15]。因此，基底細(xì)胞的干細(xì)胞特性，能夠影響上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的差異性表達(dá)，使得后兩者成為BC 發(fā)生發(fā)展的主要因素，比如：間充質(zhì)細(xì)胞(Acta2+肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)對(duì)尿路上皮具有修復(fù)和再生作用，可能與癌細(xì)胞的增殖有關(guān)[16]。一種表達(dá)鈣黏蛋白12（cadherin 12 ,CDH12）上皮細(xì)胞亞群，能夠與T 細(xì)胞密切作用，高度表達(dá)PD-L1、PD-L2 和CD49a，消耗CD+8T 細(xì)胞，干預(yù)新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NAC)和免疫檢查點(diǎn)療法（immune checkpoint therapy ,ICT），以產(chǎn)生耐藥 性[17]。 ZHOU 等[18]通 過 分 析 原 發(fā)BC 患 者 的scRNA-seq 數(shù)據(jù)篩選獲得了ITH 相關(guān)基因，并對(duì)其進(jìn)行個(gè)體化的異質(zhì)性相關(guān)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)高評(píng)分中存在GAL-9 低表達(dá)和CD+8T 細(xì)胞低浸潤(rùn)，是導(dǎo)致免疫治療反應(yīng)較差的原因，而低評(píng)分中存在免疫調(diào)節(jié)因子（GPSM3）有關(guān)的標(biāo)志物，與良好的預(yù)后相關(guān)。

2. 2 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在BC 免疫微環(huán)境中的應(yīng)用腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment,TIME）包含多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子，與腫瘤細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤對(duì)免疫應(yīng)答的反應(yīng)，其中基質(zhì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的數(shù)量和分布提示腫瘤組織內(nèi)炎癥的發(fā)展階段，并與患者良好的預(yù)后相關(guān)[19]。有學(xué)者認(rèn)為BC 免疫微環(huán)境中同時(shí)存在抗腫瘤免疫和腫瘤源性炎性反應(yīng)，前者即適應(yīng)性免疫反應(yīng)，是通過檢查點(diǎn)抑制劑（checkpoint inhibitor,CPI）治療后機(jī)體所產(chǎn)生的抗腫瘤反應(yīng)，所以對(duì)CPI 具有敏感性；后者也稱作致瘤性反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞間與基質(zhì)中的固有免疫系統(tǒng)（如：?jiǎn)魏送淌杉?xì)胞）和成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成，進(jìn)而干擾抗腫瘤免疫和保障腫瘤細(xì)胞無限增殖，從而促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生[20]。

CHEN 等[21]對(duì)BC 微環(huán)境中髓樣細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq 測(cè)序和擬時(shí)序分析，發(fā)現(xiàn)其分化亞型單核細(xì)胞經(jīng)歷M2 極化，與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumorassociated macrophages,TAMs）存在轉(zhuǎn)化關(guān)系；另一個(gè)分化亞型樹突狀細(xì)胞LAMP3+DCs 能夠編碼細(xì)胞因子CCL17 和CCL22 募集調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T lymphocyte,Treg），而CD274 則 抑 制CD+8T 的 浸潤(rùn)；除了免疫細(xì)胞，該作者還發(fā)現(xiàn)一種炎癥性癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（inflammatory cancer-associated fibroblasts,iCAFs），其致炎作用是通過分泌多種細(xì)胞因子（尤其是CXCL12），促進(jìn)免疫細(xì)胞向BC 浸潤(rùn)，推測(cè)可能是通過誘導(dǎo)大量Treg 浸潤(rùn)而抑制細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的作用。以上表明BC 免疫微環(huán)境中的炎性細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化成為適合腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞，可能失去其原始的抗原呈遞和清除異常細(xì)胞的作用，或者通過調(diào)控免疫系統(tǒng)，來抵抗免疫應(yīng)答對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

令人驚喜的是，OH 等[22]在BC 免疫微環(huán)境中首次鑒定出一種細(xì)胞毒性CD+4T 細(xì)胞，其作用機(jī)制是依賴MHC II 類抗原分子識(shí)別腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生與CTL 功能類似的顆粒酶和穿孔素等裂解靶細(xì)胞。正常情況下，機(jī)體中的Treg 通過牽制CTL 的數(shù)量，使兩者處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，防止出現(xiàn)自身免疫系統(tǒng)疾病。然而BC 癌細(xì)胞中Treg 含量遠(yuǎn)高于CTL，過度抑制CTL 的細(xì)胞殺傷作用，因此細(xì)胞毒性的CD+4T 的出現(xiàn)，既能作為抗原呈遞細(xì)胞，又能殺傷靶細(xì)胞，并且在腫瘤微環(huán)境中富集，可作為BC 免疫治療很有研究?jī)r(jià)值的一個(gè)靶點(diǎn)。

2. 3 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在BC 藥物治療中的應(yīng)用TANAKA 等[23]發(fā)現(xiàn)了BC 在應(yīng)用名為CDDP 的鉑基順鉑藥物治療后而產(chǎn)生耐藥性基因COX7B，適度的COX7B 表達(dá)會(huì)降低腫瘤細(xì)胞對(duì)CDDP 的敏感性，而過度表達(dá)卻提升對(duì)CDDP 的敏感性。KERZELI 等[24]分別對(duì)雄性和雌性小鼠建立OH-BBN 誘導(dǎo)的Hgf-Cdk4R24C 尿路上皮腫瘤模型并進(jìn)行scRNA-seq 分析，發(fā)現(xiàn)CPI 治療對(duì)已經(jīng)存在的癌細(xì)胞有效，但是對(duì)復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞無效，此外還發(fā)現(xiàn)CpG-寡脫氧核苷酸僅對(duì)雌鼠腫瘤的治療效果明顯。PODOJIL 等[25]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的免疫檢查點(diǎn)：T 細(xì)胞抑制蛋白（B7-H4），不同于高表達(dá)于基底表型的CTLA4 和PD-L1 檢查點(diǎn)，B7-H4 在管腔和管腔乳頭狀腫瘤中的表達(dá)水平較高，通過誘導(dǎo)CD+4T 細(xì)胞和單核細(xì)胞而大量產(chǎn)生干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），增加Foxp3+Treg 的數(shù)量，間接調(diào)控CD+8T 的數(shù)量，而降低了抗腫瘤免疫作用。

LEE 等[26]利用scRNA-seq 分析1 例具有化療藥物耐藥性的晚期MIUBC 患者在替比法尼（tipifarnib）治療前后的癌細(xì)胞變化，發(fā)現(xiàn)存在具有耐藥性的癌細(xì)胞亞群通過高表達(dá)IGFBP7 和MDK 而抵抗tipifarnib治療作用，并且在治療后能夠處于相對(duì)休眠狀態(tài)，為后來復(fù)發(fā)的耐藥性癌細(xì)胞提供了增殖基礎(chǔ)。此外，tipifarnib 能夠增強(qiáng)TIME 中的免疫細(xì)胞的抗腫瘤應(yīng)答作用[26]。因此，TIME 在調(diào)節(jié)免疫治療方面具有不容忽視的作用。

綜上所述，化療藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑常用在BC 的治療中，但是治療效果和適用人群都有局限性，原因主要包括：①癌細(xì)胞與周圍基質(zhì)相互作用而促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生，降低了治療的敏感性[27]；②腫瘤細(xì)胞中某種突變基因，可以改變或隱藏自身的治療靶點(diǎn)，或改變其信號(hào)通路，促進(jìn)其他癌細(xì)胞亞型的增殖，因此單一治療方法不足以應(yīng)對(duì)這些改變[28]；③免疫細(xì)胞對(duì)癌組織的浸潤(rùn)太少，使得ICT 治療受限[29]。因此，利用SCS 闡明癌細(xì)胞中的耐藥基因和作用機(jī)制、發(fā)掘更多免疫檢查點(diǎn)以及多種途徑聯(lián)合用藥已成為當(dāng)前BC 藥物治療的熱點(diǎn)。

2. 4 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在尿液脫落細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用尿液是與泌尿系統(tǒng)器官中最直接接觸的液體，可以包含BC 患者脫落的完整癌細(xì)胞、遺傳物質(zhì)、細(xì)胞外囊泡和細(xì)胞因子，是最適合用于無創(chuàng)性檢測(cè)BC 中生物標(biāo)志物的場(chǎng)所。目前，已有多種試劑檢測(cè)盒獲批上市，但其因受假陽性率高、檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定、敏感性和特異性較低等因素影響，限制了生物標(biāo)志物在BC 診療中的應(yīng)用。

通過對(duì)BC 患者的尿液脫落細(xì)胞（exfoliated tumor cells,ETCs）采 用 單 細(xì) 胞DNA 測(cè) 序，WANG等[29]發(fā)現(xiàn)一種BC 標(biāo)志物己糖激酶2（hexokinase2,HK2），是尿路上皮癌細(xì)胞依賴糖酵解作為能量代謝的一種酶，并且驗(yàn)證了其檢測(cè)總體敏感性達(dá)到90%，總體特異性大于88%。相對(duì)于大多數(shù)分子檢測(cè)試劑方法，SCS 既能準(zhǔn)確通過尿液中HK2 的檢測(cè)，篩選處于高糖酵解UETCs（high glycolytic,hgUETCs）的脫落細(xì)胞，又能保證較高的敏感性。另一篇報(bào)道以同樣的方式發(fā)現(xiàn)了DNA 拷貝數(shù)變異（copy-number variations,CNVs），表明SCS 不僅能鑒定穩(wěn)定的細(xì)胞表型和基因組型，對(duì)于頻繁突變的基因組也同樣有效[30]。

因此，SCS 對(duì)BC 患者尿液脫落細(xì)胞的檢測(cè)，不僅能夠檢測(cè)和鑒定尚未發(fā)現(xiàn)的罕見癌細(xì)胞表型，而且為檢測(cè)的精準(zhǔn)性和穩(wěn)定性提供了可靠的辦法，有望促進(jìn)生物標(biāo)志物作為非侵入性和無創(chuàng)性的檢測(cè)方法，為BC 患者提供更好的診療措施。

3 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展前景

SCS 在BC 的研究中具有重要的價(jià)值：①揭示正常膀胱組織中新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表型[31]。②揭示促進(jìn)BC發(fā)生發(fā)展的因素，比如：衰老、損傷和炎癥導(dǎo)致的疾病[32-33]；腫瘤干細(xì)胞的起源和異質(zhì)性表達(dá)[34-35]。③揭示BC 在早期上皮細(xì)胞、復(fù)發(fā)后肌層浸潤(rùn)和晚期轉(zhuǎn)移等各個(gè)階段的細(xì)胞亞群[23]，以及相應(yīng)的生物標(biāo)志物[32]和免疫微環(huán)境組分。④提示其他組織器官與BC 具有相似的組織特征，可能為BC 的治療方法提供更多選擇[36]。

隨著scRNA-seq 技術(shù)的不斷進(jìn)步，空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在scRNA-seq 的基礎(chǔ)上，將細(xì)胞遺傳譜系、基因表達(dá)和細(xì)胞分化的分析等二維圖像數(shù)據(jù)整合在三維立體空間中，我們既能看到組織的解剖學(xué)構(gòu)象，也能看到所測(cè)的細(xì)胞類型和關(guān)鍵基因所在的空間定位。這種能夠以簡(jiǎn)明直觀的方式讓人們迅速發(fā)現(xiàn)和理解細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展和作用機(jī)制，推動(dòng)了人們對(duì)臨床標(biāo)本與分子醫(yī)學(xué)結(jié)合應(yīng)用的展望。

此外，近期有人提出“時(shí)空分子醫(yī)學(xué)”的概念，總的來說就是將上述的三維分子醫(yī)學(xué)信息與患者在各個(gè)治療時(shí)間點(diǎn)的臨床資料（病理學(xué)、影像學(xué)、解剖學(xué)和生化檢查等）通過多組學(xué)多信息聯(lián)合分析[37]。這個(gè)方案貫穿了個(gè)體疾病演進(jìn)和治療預(yù)后的各個(gè)階段，有助于對(duì)前文中提到的高復(fù)發(fā)率、耐藥性和難治性BC 患者的個(gè)性化治療提供新的思路。

4 總結(jié)與展望

當(dāng)今的醫(yī)療體系已逐步向分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域轉(zhuǎn)變，摸清致病機(jī)理才能最大限度地發(fā)揮預(yù)防和治療作用。SCS 為我們展現(xiàn)了BC 細(xì)胞的起源遺傳譜系、細(xì)胞亞群的差異性分化、細(xì)胞間相互作用機(jī)制和腫瘤免疫微環(huán)境對(duì)癌組織的影響，拓展了BC 的治療方案。經(jīng)過十幾年的演變，SCS 從最初的設(shè)想到具有強(qiáng)大功能的實(shí)體，再到空間轉(zhuǎn)錄組等新興技術(shù)的產(chǎn)生，加快了人類步入個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療的時(shí)代。