GC-NCI-MS衍生化法同時(shí)測(cè)定全血中的亞硝酸根和硝酸根

崔婉瑩，趙 鵬，饒渝蘭，于忠山，張?jiān)品?，董林沛，魏春明，吳小軍

（1.中國(guó)人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200032）

亞硝酸鹽廣泛存在于人們?nèi)粘Ｉ钪校诠I(yè)中是常用的化工原料，在食品加工中常被用作防腐劑和發(fā)色劑。其外觀與食鹽相似，常因誤食、自殺、投毒等原因引起亞硝酸鹽中毒［1-4］。人體短時(shí)間攝入大量亞硝酸鹽，會(huì)造成高鐵血紅蛋白血癥，引起紫紺癥、頭痛、頭暈、心律加快、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者導(dǎo)致缺氧性死亡。食入亞硝酸鹽的中毒量為0.3～0.5 g，致死量為3～5 g［5］。

亞硝酸鹽中毒案件中，通常采用離子色譜-質(zhì)譜法和食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的相關(guān)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)胃內(nèi)容物、嘔吐物、剩飯剩菜等體外檢材中的NO-2進(jìn)行分析［4，6］。由于缺乏成熟的方法，通過對(duì)體內(nèi)檢材的分析檢測(cè)來定性案件的案例鮮有報(bào)道，缺少體內(nèi)檢材的檢測(cè)結(jié)果嚴(yán)重制約了中毒的鑒定和案件的偵破。NO-2和NO-3濃度的測(cè)定方法較多，包括比色法［7-8］、高效液相色譜法［9-10］、離子色譜法［11-12］、毛細(xì)管電泳法［13］和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）［14-17］等，主要用于人體代謝監(jiān)測(cè)、食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面。通過保留時(shí)間和質(zhì)譜圖進(jìn)行定性、定量的GC-MS 衍生化法因具有較高的準(zhǔn)確性，被廣泛用于血漿、血清、尿液、唾液等生物樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的同時(shí)定量研究［18-19］，但很難測(cè)定全血中的NO-2和NO-3。血液是毒物分析的主要檢材，具有易獲取、不易被污染等優(yōu)點(diǎn)，血液中的毒物濃度水平可用于解釋中毒或死亡原因。在法醫(yī)鑒定領(lǐng)域，由于普遍存在死后溶血現(xiàn)象，往往只能取到全血作為檢材，而取不到血漿或血清。因此本文旨在建立一種靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可同時(shí)定量全血中NO-2和NO-3的GC-MS衍生化分析方法，解決以往亞硝酸鹽中毒案件中全血作為檢材檢測(cè)困難的問題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；Milli-Q Direct 水純化系統(tǒng)（德國(guó)Merck Millipore 公司）；EYELA CM-1000 振蕩器（日本東京理化公司）；HeraeusTM FrescoTM 21 微量離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；IKA MS 3 digital 數(shù)顯型圓周振蕩器（德國(guó)IKA 公司）；全自動(dòng)毒品毒物前處理W880 濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；QP2010 氣相色譜-質(zhì)譜（日本Shimadzu 公司）；2 mL離心管（賽譜銳思（北京）科技有限公司）。

亞 硝 酸 鈉（NaNO2，99.999%）、亞 硝 酸 鈉-15N（Na15NO2，≥98.5%）、硝 酸 鈉-15N（Na15NO3，≥98.5%）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，＞99.0%）、三苯基膦（TPP，＞99.0%）、五氟芐基溴（PFB-Br，99%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸鈉（≥99.0%）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四辛基溴化銨（TOA-Br，98%）購(gòu)自德國(guó)默克公司；乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific 公司；實(shí)驗(yàn)用水為電導(dǎo)率18.2 MΩ·cm-1的去離子水；空白血樣購(gòu)自北京復(fù)興醫(yī)院。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取NaNO2、NaNO3、Na15NO2和Na15NO3固體標(biāo)樣，用水分別配制NO-2質(zhì)量濃度為1 mg/mL、NO-3為12 mg/mL、15NO-2為100 μg/mL、15NO-3為100 μg/mL的儲(chǔ)備液，使用時(shí)按需用水逐級(jí)稀釋。

1.3 樣品前處理

取抗氧化劑混合溶液（1.5 mg/mL BHT、7.5 mg/mL TPP的乙醇溶液）200 μL于2 mL離心管，減壓濃縮至干，以200 μL 全血樣品復(fù)溶混勻。加入40 μg/mL 的15NO-2內(nèi)標(biāo)溶液、100 μg/mL 的15NO-3內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL（即加入后全血中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度分別2、5 μg/mL），隨后立即加入600 μL 乙腈渦旋振蕩5 min。加入200 μL 相轉(zhuǎn)移試劑（8 mmol/L 的TOA-Br 丙酮溶液），離心10 min，取上清液于2 mL 離心管中。加入100 μL 衍生化試劑（5%的PFB-Br 丙酮溶液）渦旋20 s，70 ℃減壓濃縮40 min。取出加入150 μL異辛烷，振蕩5 min，離心5 min，取上清液至GC-MS進(jìn)樣瓶待分析。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：J&W DB-5 MS 石英毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（純度99.999%）；壓力：58.8 kPa；柱流速：1.00 mL/min；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比1∶10，進(jìn)樣量1 μL；溶劑延遲時(shí)間：2.5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，保持5 min；以15 ℃/min升至200 ℃，保持1 min；再以30 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源溫度：220 ℃；接口溫度：220 ℃；離子化方式：負(fù)化學(xué)電離源（NCI）；掃描方式：選擇離子掃描（SIM）。目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)衍生物的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜特征離子見表1。

表1 全血中目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)衍生物的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜特征離子Table 1 Chromatographic retention times and mass spectral characteristic ions of target and internal standard derivatives in whole blood

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于NO-2不穩(wěn)定、易氧化，通過添加抗氧化劑以減少NO-2在前處理過程中的氧化。結(jié)果表明，未添加抗氧化劑和添加抗氧化劑時(shí)的氧化比例分別為39.6%和2.4%，添加抗氧化劑可起到減弱氧化的作用。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)目標(biāo)物提取溶劑、衍生物提取溶劑、相轉(zhuǎn)移試劑用量、衍生化方式、衍生化反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化條件時(shí)不添加內(nèi)標(biāo)物，通過比較NO-2和NO-3衍生物的平均峰面積選擇最優(yōu)條件。

2.1.1 目標(biāo)物提取溶劑和衍生物提取溶劑的選擇考察了分別以乙腈、丙酮、甲醇作為目標(biāo)物提取溶劑時(shí)的效果，結(jié)果表明乙腈沉淀蛋白更完全，丙酮次之，甲醇的提取效果最差，因此選擇乙腈作為目標(biāo)物提取溶劑。對(duì)比了采用異辛烷、甲苯、乙酸乙酯、正己烷作為衍生物提取溶劑時(shí)的效果，結(jié)果表明異辛烷對(duì)于衍生化產(chǎn)物PFB-NO2的提取效果最好，甲苯對(duì)于衍生化產(chǎn)物PFB-NO3的提取效果最好，其它3種有機(jī)溶劑對(duì)PFB-NO3的提取效果相差不大。由于甲苯有毒，因此選擇異辛烷作為衍生物提取溶劑。

2.1.2 相轉(zhuǎn)移試劑用量的選擇相轉(zhuǎn)移試劑的使用可以增加反應(yīng)產(chǎn)率和反應(yīng)物的穩(wěn)定性，考察了相轉(zhuǎn)移試劑用量（50、100、150、200、250 μL）對(duì)衍生化反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，不同相轉(zhuǎn)移試劑用量對(duì)PFB-NO3的生成無(wú)顯著影響，PFB-NO2的生成量則隨相轉(zhuǎn)移試劑用量的增加而增加，并在200 μL 時(shí)達(dá)到最大，因此選擇相轉(zhuǎn)移試劑用量為200 μL。

2.1.3 衍生化方式的選擇考察了水浴衍生后氮吹濃縮、水浴衍生后減壓濃縮和直接減壓濃縮3種衍生化方式對(duì)衍生效率的影響（見圖1）。結(jié)果表明，氮吹濃縮后再?gòu)?fù)溶進(jìn)樣的衍生化效率較低且重現(xiàn)性較差（圖1中未畫出）。水浴衍生后減壓濃縮方式雖小幅提升了NO-2的衍生化效率，但PFB-NO3的峰面積遠(yuǎn)小于直接減壓濃縮衍生方式，且直接減壓濃縮可以簡(jiǎn)化操作過程。因此選擇直接減壓濃縮的方式，將衍生化與濃縮過程一步進(jìn)行。

圖1 不同衍生方式生成的PFB-NO2和PFB-NO3峰面積圖Fig.1 Peak areas of PFB-NO2 and PFB-NO3 generated by different derivatization methods

2.1.4 衍生化溫度與時(shí)間的選擇分別對(duì)比了不同衍生化反應(yīng)溫度（40、50、60、70、80 ℃）條件下的衍生效率（見圖2）。結(jié)果表明當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí)，2個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨溫度升高而增大，當(dāng)超過70 ℃時(shí)峰面積下降，因此選擇衍生化溫度為70 ℃。在衍生化溫度為70 ℃條件下，考察了衍生化反應(yīng)時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對(duì)衍生效率的影響（見圖3）。結(jié)果顯示2 種反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增大，在40 min 時(shí)峰面積達(dá)到最大，而后均呈下降趨勢(shì)。為使反應(yīng)物反應(yīng)完全且不造成衍生產(chǎn)物損失，選擇衍生化時(shí)間為40 min。

圖2 衍生化溫度的影響Fig.2 Effect of derivatization temperature

圖3 衍生化時(shí)間的影響Fig.3 Effect of derivatization time

2.2 方法選擇性

NO-2、15NO-2、NO-3和15NO-3的標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生后在全掃描模式下的質(zhì)譜圖如圖4所示，全血中目標(biāo)物與添加內(nèi)標(biāo)衍生后的SIM色譜圖如圖5所示。由圖可知，衍生物PFB-NO2、PFB-15NO2的保留時(shí)間為9.370 min，PFB-NO3、PFB-15NO3的保留時(shí)間為9.420 min，通過離子碎片m/z46、47、62、63 結(jié)合保留時(shí)間和碎片離子可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量。

圖4 衍生物PFB-NO2（A）、PFB-15NO2（B）、PFB-NO3（C）、PFB-15NO3（D）在全掃描模式下的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of derivatives PFB-NO2（A），PFB-15NO2（B），PFB-NO3（C）and PFB-15NO3（D）in full scan mode

圖5 全血中衍生物PFB-NO2、PFB-15NO2（A）和PFB-NO3、PFB-15NO3（B）的SIM色譜圖Fig.5 SIM chromatograms of the derivatives PFB-NO2，PFB-15NO2（A）and PFB-NO3，PFB-15NO3（B）in whole blood

2.3 線性范圍與檢出限

按“1.3”步驟操作，加入不同質(zhì)量濃度的NO-2和NO-3標(biāo)準(zhǔn)溶液，使全血中NO-2的質(zhì)量濃度分別為0.05、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL，NO-3的質(zhì)量濃度分別為1、5、10、100、200、300 μg/mL。以加標(biāo)后的血樣中NO-2/15NO-2（或NO-3/15NO-3）峰面積比值減去空白血中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）峰面積的比值為縱坐標(biāo)，全血中NO-2和NO-3的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以1/X2為權(quán)重因子進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，全血中的NO-2和NO-3分別在0.05～5 μg/mL 和1～300 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）分別為0.995和0.997，檢出限（LOD，S/N= 3）分別為0.01 μg/mL 和0.2 μg/mL，定量下限（LOQ，S/N=10）分別為0.05 μg/mL和1 μg/mL（見表2）。

表2 全血中NO-2 和NO-3 的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，detection limits and quantitation limits of NO-2 and NO-3 in whole blood

2.4 提取回收率

提取回收率考察2種目標(biāo)物質(zhì)的低、中、高3個(gè)質(zhì)控濃度，每個(gè)濃度考察5 個(gè)樣品。NO-2質(zhì)控濃度分別為0.15、1、4 μg/mL，NO-3質(zhì)控濃度分別為3、30、250 μg/mL。取3 個(gè)質(zhì)控濃度下的空白加標(biāo)血樣，按照“1.3”步驟操作后進(jìn)樣得到各待測(cè)物的峰面積，記錄NO-2/15NO-（2或NO-3/15NO-3）的比值，減去同批空白血中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）的比值后得到數(shù)值A(chǔ)1。同時(shí)取對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度下NO-2、NO-3的基質(zhì)加標(biāo)溶液，按“1.3”步驟操作，記錄N-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）的比值，減去同批空白基質(zhì)中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）比值后得到數(shù)值A(chǔ)2，以A1/A2×100%計(jì)算提取回收率，結(jié)果如表3 所示。結(jié)果顯示，全血中低、中、高3個(gè)濃度下NO-2的提取回收率分別為118%、109%和99.8%，NO-3的提取回收率分別為88.4%、80.3%和85.1%。

表3 全血中NO-2 和NO-3 的提取回收率、準(zhǔn)確度及精密度Table 3 Extraction recoveries，accuracies and precisions of NO-2 and NO-3 in whole blood

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

選擇定量下限（LOQ）、低、中、高濃度4個(gè)點(diǎn)作為質(zhì)控濃度，每個(gè)濃度考察5個(gè)樣品：NO-2的質(zhì)控濃度分別為0.05、0.15、1、4 μg/mL，NO-3的質(zhì)控濃度分別為1、3、30、250 μg/mL。加入不同質(zhì)量濃度的NO-2和NO-3質(zhì)控標(biāo)液，按“1.3”步驟操作。GC-MS進(jìn)樣分析后，記錄NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）比值，減去同批空白血樣中NO-2/15NO（-2或NO-3/15NO-3）的比值后，代入線性回歸方程反算其實(shí)測(cè)濃度，分別計(jì)算每個(gè)質(zhì)控濃度的準(zhǔn)確度、日內(nèi)和日間精密度（n=3），精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。由表3可知，4 個(gè)質(zhì)控濃度下NO-2的準(zhǔn)確度為89.6%～98.0%，日內(nèi)RSD 為1.8%～9.2%，日間RSD 為2.1%～6.2%；NO-3的準(zhǔn)確度為92.8%～112%，日內(nèi)RSD為0.60%～14%，日間RSD為0.60%～3.7%。結(jié)果表明，所建方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好。

2.6 真實(shí)中毒案例應(yīng)用

2020年9月，某女子被發(fā)現(xiàn)在樹林中暈倒，經(jīng)搶救無(wú)效死亡?，F(xiàn)場(chǎng)勘查時(shí)，發(fā)現(xiàn)1袋打開的亞硝酸鈉粉末和半瓶礦泉水。送檢檢材為該女子的血液樣品，取200 μL血液按照本方法進(jìn)行樣品前處理和分析。測(cè)得該女子血液中NO-2和NO-3的質(zhì)量濃度分別為0.29、224.11 μg/mL。取16份空白血樣，按“1.3”步驟操作，記錄NO-2/15NO-2或NO-3/15NO-3的比值，反算全血中內(nèi)源性的NO-2和NO-3濃度。得到NO-2的質(zhì)量濃度為0.05～0.10 μg/mL，NO-3的質(zhì)量濃度為1.70～7.70 μg/mL。此案件中2種物質(zhì)的濃度均遠(yuǎn)高于人體全血中內(nèi)源性的濃度水平，可判定為亞硝酸鹽中毒。結(jié)果表明，所建方法可滿足實(shí)際案件的檢驗(yàn)需求。

3 結(jié) 論

NO-2不穩(wěn)定、易氧化，進(jìn)入血液后大部分氧化為NO-3，全血中NO-2和NO-3的同時(shí)準(zhǔn)確定量是案件定性的關(guān)鍵。本文建立了衍生化氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離源-質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定全血中NO-2和NO-3的方法，通過添加抗氧化劑的方式減少NO-2在前處理過程中的氧化。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，能夠滿足實(shí)際亞硝酸鹽中毒案件的檢驗(yàn)鑒定需求，可用于實(shí)際亞硝酸鹽中毒案例分析。