基于高分辨質(zhì)譜的甲基化心磷脂高通量分析方法的建立和應(yīng)用

焦玉佩，王雪穎，許麗娜，王昱淞，劉紫琪，劉曉蕙*

（1.清華大學(xué) 蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心，北京 100084；2.清華大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100084）

心磷脂（Cardiolipin，CL）廣泛存在于高等動物、植物和微生物界，在高等動物的心肌中甚至占總磷脂的15%，發(fā)揮著調(diào)節(jié)線粒體功能和氧化應(yīng)激的作用［1-2］。心磷脂幾乎完全位于線粒體內(nèi)膜上，在電子傳導(dǎo)、三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生、能量代謝及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮了重要作用，是線粒體氧化磷酸化所必需的磷脂［3-5］。此外，在線粒體凋亡的不同階段和線粒體膜動力學(xué)中，心磷脂均發(fā)揮著不可替代的作用［6-7］。糖尿病和心力衰竭等常見疾病與心磷脂含量或組成的變化息息相關(guān)［8］。巴氏綜合癥，作為一個心磷脂代謝缺陷疾病，為研究者提供了研究心磷脂代謝和調(diào)節(jié)異常的模型，為探索疾病病理學(xué)提供了動機［9］。因此，通過對心磷脂的定量檢測有助于了解心磷脂的代謝調(diào)控機制，進(jìn)一步闡明發(fā)病機理，從而對靶向治療相關(guān)疾病提供一定的技術(shù)支持。

心磷脂作為一種雙磷脂酰甘油分子，由4條不同長度、不同飽和度的脂肪酸鏈和1分子的三甘油骨架構(gòu)成。心磷脂的檢測方法有直接注射質(zhì)譜法［10-11］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［12-14］等，這些傳統(tǒng)方法均是在負(fù)離子模式下基于心磷脂不同脂肪酸鏈的斷裂進(jìn)行定性定量分析。心磷脂的4種不同脂肪酸鏈的排列組合，使得數(shù)據(jù)分析變得異常困難。由于不同長度、不同飽和度脂肪酸鏈的離子化效率差異和高豐度物質(zhì)的離子抑制作用，導(dǎo)致低豐度物質(zhì)的定量會受到一定影響［15］。同時，該模式下心磷脂存在單電荷、雙電荷2種價態(tài)，使心磷脂的檢測靈敏度也有所降低。液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的方法通常采用數(shù)據(jù)依賴采集模式（DDA）記錄二級譜圖，由于掃描速度的限制，一般每個時間點只會采集10～20張二級譜圖。導(dǎo)致很多低豐度的化合物會丟失二級碎片信息，因此此類化合物很難進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定。

甲基化方法已廣泛應(yīng)用于磷脂的檢測，且甲基化可以明顯提高磷脂化合物的響應(yīng)信號［16-19］。本研究基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，將甲基化反應(yīng)用于心磷脂的檢測中，提高了心磷脂的檢測靈敏度；同時依據(jù)甲基化后標(biāo)準(zhǔn)品的二級碎裂規(guī)律，預(yù)測甲基化心磷脂的特征性二級碎片并建立了本地數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)了生物體復(fù)雜樣品中心磷脂的高通量定性與定量分析，對于在線粒體中發(fā)現(xiàn)的特異性低豐度心磷脂檢測有很大的應(yīng)用潛力。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 300 超高效液相色譜系統(tǒng)、Q-Exactive HF 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；F6/10-4G 超細(xì)勻漿器（上海弗魯克公司）；TDZ4 常溫臺式低速離心機（湖南湘儀公司）；EYELA MG-2200 氮吹儀（上海愛朗儀器公司）；VELP SCIENTIFICA 渦旋儀（意大利VELP公司）；ME104電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

心磷脂標(biāo)準(zhǔn)品：CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）、CL（16∶0/16∶0/16∶0/16∶0）和CL（18∶1/18∶1/18∶1/18∶1）（美國Avanti 公司）；水、異丙醇、甲醇、乙腈、氯仿、甲基叔丁基醚（MTBE）（均為色譜純，美國Honeywell 公司）；乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁試劑公司）；衍生化試劑三甲基硅烷化重氮甲烷（TMS，2.0 mol/L 己烷溶劑）、冰乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 脂質(zhì)提取及甲基化反應(yīng)

1.2.1 心磷脂的提取取C57BL/6 小鼠腦組織約100 mg 于4 mL 離心管中，按每100 mg 組織加入約1 365 μL的甲基叔丁基醚∶甲醇∶2 mol/L 鹽酸溶液（200∶60∶13，體積比）［20］，樣本在室溫下勻漿3次（每次勻漿10 s，間歇10 s）并靜置15 min，每5 min 渦旋振蕩30 s。之后加入250 μL 0.1 mol/L HCl 進(jìn)行萃取。充分抽提后，12 000 g 常溫離心20 min，等體積取出上層有機相，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中并用氮氣吹干備用。

1.2.2 甲基化反應(yīng)向上述備用樣品中加入400 μL 甲基叔丁基醚∶甲醇（20∶6，體積比）和50 μL TMS，渦旋混勻，在室溫下反應(yīng)20 min進(jìn)行甲基化［21］，每5 min渦旋振蕩30 s。隨后加入5 μL冰乙酸終止反應(yīng)，樣本顏色變?yōu)闊o色。加入92 μL水，渦旋混勻，靜置分層，于12 000 g 常溫離心20 min，取上層液于上樣瓶中待檢測。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜分析條件液相色譜條件：Cortecs C18色譜柱（1.6 μm×2.1 mm×100 mm，美國Waters 公司）；柱溫：40 ℃；流速：0.22 mL/min；流動相：A 為乙腈/水（60∶40，含10 mmol/L 乙酸銨）；B 為異丙醇/乙腈（90∶10）。線性梯度洗脫：0～3 min，40% B；3～23 min，40%～98% B；23～30 min，98%B；30～30.5 min，98%～40%B；30.5～35 min，40%B；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：加熱電噴霧離子源（HESI），離子傳輸管溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣：35 arb；輔助氣：10 arb；掃描模式：數(shù)據(jù)依賴型掃描模式（Full MS/dd-MS2），一級質(zhì)譜分辨率為60 000 FWHM，二級質(zhì)譜分辨率為15 000 FWHM；正、負(fù)離子模式的噴霧電壓分別為3.0、2.8 kV，掃描范圍：m/z500～1 800。

1.2.4 Tracefinder 軟件定性定量的參數(shù)基于商業(yè)軟件Tracefinder 3.3（Thermo Fisher Scientific，CA）系統(tǒng)，根據(jù)心磷脂的母離子和特征子離子的精確質(zhì)量數(shù)信息建立本地數(shù)據(jù)庫。一級和二級質(zhì)譜的質(zhì)量精度分別設(shè)置為8、15 ppm，通過選擇相同質(zhì)荷比（m/z）下的最高色譜峰，積分得到對應(yīng)的色譜峰峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲基化后心磷脂的高分辨高通量分析流程

2.1.1 心磷脂的甲基化反應(yīng)三甲基硅烷化的甲基化反應(yīng)是在磷脂的磷酸基團(tuán)羥基位點進(jìn)行，從而改變磷脂的化學(xué)性質(zhì)，其反應(yīng)機理如圖1所示。以TMS為衍生化試劑，甲基叔丁基醚∶甲醇（20∶6）為反應(yīng)溶劑，在室溫條件下反應(yīng)20 min。

圖1 心磷脂TMS衍生化反應(yīng)示意圖Fig.1 Chemical reaction of methylation for cardiolipins R1，R2，R3 and R4 represent each fatty acid chains

結(jié)合高分辨質(zhì)譜儀的分析手段，本研究建立了一種包含本地數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的甲基化心磷脂高通量分析方法，可以高效完成心磷脂的定性與定量，分析流程如圖2所示。

圖2 甲基化心磷脂的高通量定性定量流程圖Fig.2 High-throughput qualitative and quantitative workflow of methylated cardiolipins

2.1.2 甲基化后心磷脂的色譜與質(zhì)譜行為以標(biāo)準(zhǔn)品CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）為例，考察了甲基化反應(yīng)前后心磷脂的色譜行為。結(jié)果顯示，心磷脂在正、負(fù)離子模式下均有一定的響應(yīng)信號，且負(fù)離子模式的信號強度高于正離子模式。而甲基化后，相同濃度下心磷脂的信號強度比甲基化前提高了近10倍。

在高通量的脂質(zhì)分析中，脂質(zhì)的定性主要依賴于二級質(zhì)譜碎片的匹配。但商業(yè)甲基化心磷脂數(shù)據(jù)庫缺乏，因此，建立高通量的甲基化心磷脂本地數(shù)據(jù)庫迫在眉睫。本研究以心磷脂標(biāo)準(zhǔn)品CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）、CL（16∶0/16∶0/16∶0/16∶0）、CL（18∶1/18∶1/18∶1/18∶1）為例，其中加和離子正離子為［M+NH4］+，負(fù)離子為［M+CH3COO］-。通過提取甲基化后的二級質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)：正離子模式二級質(zhì)譜圖中，甲基化后的14∶0 心磷脂（圖3A）、16∶0 心磷脂（圖3C）和18∶1 心磷脂（圖3E）以中性丟失羥甲基磷酸甘油后剩下的碎片為特征性離子碎片，分別為m/z495.439 97、551.502 62 和603.533 51。負(fù)離子模式二級質(zhì)譜圖中，甲基化后的14∶0心磷脂（圖3B）、16∶0心磷脂（圖3D）和18∶1心磷脂（圖3F）以脂?；跢A（14∶0）-H］、［FA（16∶0）-H］、［FA（18∶1）-H］以及中性丟失［C3H6O］后剩下的碎片為特征性離子碎片，分別為m/z227.200 85、605.416 81；255.232 59、661.481 57；281.248 08、713.513 67。

圖3 甲基化后標(biāo)準(zhǔn)品14∶0心磷脂、16∶0心磷脂、18∶1心磷脂在正離子模式（A、C、E）和負(fù)離子模式（B、D、F）的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of Me-CL（14∶0）4，Me-CL（16∶0）4 and Me-CL（18∶1）4 in positive（A，C，E）and negative（B，D，F(xiàn)）mode purple lines displays collision induced fragments generated in positive mode and red lines are fragments in negative mode

2.1.3 甲基化心磷脂本地數(shù)據(jù)庫的建立由于甲基化心磷脂在正離子和負(fù)離子二級質(zhì)譜圖中均呈現(xiàn)特有的碎裂規(guī)律，因此，利用該碎裂規(guī)律預(yù)測了約780 個含有不同心磷脂分子的特征性二級碎片，并建立了本地數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫中包含了預(yù)測的一級精確m/z及正、負(fù)離子模式下的二級特征碎片。其一級和二級質(zhì)譜的精確m/z計算方法如表1 所示，其中a、b、x和y分別為4 條脂肪酸鏈的碳原子個數(shù)，m、n、s和t為各?；湹碾p鍵個數(shù)。各元素的精確質(zhì)量數(shù)如下：C 為12.000 00；H 為1.007 83；O 為15.994 91；N為14.003 07；P為30.973 76；質(zhì)子為1.007 28。

表1 甲基化心磷脂的一級、二級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)的計算方法Table 1 Algorithm to calculate exact precursors and featured fragments of methylated cardiolipins for lipid identification

Tracefinder軟件系統(tǒng)基于本地數(shù)據(jù)庫的化合物二級鑒定，首先進(jìn)行一級質(zhì)譜精確m/z的匹配。其中加和離子正離子為［M+NH4］+，負(fù)離子為［M+CH3COO］-。在一級質(zhì)量數(shù)匹配的基礎(chǔ)上，進(jìn)行二級質(zhì)譜碎片信息的鑒定。正離子的特征性碎片信息得到兩條脂肪酸鏈的加和，而相同色譜保留時間下負(fù)離子的特征性碎片又豐富了每條脂肪酸鏈的信息。兩種模式得到的數(shù)據(jù)結(jié)果可以實現(xiàn)心磷脂的高通量定性篩選和準(zhǔn)確定量分析。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)實驗室的前期研究［22-23］，心磷脂的疏水性較強，C18色譜柱條件下的出峰時間比較靠后。因此，為了提高心磷脂的檢測效率，以標(biāo)準(zhǔn)品CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）為例，對比了流動相B 相不同起始洗脫梯度（40%、50%、60%）時，正、負(fù)離子模式下甲基化心磷脂的峰面積。由圖4 可知，隨著起始洗脫梯度的升高，甲基化心磷脂的色譜保留時間逐漸前移，但豐度逐漸減小。為盡可能地檢測低豐度的化合物，實驗選取40%的起始洗脫梯度作為最佳色譜條件。

圖4 不同起始洗脫梯度下甲基化心磷脂在正（上）、負(fù)離子（下）模式的信號響應(yīng)強度Fig.4 Intensity of methylated cardiolipin under positive（up）and negative（down）mode at different initial elution gradients A：40%；B：50%；C：60%

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 衍生化效率為考察心磷脂甲基化方法的重復(fù)性和可靠性，以標(biāo)準(zhǔn)品CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）為例，選取了一系列的質(zhì)量濃度進(jìn)行衍生化效率評估，通過衍生化后的未甲基化CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0） 豐度與衍生化前CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）的豐度比值來計算衍生化效率。表2結(jié)果顯示，不同濃度下的衍生化效率均在99%以上。

表2 不同濃度下CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）的衍生化效率Table 2 Derivatization efficiency of CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）at different concentrations

2.3.2 精密度、線性范圍以及靈敏度稱取約2.0 mg 的CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）標(biāo)準(zhǔn)品，以甲基叔丁基醚∶甲醇（20∶6）為溶劑，配制2 mg/mL 的CL（14∶/14∶0/14∶0/14∶0）標(biāo)準(zhǔn)品母液，并將其稀釋至80、800 ng/mL。按照“1.2.2”方法進(jìn)行甲基化反應(yīng)，上機檢測。每個濃度選取3 個生物重復(fù)，連續(xù)運行序列3 d，得到80、800 ng/mL 濃度下的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.2%和1.9%，日間RSD 分別為9.3%和15%，準(zhǔn)確度（以測量值與真值的相對誤差表示）分別為10.2%和9.9%。結(jié)果表明，該方法可以滿足日常的檢測需求。

按照“1.2.1”方法，選取小鼠腦組織提取的脂質(zhì)樣本作為空白基質(zhì)，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）母液，分別配制成1 ng/mL～20 μg/mL 的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，分成2 份。一份直接上機檢測，另一份按照“1.2.2”方法進(jìn)行甲基化反應(yīng)后上機檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明：甲基化后的14∶0 心磷脂在0.010～20 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，線性方程為Y=350 731+842 203.5X（r2=0.994 3），權(quán)重因子1/X；在腦基質(zhì)中，CL（14∶0/14∶0/14∶0/14∶0）的定量下限（LOQ，S/N= 10）為10 ng/mL。而未甲基化的14∶0 心磷脂的線性范圍為0.2～50 μg/mL，線性方程 為Y= -3 334 890 + 20 441.8X（r2= 0.996 1），權(quán)重因子1/X，LOQ 為200 ng/mL。同時，通過數(shù)據(jù)庫檢索匹配發(fā)現(xiàn)，直接上機檢測的腦組織可檢測到30 種心磷脂，而甲基化后的腦組織樣品可檢測到43 種化合物。因此，甲基化對痕量心磷脂樣品的檢測具有很大優(yōu)勢。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差選取“2.3.2”中標(biāo)準(zhǔn)溶液的低、中、高3 個濃度點進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)和加標(biāo)回收實驗。每個濃度做3個重復(fù)，計算基質(zhì)效應(yīng)、平均回收率和RSD（表3）。結(jié)果表明，3 個加標(biāo)水平下的基質(zhì)效應(yīng)差異不大，在1.0～1.4 之間，說明基質(zhì)對于分析物均有一定的促進(jìn)作用。Me-CL（14∶0）4的平均回收率為92.8%～119%，RSD為6.0%～14%。

表3 Me-CL（14∶0）4 在小鼠腦組織樣品中的基質(zhì)效應(yīng)、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 3 Matrix effects，average recoveries and relative standard deviations（RSD）of Me-CL（14∶0）4 in mouse brain tissues（n=3）

2.4 實際樣本的檢測

通過上述甲基化方法分別對24 周齡（Young）和48 周齡（Old）的野生型C57BL/6 雄性小鼠的腦組織進(jìn)行心磷脂的差異化分析，每組各選取3 只小鼠，原始數(shù)據(jù)基于甲基化心磷脂的本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。本實驗共鑒定到43 種心磷脂分子，選取兩組間有差異的21 種心磷脂分子（P＜0.05）進(jìn)行熱圖分析（圖5），結(jié)果表明，老齡化小鼠與年輕小鼠腦組織中的心磷脂均呈現(xiàn)顯著的下調(diào)趨勢，心磷脂含量分布有明顯差異。結(jié)合前期研究成果［24］，小鼠腦組織中心磷脂的脂肪酸鏈組成主要集中在脂肪酸鏈FA（16∶0）、FA（16∶1）、FA（18∶1）、FA（20∶4）、FA（22∶6）。由此可以推斷，在小鼠衰老過程中腦組織中的脂肪酸鏈發(fā)生了重排，且FA（20∶4）、FA（22∶6）長鏈多不飽和脂肪酸呈現(xiàn)下降趨勢。

圖5 24和48 周齡小鼠腦組織的心磷脂熱圖Fig.5 Heatmap of cardiolipin in mouse brain at 24 and 48 weeks*：P ＜0.05，**：P ＜0.01，***：P ＜0.001

3 結(jié) 論

本研究建立了基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜的甲基化心磷脂檢測方法，并通過心磷脂標(biāo)準(zhǔn)品甲基化后的二級碎裂規(guī)律，開發(fā)了可對心磷脂進(jìn)行高通量定性及定量分析的本地數(shù)據(jù)庫。該方法具有較好的靈敏度、線性范圍、精密度，對于痕量心磷脂樣品的檢測具有很大優(yōu)勢。檢測了24 和48 周齡的C57BL/6小鼠衰老模型中的腦組織，成功篩選出21種心磷脂分子。在48周小鼠的腦組織中，多個含F(xiàn)A（20∶4）、FA（22∶6）多不飽和脂肪酸鏈的心磷脂分子含量明顯低于24 周小鼠，預(yù)示FA（20∶4）、FA（22∶6）多不飽和脂肪酸的代謝在衰老過程中發(fā)生了重排并呈下降趨勢。