實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸結果分析

汪鵬

摘要：目的：回顧分析實時熒光RT-PCR檢測法在新型冠狀病毒核酸檢測中的效果。方法：對轄區(qū)內276例疑似新型冠狀病毒感染者的采集樣本以及檢測結果進行回溯性分析，所有納入研究的案例樣本均使用實時熒光RT-PCR檢測法進行檢驗，對比分析檢測結果。結果：在確診案例的三種標本采樣方式中咽拭子樣本的陽性與陰性檢出結果數據分別為36（55.38%）、29（44.62%），鼻拭子樣本的陽性與陰性檢出結果數據分別為41（60.29%）、27（39.71%），痰液樣本的陽性與陰性檢出結果數據分別為40（56.34%）、31（43.66%）;在無癥狀確診患者中陽性與陰性檢測結果數據分別為11（31.43%）、24（68.57%），在輕癥確診患者中陽性與陰性檢測結果數據分別為28（57.14%）、21（42.86%），在重癥確診患者中陽性與陰性檢測結果數據分別為58（62.37%）、35（37.63%），在極重癥確診患者中陽性與陰性檢測結果數據分別為17（62.96%）、10（37.04%）（P<0.05）。結論：熒光RT-PCR檢測法對新型冠狀病毒的檢測速率較高，適合臨床大范圍多人口檢測。

關鍵詞：實時熒光RT-PCR;檢測方法;新型冠狀病毒;核酸結果分析

【中圖分類號】 R511 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）09--01

前言

新型冠狀病毒是于2019年12月開始在全世界范圍內出現大基數傳播且危害性較高的傳染病毒，臨床以呼吸道感染、肺炎形式作為病癥表現，在檢測方式上由于受檢范圍以及受檢人口基數數量較多，需要檢測效率較高的方式進行臨床檢測，此次調研以目前應用較為普遍的熒光RT-PCR檢測法作為主體，希望了解其在新型冠狀病毒檢測中的應用效果。

1. 資料與方法

1.1臨床資料

從國家疾病防控信息系統(tǒng)中選取轄區(qū)內所有采集的疑似新型冠狀病毒感染者276例作為研究主體進行回溯性分析，所有納入案例均為2019年12月至2021年12月期間采集標本案例，在284例受檢者的采樣方式中，有咽拭子采樣檢查者92例，鼻拭子采樣檢查者92例以及痰液采樣檢查者92例，受采集者中共有男性141例，女性135例，所有受檢者中最少采樣1次，最多采樣13次，其中伴有發(fā)熱、咳嗽、流涕等癥狀者182例，無明顯癥狀者94例，年齡范圍中最低齡患者21歲，最高齡患者63歲，平均年齡為（46.26±14.18）歲，所有受檢者受檢時新冠疫苗接種情況中，未接種者59例，接種1針者105例，接種2針者78例，接種3針者34例;已使用數據分析軟件對所有受檢者已知前置資料進行比對分析，確定組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

納入標準：由醫(yī)院臨床或疾病防控中心收錄入管控記錄系統(tǒng)的受檢案例，可持續(xù)追蹤且具有持續(xù)追蹤記錄的案例，確診者具有詳細治療以及跟隨檢查記錄的案例。

排除標準：信息收錄不完整的案例，信息收錄有誤或有疑問的案例，既往新型冠狀病毒感染史者，病史不明、家族病史情況不明的案例。

1.2方法

所有受檢者標本均使用實時熒光定量RT-PCR進行檢測實驗，標本采集人員均在接受三級防護情況下按采集標準流程進行鼻腔、咽喉以及痰液體液采集，放入密封袋后分批次集中交由轉運者，標本接收以及轉運者均于采取二級防護下恒溫穩(wěn)定轉運進入傳染病檢驗實驗室，檢驗者對所有采集標本外裝密封袋進行75%乙醇噴灑與擦拭消毒以及信息核對后確認接受并進行預處理，預處理過程中將所有采集標本進行滅活，置入提前56°C預熱的水浴箱中30-45min，每10min輕微振蕩標本，滅活后打開密封袋再次進行試管表面消毒，根據檢驗計劃與待檢標本數量進行分類處理，將不能立即檢驗的標本放置于4°C環(huán)境下進行保存，標本最長待檢時間不超過24h;將鼻、咽拭子以及痰液標本取出加入1-2mL生理鹽水充分振蕩混勻后靜置10min，加入100μL蛋白酶K，再次充分振蕩靜置10min，取上清液200μL加入核酸提取試劑預裝板中靜置10min后放置在核酸提取儀上進行核酸提取，儀器程序運轉完成后將核酸置于離心管中，可立即進行進行熒光定量RT-PCR檢測的樣本可臨時存放于-20°C環(huán)境中，需要分批次進行檢測的樣本需要置于-70°C環(huán)境中進行保存;熒光定量RT-PCR檢測使用新冠病毒核酸檢驗試劑進行PCR擴增，低溫保存樣本需要先行室溫解凍，融解混勻后再行擴增，17（PCR反應液）：3（Taq酶）配比反應液20μL每份分裝至反應管中，并將樣本置入進行檢測，設置擴增程序15min-50°C、15min-95°C，15s-94°C、45s-55°C，循環(huán)45個，最終結果判定標準CT值>40同時Cy5可見擴增、FAM以及VIC無擴增為陰性，CT值≤40同時可見明顯擴增為陽性，單一通道CT≤40者需要復檢，復檢結果相同者為陽性[1-2]。

1.3觀察指標

對比確診案例中不同采集方式下的陽性率情況，對比確診案例中不同癥狀程度患者的陽性檢出率。

1.4統(tǒng)計學分析

整體使用SPSS 28.0數據分析軟件進行數據統(tǒng)計整合與分析處理，%作為數據統(tǒng)計形式時x2進行后續(xù)檢驗，當P<0.05表示對比項目有統(tǒng)計學意義。

2. 結果

2.1在所有確診案例中咽拭子樣本陽性率55.38%，鼻拭子陽性率60.29%，痰液樣本陽性率56.34%，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），具體見表1。

2.2在不同癥狀程度確診患者的陽性檢出率中可見癥狀表現越嚴重者陽性檢出率越高，組間差異有效（P<0.05），具體見表2。

3.討論

通過對轄區(qū)內既往檢測案例結果的回溯性分析中發(fā)現實時熒光RT-PCR檢測法在新型冠狀病毒核酸檢測的鼻拭子采集樣本陽性檢出率以及重癥、極重癥患者的陽性檢出率更高;在臨床中新型冠狀病毒采集方式主要包括鼻拭子、咽拭子、痰液、糞便等，此次調研以應用頻率最高的鼻拭子、咽拭子以及痰液作為研究區(qū)分項，通過比對發(fā)現痰液以及咽拭子陽性檢出率低于鼻拭子的原因在于咽拭子與痰液所采集的干擾物較多，在痰液中唾液以及其他相關粘液組織較多，在檢測時可能出現均質化效果較差或需要反復采樣重復檢測的情況，臨床檢驗效率較低，而咽拭子的采樣常由于受檢者對檢測知識了解程度較低，常出現采集前進食、飲水甚至飲酒的情況，對于采樣標本有效率具有嚴重影響，所以鼻拭子在三種采集方式中的樣本質量較高;在癥狀程度中，多數情況下臨床中癥狀表現程度越嚴重的患者意味著體內存活病毒數量越多，所以其陽性檢出率越高[3]。

整體情況中可見熒光RT-PCR檢測法對于新型冠狀病毒的檢出率并不十分令人滿意，但由于其實時檢測性質以及檢測效率對于這類流行傳染病的傳播范圍以及傳播效率的檢測實施更為高效，所以在臨床中的大范圍普查仍建議采用熒光RT-PCR檢測法進行檢測。

參考文獻：

[1]盧婷，陳雨欣，沈瀚.4例COVID-19患者不同類型標本的SARS-CoV-2核酸及抗體檢測結果分析[J].臨床檢驗雜志，2020，38（6）：2.

[2]查毅，蔣玲玉，簡玲，等.實時熒光定量RT-PCR對新型冠狀病毒3種不同生物學樣本檢出率的比較[J].中華臨床實驗室管理電子雜志，2021，9（1）：5.

[3]Brunelle S L，Bird P M，Jeremy B，et al.Comparison of the Modified Centers for Disease Control and Prevention 2019-Novel Coronavirus Real-Time RT-PCR Method for Detection of Infectious and Heat-Inactivated Virus on Stainless Steel[J].Journal of AOAC International，2021（4）：4.