基于核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)比較不同產(chǎn)地鐵棍山藥的化學(xué)成分差異

魏 亮，張超楠，李科研，位婷婷，祁少可，王艷麗*，王 強(qiáng)，2，3*

（1.河南省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院 國家衛(wèi)健委出生缺陷預(yù)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；3.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南 新鄭 450064；4.河南廣電計(jì)量檢測有限公司，河南 鄭州 450001）

山藥是薯蕷科植物的干燥根莖，屬多年生纏繞草本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等作用［2］。山藥大致可分食用、藥用兩類［3］，食用山藥稱薯，廣泛分布于非洲、亞洲、南美洲部分地區(qū)以及加勒比海和南太平洋的島嶼，是熱帶和亞熱帶地區(qū)人們的主食［4］。我國食用山藥主要分布在南方諸省，藥用山藥分布較北，主要以河南、山西、山東、河北為主［5］。此外，在朝鮮、日本等國也有分布［6］，并形成了地方品種。

道地藥材是指經(jīng)過中醫(yī)臨床長期應(yīng)用篩選出來的，產(chǎn)自特定地區(qū)，通過特定生產(chǎn)過程，較其他地區(qū)所產(chǎn)同種藥材質(zhì)優(yōu)效佳的藥材，它是優(yōu)質(zhì)中藥材的代名詞，其質(zhì)量優(yōu)劣與后續(xù)臨床用藥療效直接相關(guān)［7-8］。山藥自明代以后的道地產(chǎn)地逐漸集中到河南古懷慶府，即懷山藥?！侗静菝审堋吩疲骸澳媳笨ぞ惝a(chǎn)，惟懷慶者獨(dú)良”［9］?！侗静菰肌吩唬骸敖袢硕嘤脩褢c者，肉白指喜細(xì)，緊實(shí)者入藥”［10］。20 世紀(jì)30 年代《藥物出產(chǎn)辨》更是明確山藥“產(chǎn)河南懷慶府、沁陽、武陟、溫孟4 縣”［11］。懷山藥是地理標(biāo)志產(chǎn)品［12］。鐵棍山藥是懷山藥中的一種，被認(rèn)為是其中的極品［13］。

傳統(tǒng)上，道地藥材用眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等主觀的性狀鑒別來判定，而現(xiàn)代多采用高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜等設(shè)備利用化學(xué)指紋圖譜對道地藥材進(jìn)行鑒別［14］。本小組在前期研究中比較了溫縣鐵棍山藥與山東、山西種植鐵棍山藥以及山東、河北地方品種山藥中化學(xué)成分的差異以及鑒別方法［15］，本文則比較了沁陽、武陟、溫縣、孟州4地壚土地和沙土地產(chǎn)鐵棍山藥之間的化學(xué)成分差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

400 MR核磁共振波譜儀（美國安捷倫公司）；UltiMate3000高效液相色譜儀、超聲波振蕩器、HILIC氨 基 色 譜 柱（150 mm × 4.6 mm，2.6 μm）、Hypersil ODS C18色 譜 柱（60 mm × 4.6 mm，3 μm）（ThermoFisher 公司）；ME204E 型萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；渦旋振蕩器、高速離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司）。

重水（D2O）和氘代甲醇（CD3OD）購自青島騰龍微波科技有限公司。乙腈（色譜純）購自默克公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

7種鐵棍山藥均采集自焦作地區(qū)，詳細(xì)信息見表1。原植物經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)謝小龍副教授鑒定為鐵棍山藥（Dioscorea polystachyaTruczaninow cv.Tiegun）。

表1 鐵棍山藥樣品信息Table 1 Sample information of Dioscorea polystachya Truczaninow cv.Tiegun

1.2 山藥處理方法

山藥采集后當(dāng)天去掉泥土，洗凈，去皮后切片烘干，粉碎得山藥粉，備用。

1.3 核磁共振分析

1.3.1 測試樣品制備稱取山藥粉（50 mg），加入0.4 mL 的磷酸緩沖液（0.05 mol/L Na2HPO4和NaH2PO4的重水溶液）以及0.4 mL 氘代甲醇，渦旋振蕩（3 min），離心（10 000 g，5 min），吸取上清液（550 μL）置于5 mm樣品管中。

1.3.2 測試條件核磁共振氫譜于室溫（298 K）測定，5 mm OneNMR 探頭，脈沖序列為PRESAT 以壓制樣品中的水峰，掃描次數(shù)64，譜寬4 800 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)16 K，弛豫時(shí)間2 s，采集時(shí)間3.408 s。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析將采集得到的1H NMR 圖譜信號用MestreNova 軟件進(jìn)行傅里葉變換，設(shè)置譜寬因子為0.3 Hz 的指數(shù)窗函數(shù)，手動(dòng)進(jìn)行相位校正，基線校準(zhǔn)，以3-（三甲基硅基）氘代丙酸鈉（TSP）為內(nèi)標(biāo)（δ0.0）校正位移。以δ0.02 為積分間隔對化學(xué)位移在δ0.5～9.5 之間的信號進(jìn)行分段積分，其中去除δ3.28 ～3.34 和δ4.66～5.10 之間的信號，以避免CHD2OD 和HOD 殘留信號的干擾。將分段積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.0 軟件中進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。200 次重復(fù)排列置換檢驗(yàn)（Permutation test）評價(jià)OPLS-DA 模型的準(zhǔn)確性。使用OPLS-DA 模型的變量重要性投影（Variable important projection，VIP）對差異代謝物進(jìn)行預(yù)選（VIP ＞1.0說明對分類有貢獻(xiàn)）。對核磁共振圖譜中未完全重疊的化合物信號通過積分（與TSP對比）進(jìn)行單變量分析。

1.4 液相色譜分析

1.4.1 樣品前處理采用GB5009.8-2016［16］方法對山藥粉末進(jìn)行提取以測定山藥中糖的含量，采用GB5009.157-2016［17］方法對山藥粉末進(jìn)行提取以測定山藥中檸檬酸和蘋果酸的含量。

1.4.2 色譜測定條件糖含量測定：檢測器：示差折光檢測器；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：乙腈∶水=75∶25（體積比），等度洗脫；流速：1.0 mL/min。有機(jī)酸含量測定：檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液∶甲醇97.5∶2.5（體積比），等度洗脫；流速：0.8 mL/min。每個(gè)樣品測試不少于3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝物的鑒定

鐵棍山藥的1H NMR譜圖如圖1所示，利用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［2，15，18-19］和對照品的1H NMR圖譜，共指認(rèn)30個(gè)化學(xué)成分，具體的特征化合物歸屬如表2 所示。對比前期研究中其他地區(qū)山藥的核磁共振圖譜，鐵棍懷山藥中少了葡萄糖和果糖信號的干擾，δ3.8 ～4.3 區(qū)間的絲氨酸、脯氨酸和蘇氨酸的信號更加清晰可辨。

表2 山藥主要代謝物的1H NMR圖譜歸屬Table 2 Assignments of1H NMR spectral peaks obtained from yams

圖1 山藥提取物的1H NMR圖譜Fig.1 1H NMR spectra of yam extracts 1-30 were the same as those shown in Table 2

2.2 差異代謝物的指認(rèn)

2.2.1 PCA 分析PCA 分析屬于無監(jiān)督的模式識別方法，能夠反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，直觀地顯示不同樣品間的整體差異。7 種鐵棍山藥的PCA 圖（圖2）顯示第一主成分（PC1：56.0%，地域）和第二主成分（PC2：4.3%，土質(zhì)）可以解釋60.3%的原變量信息，不同產(chǎn)地的山藥樣本存在一定成分差異。溫縣、孟州、武陟的壚土和沙土山藥能夠通過PC2 分開，表明土質(zhì)差異對山藥的影響大于地域差異。7 種鐵棍山藥中，溫縣壚土和孟州壚土山藥成分更接近，而孟州沙土和武陟沙土山藥成分更接近。

圖2 7種山藥的PCA得分圖Fig.2 PCA score plot of 7 yams

（續(xù)表2）

2.2.2 OPLS-DA 分析PCA 分析為無監(jiān)督分析，可反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，但不能消除組內(nèi)誤差和隨機(jī)誤差。而有監(jiān)督的OPLS-DA 能夠?qū)⑴cY矩陣相關(guān)的X 矩陣和與Y 矩陣無關(guān)的X 矩陣加以區(qū)分，消除組內(nèi)誤差及與研究目的無關(guān)的隨機(jī)誤差，體現(xiàn)數(shù)據(jù)的整體特征和變化規(guī)律，使兩組分類差別達(dá)到最大，從而確定兩組之間的化學(xué)成分差異，提高模型的有效性和解析能力。

溫縣壚土鐵棍山藥和孟州壚土鐵棍山藥OPLS-DA 模 型（圖3A）的R2X 為0.82，Q2為0.996，兩者均大于0.5且接近于1，表明模型高度可靠。在柱狀荷載圖中（圖3B），以VIP ＞1.0 作為標(biāo)準(zhǔn)，可知溫縣壚土山藥中精氨酸、檸檬酸和天冬氨酸含量較高；孟州壚土山藥中蘇氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蔗糖、蘋果酸、尿囊素含量較高。200 次重復(fù)排列置換檢驗(yàn)的R2為0.373，Q2為-0.626（圖3C），表明模型不存在過度擬合。值得注意的是，載荷圖中顯示，溫縣壚土山藥的葡萄糖、果糖含量均低于其他幾種山藥，但是所有載荷圖中葡萄糖和果糖的VIP均小于1.0，并不是主要成分。

圖3 溫縣壚土鐵棍山藥和孟州壚土鐵棍山藥的OPLS-DA得分圖（A）、載荷圖（B）和模型驗(yàn)證圖（C）Fig.3 OPLS-DA score plot（A），loading plot（B）and permutation test（C）of WL vs. ML

其他5種山藥與溫縣壚土山藥OPLS-DA 模型的R2X、Q2以及置換檢驗(yàn)的R2、Q2值均表明這幾種山藥的模型高度可靠，不存在過度擬合，相關(guān)數(shù)據(jù)列于表3。

表3 OPLS-DA模型質(zhì)量的評價(jià)參數(shù)Table 3 Assessment parameters for the evaluation of OPLS-DA

2.2.3 代謝物相對含量比較以TSP為內(nèi)標(biāo)，對山藥中各化學(xué)組分定量積分，應(yīng)用Graph Prism 8.0對成分進(jìn)行單變量分析。結(jié)果顯示，7種鐵棍山藥中，溫縣壚土山藥的精氨酸含量最高，孟州壚土山藥的蘇氨酸、谷氨酰胺含量最高，溫縣沙土山藥的丙氨酸和蘋果酸含量最高，武陟沙土山藥的尿囊素含量最高。此外，溫縣壚土和孟州壚土山藥還有最高含量的異亮氨酸、纈氨酸兩種必需氨基酸?？傮w來看，相較于外地種植鐵棍山藥和外地品種［15］，7種鐵棍山藥的化學(xué)成分差異不明顯，溫縣壚土山藥和孟州壚土山藥成分更為相似；3種沙土地的鐵棍山藥中2-羥基異丁酸的含量均高于壚土地山藥。

2.3 差異代謝物含量的測定

前期研究發(fā)現(xiàn)［15］，溫縣壚土鐵棍山藥的葡萄糖、果糖含量均低于外地種植的鐵棍山藥、地方品種山藥以及種植在溫縣地區(qū)的地方品種山藥，且可以利用溫縣壚土鐵棍山藥葡萄糖含量極低的特點(diǎn)用顯色劑進(jìn)行鑒別。為了明確焦作各地區(qū)鐵棍山藥之間糖含量的差別，本文利用液相色譜測定了沁陽、武陟、溫縣、孟州4 地鐵棍山藥中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，同時(shí)測定了檸檬酸和蘋果酸兩種有機(jī)酸的含量，結(jié)果見表4。

表4 液相色譜測得的鐵棍山藥中果糖、葡萄糖、蔗糖及檸檬酸、蘋果酸的含量Table 4 Contents of fructose，glucose，sucrose and citrate，malate in yams detected by HPLC （mean±SD，mg/g）

可以看出，焦作地區(qū)4 縣種植的7 種鐵棍山藥中均未檢出果糖和葡萄糖，蔗糖含量以溫縣壚土地鐵棍山藥最低，葡萄糖和果糖仍然可以作為鑒別道地鐵棍山藥的指標(biāo)。溫縣壚土地鐵棍山藥的檸檬酸含量最高，孟州壚土地鐵棍山藥的檸檬酸含量最低，溫縣沙土地鐵棍山藥的蘋果酸含量最高，與OPLS-DA 載荷圖結(jié)果一致，表明核磁共振氫譜中的積分面積能夠有效表達(dá)代謝物的含量趨勢。

3 結(jié) 論

山藥是常見的食藥兩用藥材，種植于焦作地區(qū)武陟、沁陽、溫縣、孟州4 地的鐵棍山藥均屬于道地藥材“懷山藥”。本文采用核磁共振結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對上述4 縣7 種鐵棍山藥中的化學(xué)成分差異進(jìn)行了比較。通過核磁共振氫譜共鑒定化合物30種，多元統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示7種鐵棍山藥存在化學(xué)成分差異，但是明顯小于外地種植鐵棍山藥和外地品種山藥。7 種鐵棍山藥中，溫縣壚土鐵棍山藥和孟州壚土鐵棍山藥成分最為相似。此外，7 種鐵棍山藥中葡萄糖和果糖含量均小于2.0 mg/g，果糖和葡萄糖的含量、葡萄糖顯色試劑等仍適用于道地山藥的判別檢測［20-21］，也可利用電致化學(xué)發(fā)光酶生物傳感器檢測葡萄糖含量進(jìn)行判別［22-23］。后續(xù)將結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證道地山藥和其他地區(qū)山藥之間的療效差異。