固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水果蔬菜中雙胍辛胺的殘留量

秦 富，汪文龍，司露露，蔡翔宇，梁 宇，蘇 華，韋 濤

（南寧海關(guān)技術(shù)中心，廣西 南寧 530201）

雙胍辛胺是由日本Dainippon Ink and Chemical 公司于1986 年開發(fā)的一種具有觸殺與預(yù)防性作用的廣譜殺菌劑，雙胍三辛烷基苯磺酸鹽和雙胍辛胺醋酸鹽是雙胍辛胺最常見的2種鹽類殺菌劑，其有效成分和水解產(chǎn)物均為雙胍辛胺。雙胍辛胺及其鹽劑對(duì)大多數(shù)由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有良好的效果［1］，廣泛應(yīng)用于柑橘、蘋果、番茄、生菜等水果蔬菜的病害防治和防腐保鮮［2-3］。盡管雙胍辛胺屬于低毒性農(nóng)藥，但對(duì)家蠶等生物有較高毒性［4］，若大量使用而釋放至環(huán)境中可能對(duì)環(huán)境和人體產(chǎn)生不良影響［5］。因此，各國(guó)均制定了雙胍辛胺的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中歐盟規(guī)定雙胍辛胺在水果蔬菜等植物源性食品中的殘留量均不能超過0.05 mg/kg［6］，日本規(guī)定水中的雙胍辛胺醋酸鹽不能超過6 μg/L［7］。中國(guó)規(guī)定雙胍三辛烷基苯磺酸鹽（以雙胍辛胺表示）在各種水果和蔬菜中的最大殘留限量為0.2～3 mg/kg［8］，但缺少相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致難以對(duì)植物源性食品中雙胍辛胺實(shí)施有效的監(jiān)督管理和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，也不利于水果蔬菜的進(jìn)出口貿(mào)易。因此，研究快速、準(zhǔn)確測(cè)定水果蔬菜中雙胍辛胺殘留量的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)雙胍辛胺檢測(cè)方法的研究報(bào)道較少，其中針對(duì)植物源性食品常采用液相色譜法，但需要添加離子對(duì)試劑［9］或進(jìn)行柱后衍生［10］，操作繁瑣，衍生效率難以控制，且靈敏度較低，難以滿足現(xiàn)行相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。任海濤［11］和李云飛等［12］分別開發(fā)了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高分辨質(zhì)譜法，但2種方法采集的母離子均為靈敏度和穩(wěn)定性較差的單電荷加合離子［M+H］+，導(dǎo)致方法的靈敏度低和重現(xiàn)性較差，難以滿足植物源性食品中雙胍辛胺的痕量檢測(cè)和定量要求。為此，本研究以沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍為樣本，成功建立了靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度更好的固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，為水果蔬菜中雙胍辛胺殘留的監(jiān)督檢測(cè)以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供了技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀、Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）（美國(guó)Agilent 公司）； Qtrap 4500 質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；BEH Hilic 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）、OASIS WCX 固相萃取柱（3 mL/60 mg）（美國(guó)Waters 公司）； XS204 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；飛鴿DL-5-B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KL512J 氮?dú)鉂饪s裝置（北京康林科技有限公司）；VOTEX GENIE2 渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries 公司）；GM 200 刀式混合研磨儀（德國(guó)Retsch 公司）；1.5 mL 聚丙烯短頸螺口瓶（PP 進(jìn)樣瓶，美國(guó)Thermo 公司）；0.22 μm 疏水性聚四氟乙烯（PTFE）針式濾器、0.22 μm 親水PTFE 針式濾器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司）；0.2 μm 再生纖維針式濾器（美國(guó)Agilent公司）；100 mL聚丙烯容量瓶、250 mL聚丙烯試劑瓶（德國(guó)Vitlab公司）。

雙胍辛胺醋酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：57520-17-9，純度≥90.1%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司），使用甲醇溶解配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度以雙胍辛胺計(jì)，使用聚丙烯材質(zhì)的容量瓶和試劑瓶定容和儲(chǔ)存。乙腈、甲醇、二氯甲烷、甲酸為色譜純，購自美國(guó)Tedia公司。

1.2 樣品前處理

提?。簩⑺?、蔬菜樣品切碎后，用刀式混合研磨儀制成細(xì)碎均勻的試樣。稱取5.00 g 試樣置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.2%乙酸水和10 mL二氯甲烷，振蕩提取30 min，于4 000 r/min離心5 min。

凈化：分別用3 mL 甲醇和3 mL 水活化平衡WCX 固相萃取柱，取3 mL 上清液以1 滴/s 通過小柱；依次加入2 mL 水和2 mL 甲醇淋洗小柱；再用3 mL 10%甲酸乙腈洗脫并收集至15 mL聚丙烯離心管中；于45 ℃水浴氮吹至近干，加入0.2%甲酸水并定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 疏水性PTFE 針式濾器裝入PP進(jìn)樣瓶，供儀器分析。

1.3 分析條件

1.3.1 液相色譜條件色譜柱：Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A 為0.2%甲酸水，B 為甲醇；以0.35 mL/min 進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序：0～2.0 min，保持95% A；2.0～3.0 min，95%～15% A；3.0～5.8 min，15%～5% A；5.8～6.0 min，5%～95% A；6.0～8.0 min，保持95%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣（CUR）：1.4×105Pa；碰撞氣（CAD）：Medium；離子源電壓（IS）：4 500 V；離子源溫度（TEM）：500 ℃；霧化氣（GS1）：3.8×105Pa；輔助加熱氣（GS2）：3.8×105Pa；雙胍辛胺的離子對(duì)參數(shù)：母離子為m/z178.8，定量和定性子離子分別為m/z100.0和187.0，碰撞能（CE）分別為19、19.5 V，去簇電壓（DP）均為80 V。

1.4 定量方法

采用空白基質(zhì)加標(biāo)曲線定量。選擇與試樣一致的空白基質(zhì)，添加系列雙胍辛胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，與樣品一同處理后進(jìn)樣，采用MultiQuant 3.0.2軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別采集雙胍辛胺的［M+H］+和［M+2H］2+加合離子進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，結(jié)果顯示雙胍辛胺的最佳母離子為帶雙電荷的m/z178.8，而單電荷母離子m/z356.6 的響應(yīng)較差且極其不穩(wěn)定?？赡苁怯捎陔p胍辛胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)兩端均含有C===== N 雙鍵，在離子化過程中易獲得2 個(gè)H+形成雙電荷離子加合模式［M+2H］2+。母離子碎裂后形成的響應(yīng)豐度較好的子離子為m/z69.0、100.0、157.7、187.0（如圖1），經(jīng)實(shí)際樣品檢測(cè)驗(yàn)證，最終選擇響應(yīng)較好、干擾峰較少的m/z100.0 和187.0 為子離子，該離子參數(shù)與文獻(xiàn)［13］基本一致。

圖1 雙胍辛胺的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of iminoctadine

2.2 色譜條件優(yōu)化

雙胍辛胺的極性較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)首選BEH Hilic 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）進(jìn)行分離，結(jié)果雙胍辛胺的色譜峰有較嚴(yán)重的拖尾，且難以通過調(diào)整洗脫程序得到改善。改用C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）進(jìn)行分離，結(jié)果顯示雙胍辛胺的色譜峰也存在拖尾，但通過優(yōu)化流動(dòng)相洗脫程序后可以獲得尖銳、對(duì)稱的色譜峰形，所以選用C18色譜柱。進(jìn)一步考察了0.2%甲酸水-甲醇和0.2% 甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)雙胍辛胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰效果，發(fā)現(xiàn)前者的峰形、峰寬和豐度均優(yōu)于后者?？赡苁怯捎陔p胍辛胺在甲醇中的溶解性較乙腈好，甲醇的洗脫效果和離子化效果更優(yōu)，所以選擇0.2%甲酸水-甲醇為流動(dòng)相。在最佳色譜條件下獲得雙胍辛胺的MRM 色譜峰如圖2所示。使用雙胍三辛烷基苯磺酸鹽和雙胍辛胺醋酸鹽作為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在相同條件下獲得的色譜峰及響應(yīng)值一致。

圖2 雙胍辛胺的MRM色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of iminoctadine

由于雙胍辛胺容易吸附在質(zhì)譜系統(tǒng)的管路、噴針、離子源等部件上造成污染，引起保留時(shí)間變動(dòng)、不規(guī)則拖尾等色譜現(xiàn)象，從而影響色譜條件的優(yōu)化。通過多次連續(xù)進(jìn)樣或?qū)苈?、噴針、錐孔等進(jìn)行沖洗后可以消除該影響。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取、凈化條件的優(yōu)化由于雙胍辛胺的極性較強(qiáng)、易溶于水，使用甲醇、乙腈等有機(jī)試劑為提取溶劑時(shí)效果較差，因此選擇使用水相進(jìn)行提取，并加入二氯甲烷萃取弱極性物質(zhì)從而獲得較好的凈化和分層效果。雙胍辛胺呈堿性，容易與羧基結(jié)合，因此選擇經(jīng)羧基修飾的混合型弱陽離子交換柱WCX進(jìn)行萃取凈化，可獲得較好的回收率。

采用標(biāo)準(zhǔn)溶液過柱法對(duì)凈化條件進(jìn)行優(yōu)化。首先，分別使用0.01%氨水、純水和0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%乙酸水配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，過WCX 柱，接收流出液上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，0.01%氨水和純水組檢出低信號(hào)，而各乙酸水組均未檢出，表明酸性條件有利于雙胍辛胺在WCX柱上的保留，且水溶液的酸性強(qiáng)弱（pH 3.0～6.5）對(duì)其保留效果影響不大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.2%乙酸水作為提取溶劑。然后，分別使用0.1%氨水乙腈、乙腈和1%、2%、5%、10%、15%甲酸乙腈洗脫上述WCX 柱，收集洗脫液并氮吹復(fù)溶后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果顯示，使用0.1%氨水乙腈和乙腈作為洗脫液時(shí)雙胍辛胺的回收率為0；使用含甲酸的乙腈為洗脫液時(shí)，雙胍辛胺的回收率隨著甲酸含量的增加而增加，甲酸含量增至10%后雙胍辛胺的回收率基本達(dá)到最優(yōu)。因此選擇10%甲酸乙腈溶液作為洗脫液。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)器具的選擇由于雙胍辛胺易被玻璃吸附，使用玻璃材料的器具或進(jìn)樣瓶時(shí)會(huì)導(dǎo)致方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差。文獻(xiàn)方法［10-11］通過在前處理過程中添加三乙胺溶液減少玻璃器具對(duì)雙胍辛胺的吸附。而本方法未使用玻璃器具，容量瓶、試劑瓶、離心管、進(jìn)樣瓶等均為聚丙烯（PP）材料，因此可有效避免玻璃材料對(duì)雙胍辛胺的吸附。

比較了不同過濾器對(duì)雙胍辛胺的影響，發(fā)現(xiàn)親水PTFE針式濾器和再生纖維素濾器均會(huì)明顯吸附雙胍辛胺，而疏水性PTFE針式濾器有較少吸附，但對(duì)定量結(jié)果無影響。

2.3.3 定容溶液的選擇比較了0.01%氨水、純水和0.1%、0.2%、0.4%、0.8%甲酸水為定容溶液時(shí)雙胍辛胺的響應(yīng)豐度，結(jié)果顯示各甲酸水組的響應(yīng)值無明顯差異，均明顯高于0.01%氨水和純水組。這是因?yàn)樗嵝詶l件既可促使雙胍三辛烷基苯磺酸鹽水解為雙胍辛胺，促進(jìn)其在電噴霧離子源的離子化，還可減少管路、噴針等儀器材料的吸附和干擾［7］。因此本研究選擇0.2%甲酸水作為定容溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)和定量方法選擇具有代表性的沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍8種樣品基質(zhì)進(jìn)行方法驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量時(shí)，雙胍辛胺的加標(biāo)回收率均較低，未能滿足定量要求。引起方法回收率偏低主要有兩方面的原因：一是樣品前處理過程造成損失，二是產(chǎn)生了較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。參照文獻(xiàn)方法［14］對(duì)8 種水果蔬菜樣品進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)（ME）評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，上述水果蔬菜的基質(zhì)效應(yīng)分別為5.6%、12.0%、11.2%、10.7%、-9.1%、4.5%、-5.6%、-31.2%，其中生菜、西紅柿和蘆筍為基質(zhì)抑制效應(yīng)，其它5 種樣品為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?？梢?，引起雙胍辛胺回收率偏低的原因除了與基質(zhì)抑制效應(yīng)有關(guān)，還與前處理過程有關(guān)。在前處理過程中，雙胍辛胺由于受植物成分和實(shí)驗(yàn)器具的吸附干擾導(dǎo)致其絕對(duì)回收率偏低［7，10-11］。目前主要通過添加鹽酸胍降低干擾。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加鹽酸胍反而降低了雙胍辛胺的回收率。原因在于，上述文獻(xiàn)方法均選擇700 mg［10］或1 000 mg［11］大容量的固相萃取柱，而本研究選擇60 mg 的小容量柱。在柱容量較小的情況下，由于鹽酸胍與雙胍辛胺在與WCX柱進(jìn)行離子交換過程中發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而導(dǎo)致雙胍辛胺的保留和回收率降低。因此本研究不添加鹽酸胍，選擇采用空白基質(zhì)加標(biāo)曲線定量法來校正雙胍辛胺的回收率。

2.4.2 檢出限與定量下限雙胍辛胺采用雙電荷離子化模式在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上干擾較小，基線噪音很低，靈敏度很高，其儀器檢出限（S/N≥3）可低至0.000 5 mg/L。但在實(shí)際檢測(cè)中，由于雙胍辛胺易被植物成分、實(shí)驗(yàn)耗材和進(jìn)樣系統(tǒng)等吸附干擾，低濃度時(shí)回收率較低。另外，當(dāng)進(jìn)樣濃度過高時(shí)，后續(xù)進(jìn)溶劑空白會(huì)出現(xiàn)高于3 倍信噪比的目標(biāo)信號(hào)，因而雙胍辛胺的方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）不僅要符合S/N≥3 和S/N≥10 的要求，且其響應(yīng)值要遠(yuǎn)高于該殘余信號(hào)值。通過在儀器檢出限的基礎(chǔ)上逐漸增加樣品的加標(biāo)濃度進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)不同濃度雙胍辛胺進(jìn)樣后造成的系統(tǒng)殘余信號(hào)值進(jìn)行評(píng)估，最終確定雙胍辛胺的方法檢出限和定量下限分別為0.005 mg/kg 和0.010 mg/kg。對(duì)沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍陰性樣品進(jìn)行LOD和LOQ水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均滿足以上兩個(gè)要求。同時(shí)，該方法的LOQ遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最大殘留限量（0.2～3.0 mg/kg）［8］，也低于歐盟的最大殘留限量（0.05 mg/kg）［6］，滿足結(jié)果判定要求。

2.4.3 線性關(guān)系、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別以沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍為樣品基質(zhì)，添加0、0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.160 mg/kg 雙胍辛胺進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以加標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/kg），峰面積為縱坐標(biāo)（y）擬合線性方程。按照LOQ、2LOQ 和歐盟限量值3 個(gè)濃度水平（0.010、0.020、0.050 mg/kg）添加雙胍辛胺，進(jìn)行低濃度加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)平行，考察回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果如表1所示，各樣品基質(zhì)在0.005～0.160 mg/kg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.995；平均加標(biāo)回收率為88.5%～109%，RSD（n=6）為2.1%～8.8%。

表1 低濃度加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的線性、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Linearity，recoveries and relative standard deviations of standard addition test at low concentrations

為使方法的適用性更強(qiáng)，本研究增加了國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)中雙胍辛胺的常見限量值1 mg/kg 和3 mg/kg的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。首先嘗試按照0.5、1、2、4、8 mg/kg進(jìn)行加標(biāo)曲線分析，結(jié)果由于加標(biāo)濃度過高，導(dǎo)致加標(biāo)曲線線性較差，不能滿足定量要求。因此當(dāng)樣品中雙胍辛胺的濃度過高時(shí)，需將過柱體積降低至WCX 柱的凈化容量以下。將過柱體積降至0.3 mL，然后對(duì)8 種水果蔬菜進(jìn)行了1 mg/kg 和3 mg/kg 的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，各樣品基質(zhì)在0.5～8.0 mg/kg 范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.996；1 mg/kg和3 mg/kg水平的平均加標(biāo)回收率為88.1%～109%，RSD（n=6）為2.8%～10%。

表2 高濃度加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的線性、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linearity，recoveries and relative standard deviations of standard addition test at high concentration

以上結(jié)果表明，本方法在各樣品基質(zhì)中不同濃度水平的加標(biāo)回收率和RSD 均滿足“歐盟食品和飼料中農(nóng)藥殘留及分析的質(zhì)量控制和方法驗(yàn)證程序指南”［15］的相關(guān)要求，適用于水果蔬菜中不同濃度雙胍辛胺殘留量的篩查和定量分析。

2.5 方法應(yīng)用

采用本方法對(duì)161 批市售水果蔬菜樣品中的雙胍辛胺進(jìn)行檢測(cè)，其中沃柑31 批，菠蘿蜜6 批，蘋果29批，葡萄24批，生菜16批，黃瓜21批，西紅柿24批，蘆筍10批。結(jié)果有7批沃柑樣品檢出雙胍辛胺，其余樣品均未檢出。沃柑的檢出率為22.6%，檢出量為0.011～0.066 mg/kg，均遠(yuǎn)低于國(guó)家最大殘留限量（3 mg/kg）［8］，若按照歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)（0.05 mg/kg）［6］，則有1批次不合格。

3 結(jié) 論

本研究以沃柑、菠蘿蜜、蘋果、葡萄、生菜、黃瓜、西紅柿、蘆筍為試樣，建立了固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)水果蔬菜中雙胍辛胺的方法。與現(xiàn)有檢測(cè)方法［8-12］相比，該方法選擇聚丙烯材料的容量瓶、離心管、進(jìn)樣瓶等器具，有效避免了雙胍辛胺受玻璃器具吸附的影響，同時(shí)選擇小容量的WCX固相萃取柱使操作更簡(jiǎn)單、試劑用量更少，且靈敏度和重現(xiàn)性均較好，適用于各種蔬菜水果中雙胍辛胺殘留量的檢測(cè)。