基于氧化應(yīng)激通路的朱砂腎毒性機理研究及針灸對氧化應(yīng)激的緩解作用

胡英華，賈炳超，尚 鑫，于立清，孫 波*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.長春健康職業(yè)學(xué)院，長春 130012）

朱砂的毒性主要源于包括汞在內(nèi)的某些成分在腎臟的蓄積而引起的腎臟功能減退，乃至衰竭[1-2]。由于這種蓄積隨著年齡的增長而增加，所以，朱砂腎毒性機理的研究對于老年人尤為重要。由于細胞凋亡的進程受到多種細胞信號通路的調(diào)控[3]，但前期研究結(jié)果排除了朱砂腎毒性對JNK通路、Caspase-9介導(dǎo)的線粒體信號通路等的影響，同時考慮到重金屬汞離子可以與谷胱甘肽的巰基結(jié)合而影響谷胱甘肽在血液中或臟器中的水平，因此本實驗將朱砂的腎毒性鎖定在與谷胱甘肽水平相關(guān)的氧化應(yīng)激通路[4-5]。

前期的MTT實驗與HE實驗研究結(jié)果已經(jīng)證明，朱砂以及Hg2+和HgS，經(jīng)連續(xù)給藥后均會在不同程度上導(dǎo)致腎臟的病變，并且病變程度與劑量呈同向變化規(guī)律，所以，本研究以SD大鼠為研究對象，將這些物質(zhì)對血液與腎臟中的谷胱甘肽及谷胱甘肽過氧化物酶的影響作為指標，進一步研究朱砂的腎毒性機理。

研究表明，針灸某些穴位可以提高肝臟組織中的谷胱甘肽水平及谷胱甘肽過氧化物酶的活性[6-8]，考慮到腎臟與肝臟之間存在精與血之間相互滋生和相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系，本實驗設(shè)置了針灸對照組，以此來研究針灸對氧化應(yīng)激的緩解作用。

1 實驗材料

1.1 實驗設(shè)備

Sigma臺式高速冷凍離心機；組織勻漿機江蘇金壇江南儀器廠；Mettler Toledo AL204電子分析天平（萬分之一）Agilent 1260高效液相色譜儀美國安捷倫通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平（十萬分之一）梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TD4臺式低速離心機；南凱達科學(xué)儀器有限公司（4 000 r/min）；ODS高效液相色譜柱大連依利特分析儀器有限公司；Sigma臺式高速冷凍離心機德國Sigma公司3K15；FA1004B型電子天平上海佑科儀器儀表有限公司；19686酶標儀美國BIO-RAD伯樂公司。

1.2 實驗藥劑

水飛朱砂（批號：20141213）安國市藥材天然粉貿(mào)易有限公司；硫化汞（分析純）（批號：20160503）北京化工廠；檸檬酸鈉（分析純）（批號：20160708）北京化工廠；乙腈（色譜純）（批號：20160205）Fisher實驗器材有限公司；氫氧化鈉（分析純）（批號：20150107）北京化工廠；高氯酸（分析純）（批號：20161126）天津市鑫源化工有限公司；甲醇（色譜純）（批號：20151117143）山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；磷酸氫二鉀（分析純）（批號：201504021）西隴化工股份有限公司；氯化鈉（分析純）（批號：20160105）北京化工廠；EDTA（分析純）（批號：20160105）天津天泰精細化學(xué)品有限公司；硝酸（優(yōu)級純）（批號：20150508) 北京化工廠；DTNB標準品（批號：D218200）SIGMA-ALDRICH公司；谷胱甘肽標準品（批號：G4251）SIGMA-ALDRICH公司；GSH-P測試盒（批號：20180116）；南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法與結(jié)果

將飼養(yǎng)1周的80只CL級SD大鼠（雌雄各半）按照性別隨機平均分為10組，每組為8只。第1組為雄性空白對照組，第2組為雌性空白對照組，第3組為雄性朱砂（飽和溶液）實驗組，第4組為雌性朱砂實驗組，第5組為雄性HgS（飽和溶液）實驗組，第6組為雌性HgS實驗組，第7組為雄性HgCl2實驗組，第 8 組為雌性 HgCl2（30 μg·mL-1）實驗組，第9組為雄性HgCl2+針灸實驗組，第10組為雌性HgCl2+針灸實驗組。各組實驗大鼠每天稱重1次，并按其實際體質(zhì)量給藥（0.01 mL·g-1），每天給藥2次，早上9點開始，晚上18點開始，第9、10組每天中午12點針灸腎俞和足三里1次。于第16天早上，先經(jīng)眼眶取血，隨后立即頸椎脫臼處死，并迅速取出腎臟稱重，備用。

2.1 腎臟組織及血液中谷胱甘肽水平變化的實驗研究

2.1.1 腎臟組織中谷胱甘肽水平變化的實驗研究 取1/2腎臟，按5:1（V:W）比例將冷藏的A液加入腎臟中，用組織勻漿機制成勻漿，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，用Sigma臺式高速冷凍離心機在-4 ℃下、以14 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min。取上清液適量，按1:3（V:V）比例加入冷藏的B液，渦旋振蕩3 min，然后加入0.5 mL DTNB，渦旋振蕩10 min，于4 000 r·min-1離心10 min，定量取上清液 500 μL，按 10:1（V:V）加入 2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用針式濾器過濾后取10 μL于高效液相色譜儀檢測。實驗結(jié)果見表1、圖1。

表1 各腎臟谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

表1 各腎臟谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組別 雌性谷胱甘肽含量雄性谷胱甘肽含量 平均值朱砂組 116.47±1.10# 120.37±1.14## 118.42±2.28#HgS 組 144.76±1.31## 129.42±2.15## 137.09±8.11##HgCl2組 216.09±0.92## 194.55±0.79## 205.32±11.16##HgCl2+針灸組 217.01±1.45## 195.98±1.10## 206.49±10.93##空白組 114.86±1.42 113.99±1.56 114.43±1.51

圖1 各組腎臟中谷胱甘肽含量

由表1和圖1可以看出，經(jīng)連續(xù)給藥后，無論對于雄性大鼠，還是雌性大鼠而言，各實驗組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽含量相對于空白對照組來講，均有所升高，而且這種變化具有顯著性差異（#P＜0.05，##P＜0.01）。其中，HgCl2+針灸實驗組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽含量的升高最顯著，HgCl2實驗組、HgS實驗組、朱砂實驗組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽含量的升高幅度依次減小。

2.1.2 谷胱甘肽標準曲線的制備 精密稱取5 mg的谷胱甘肽標準品，溶解并定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用pH=7.50的PBS定容，制成濃度為200 ug·mL-1的母液。分別吸取0.2 mL、0.8 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL至10 mL的容量瓶中，用pH=7.50的PBS定容，分別取不同濃度的谷胱甘肽溶液500 μgL，按1:1（V:V）加入DTNB溶液，靜置10 min，用針式濾器過濾后取10 μL于高效液相色譜儀檢測其含量，經(jīng)線性擬合得標準曲線：Y=20.149 45X+ 0.555 25（R2=0.999 99）其中：Y為吸光度，X為濃度。

2.1.3 谷胱甘肽高效液相色譜條件 以0.9%甲酸水溶液（用NaOH調(diào)pH=5.20）與6%四氫呋喃乙腈溶液為流動相，流速0.8 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長326 nm，進樣后按照表2進行梯度洗脫。

表2 谷胱甘肽高效液相色譜條件梯度洗脫時間表

2.1.4 特殊試劑配制 1）A液的配制：取21 mL高氯酸，用去離子水定容100 mL。2）B液的配制：精密稱定6.846 6 g磷酸氫二鉀、0.074 5 g乙二胺四乙酸二鈉、0.588 2 g檸檬酸鈉，加去離子水溶解，配制成100 mL溶液。3）DTNB的配制：精密稱定8.953 5 g十水合磷酸氫二鈉，制成250 mL去離子水溶液，并用檸檬酸調(diào)PH至7.50，備用。精密稱定0.198 2 g的DTNB，加入適量上述磷酸鹽溶液制成100 mL溶液。

2.1.5 血液樣品的制備及谷胱甘肽含量的測定 將經(jīng)眼眶取出的800 μL血置于2 mL EP管中，按1:1（V:V）加入800 μL的DTNB溶液，離心（4 000 r·min-1）10 min，取上清液適量并按10:1（V:V）比例加入冷藏的A液，渦旋振蕩5 min，于4 000 r·min-1再離心10 min，取10 μL上清液于高效液相色譜儀測其谷胱甘肽含量。實驗結(jié)果見表3、圖2。

表3 各組血液中谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

表3 各組血液中谷胱甘肽含量（±s，n=8） μg·g-1

組別 雌性谷胱甘肽含量雄性谷胱甘肽含量 平均值朱砂組 5.78±0.75 5.93±0.59 5.86±0.65 HgS 組 5.59±0.85 6.01±0.74 5.80±1.19 HgCl2組 5.90±0.52 5.82±1.03 5.86±1.80 HgCl2+ 針灸組 5.82±0.72 5.97±0.97 5.80±0.75空白組 5.34±1.46 5.75±1.87 5.55±1.48

圖2 各組血液中谷胱甘肽含量

由表3和圖2可以看出，經(jīng)連續(xù)給藥后，無論是雄性大鼠，還是雌性大鼠，各實驗組大鼠血液中的谷胱甘肽水平相對于空白對照組來講均無明顯變化（P＞0.05）。

2.2 腎臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶的活力的實驗研究

2.2.1 腎臟樣品的制備及谷胱甘肽過氧化物酶的活力的測定 將2.1.1余下的1/2腎臟稱重，并按1:8（W:V）比例加入冷藏的生理鹽水，用組織勻漿機制成勻漿，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，于-4℃、3 000 r·min-1的條件下離心15 min，取出上清溶液，備用。

取5 μL，加入酸性染色液5 mL，靜置10 min后，用酶標儀于595 nm的波長下測定吸光度，并據(jù)此分析樣品中總蛋白的含量。

另取上清液0.1 mL，按下表加入試劑盒中的試劑1與試劑2。

?

混勻，-4℃、4 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL，并按下表加入試劑盒中的試劑3～5作顯色反應(yīng)。

?

混勻，室溫靜置15 min，待顯色反應(yīng)達成平衡后，用酶標儀于412 nm波長下測量其吸光度，并據(jù)此分析谷胱甘肽過氧化物酶的活力，結(jié)果見表4、圖3。

表4 各組腎臟谷胱甘肽過氧化物酶酶活力（±s，n=8）

表4 各組腎臟谷胱甘肽過氧化物酶酶活力（±s，n=8）

注：與空白組比較，## P＜0.01

組別 雌性GSH過氧化物酶酶活力雄性GSH過氧化物酶酶活力 平均值朱砂組 36.53±0.67## 36.40±1.12## 36.46±0.89##HgS 組 36.10±0.98## 36.99±1.16## 36.55±1.14##HgCl2組 34.84±0.71## 34.46±0.67## 34.65±0.69##HgCl2+針灸組 37.72±0.16## 38.24±028## 37.98±0.34##空白組 38.24±0.73 39.93±0.91 39.09±1.18

圖3 各組谷胱甘肽過氧化物酶酶活力測定數(shù)據(jù)

由表4和圖3可以看出，經(jīng)連續(xù)給藥后，無論對于雄性大鼠，還是雌性大鼠而言，各實驗組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽過氧化酶活力均有明顯降低，而且這種變化還具有顯著性差異（##P＜0.01）。其中，HgCl2實驗組大鼠腎臟組織中的谷胱甘肽過氧化酶活力的降低最顯著，HgS實驗組、朱砂實驗組、HgCl2+針灸實驗組谷胱甘肽過氧化酶活力下降值依次減小。

2.2.2 標準蛋白曲線的制備 精密稱定牛血清白蛋白2 mg，加去離子水制成0.2 mg·mL-1的母液。再精密量取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL，分別置于5 mL的EP管中，加去離子水至總體積為1 mL，分別再加入G-250試劑（酸性染色液）5 mL，立即混勻，靜置10 min后以1號的EP管為空白對照，在595 nm的波長處測定吸光度。以X表示總蛋白含量為橫坐標，Y表示吸光度值，得線性回歸方程：Y=0.002 5X+ 0.208（R2=0.997 6）

3 討論

經(jīng)過長期的對朱砂毒性研究，幾乎所有的參與者都達成了這樣的共識，給予實驗動物的供試品中，可溶于水的Hg2+含量越高，經(jīng)連續(xù)給藥后，實驗動物腎臟組織中Hg2+的含量就會越高。這一結(jié)論可以從生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)理論中找到依據(jù)，因為朱砂中的主要毒性成分汞是以可溶于水的Hg2+形式、按照微孔途徑的被動轉(zhuǎn)運機理透過胃腸道生物膜而被吸收進入血液，并以同樣的轉(zhuǎn)運機理分布于包括腎臟在內(nèi)的機體相關(guān)組織中，所以，供試品中Hg2+的濃度與實驗動物腎臟組織中Hg2+的含量成正比。然而，與這一結(jié)果相符的應(yīng)該是“腎臟組織中Hg2+的含量越高，谷胱甘肽的水平就應(yīng)該越低”，因為谷胱甘肽可以與包括Hg2+在內(nèi)的重金屬離子形成配合物而排出體外。但是，這一推測顯然不符合表1和圖1中的數(shù)據(jù)顯示的實驗結(jié)果。

成熟的理論表明，谷胱甘肽以還原型（GSH）及其氧化型（GSSG）兩種形式廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物細胞內(nèi)，并以GSH/GSSG比例遠超過10:1來維持生物或植物的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡，以此將活性氧（ROS）控制在較低的水平，使之精密地調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、癌變及基因的表達。當GSH/GSSG比例明顯減小時，活性氧（ROS）的水平就會升高，其調(diào)節(jié)功能亦隨之而降低，從而使細胞受到損傷。由此可以推測，腎毒性最強的HgCl2組腎臟組織中的谷胱甘肽水平應(yīng)該最低。這樣推測的結(jié)果顯然也與表1和圖1中數(shù)據(jù)顯示的實驗結(jié)果不相符。

表4 和圖3實驗數(shù)據(jù)顯示，谷胱甘肽過氧化酶（GPX4）活力的實驗結(jié)果給出了上述兩個問題的答案。谷胱甘肽過氧化物酶活性是谷胱甘肽還原體內(nèi)脂質(zhì)氧化物的重要標志，其活性高，表明有足夠量的還原型谷胱甘肽參與機體的正常生理活動；而其活性低則表明谷胱甘肽沒有作為還原劑起到還原作用，GSH/GSSG比例明顯下降，使得GSH沒有作為還原劑來維持氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡。在一般的生理環(huán)境下，還原型谷胱甘肽所占的比例減小的原因無非就是形成了氧化型谷胱甘肽。然而，在Hg2+存在的條件下，還原型谷胱甘肽還可以其巰基上的孤對電子向Hg2+的空d軌道配位，形成了比較穩(wěn)定的配合物。而這種配合物的形成無疑會導(dǎo)致游離型谷胱甘肽的減少，進而造成腎臟的氧化應(yīng)激性損傷。

按照一般規(guī)律，重金屬離子與谷胱甘肽結(jié)合后便會排出體外，也正因為如此，各實驗組大鼠血液中的谷胱甘肽水平均應(yīng)該低于對照組。然而，生成于腎細胞內(nèi)部的這種配合物卻很難以被動轉(zhuǎn)運的方式排出體外，所以才導(dǎo)致了與谷胱甘肽生成配合物的Hg2+在腎臟的蓄積。由于這種蓄積影響了細胞的正常的內(nèi)部環(huán)境，因而也是導(dǎo)致腎細胞死亡的重要因素之一。

由實驗結(jié)果可以看出，雖然HgCl2+針灸實驗組大鼠腎臟的谷胱甘肽水平基本同于HgCl2實驗組，但是HgCl2+針灸實驗組大鼠腎臟的谷胱甘肽過氧化酶活性卻僅低于對照組。這一實驗結(jié)果表明，雖然HgCl2+針灸實驗組大鼠腎臟的谷胱甘肽總量與HgCl2實驗組大鼠腎臟的谷胱甘肽總量相近，但HgCl2+針灸實驗組大鼠腎臟游離的谷胱甘肽所占的比例較高。由此可見，針灸刺激某些特殊穴位，如腎俞和足三里，可以提高谷胱甘肽過氧化物酶的活力，增強活性氧對谷胱甘肽的競爭力，同時減少谷胱甘肽與Hg2+形成配合物的比例，這無疑會在一定程度上促進谷胱甘肽作為還原劑參與腎臟細胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，進而對朱砂以及Hg2+造成的氧化應(yīng)激起到一定的緩解作用。這一研究結(jié)果為臨床上采用針灸方法對抗連續(xù)使用含有朱砂的制劑引起的腎臟損傷提供了依據(jù)。