基于非接觸電導(dǎo)檢測和在線富集技術(shù)快速靈敏檢測土壤中速效磷

齊培杉，朱蓬生，謝天堯

（中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

磷是植物生長過程中的重要元素之一。若缺磷，植被則難以生長，而磷含量過多也會造成磷污染。土壤含磷量（包括有機(jī)磷和無機(jī)磷）的多少及其存在形態(tài)常與生長在該區(qū)域的植物生長發(fā)育狀況有著重要聯(lián)系［1-3］。通常有機(jī)磷因以高分子形態(tài)存在，難以直接被植物吸收作為養(yǎng)分；而無機(jī)磷則包括了與鈣、鐵、鋁等絡(luò)合的難溶性磷酸鹽以及能夠?yàn)橹参镂绽玫乃苄詿o機(jī)磷酸鹽。由于水溶性無機(jī)磷可為植物直接吸收利用（稱之為速效磷），因此其含量是反映土壤中速效磷的重要指標(biāo)［4-5］。通過研究速效磷在土壤中的分布及含量，能夠深入了解土壤中磷的供應(yīng)狀況，這對于農(nóng)業(yè)中的精準(zhǔn)施肥有直接的指導(dǎo)意義［6-8］。但在土壤中速效磷的研究過程中，由于其含量很低且土壤中大量共存組分的干擾嚴(yán)重，因此建立靈敏快速、抗干擾能力強(qiáng)的土壤中速效磷含量的檢測新方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

土壤中速效磷的常規(guī)檢測方法是采用浸提劑浸出土壤中的可溶性磷，再用比色法進(jìn)行檢測［4-5］。其它有關(guān)磷的分析方法主要有：離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)分析法和光學(xué)分析法等［9-14］。其中，比色法的步驟較繁瑣，檢測時(shí)間長，檢測靈敏度低。此外，因土壤中含有一定量的有機(jī)質(zhì)，浸出液通常呈深淺不一的黃褐色（須用活性炭脫色后再測定），一定程度上對比色分析造成了干擾。浸出液的顏色也會不同程度地影響到其它光學(xué)分析方法。離子色譜法是較廣應(yīng)用于土壤和水體中無機(jī)陰離子測定的分析方法，但存在前處理復(fù)雜，色譜柱較昂貴且易污染，分析成本高和不適于現(xiàn)場快速檢測的缺點(diǎn)。根據(jù)已有研究，建立操作簡單且快速靈敏的分離檢測土壤中速效磷新方法，尚屬一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的研究課題。毛細(xì)管電泳法（CE）具有高效、分離速度快，樣品和試劑消耗少，易于小型化和便攜化等特點(diǎn)。電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測法（C4D）作為一種優(yōu)良的CE 通用檢測技術(shù)，對被檢測組分具有普適性，尤其在極弱光活性和電活性組分檢測中更顯優(yōu)勢。C4D 中溶液與電極之間因毛細(xì)管壁的間隔而不接觸，因而具備良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性［15］。場放大進(jìn)樣（FASI）在眾多CE在線富集方法中操作最為簡單，且富集因子高，極具實(shí)際可操作性，進(jìn)而很好地解決了常規(guī)CE在微量、痕量分析中靈敏度不足導(dǎo)致應(yīng)用受限的問題［16］。FASI通常以超純水作為進(jìn)樣介質(zhì)（即樣品直接溶于超純水），通過電動(dòng)進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)高效的在線富集效果［16-18］。因此，采用FASI-CE-C4D 測定土壤中速效磷含量，是極具應(yīng)用潛力的檢測新技術(shù)。

本文采用FASI-CE-C4D 對土壤中速效磷的含量進(jìn)行測定，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件使得土壤中共存的常見無機(jī)陰離子（如Cl-、SO24-、NO-3）和有機(jī)基質(zhì)不干擾速效磷的測定；樣品無需進(jìn)一步處理即可直接進(jìn)樣分析，從而為土壤中速效磷的快速檢測提供了一種操作簡單、靈敏和成本低的檢測新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CES2018 型毛細(xì)管電泳儀、C4D 檢測器、C4D 檢測池體（廣州涵天科儀公司）；石英毛細(xì)管柱（邯鄲永年銳沛色譜器件公司）；TG16-WS型臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀公司）。

乙酸（HAc）、乙酸銨、NaOH、HNO3、氯化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉；十六烷基溴化銨（CTAB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，廣州化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)品（北京國家標(biāo)準(zhǔn)試劑公司）；土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品（GBW07461，由廣東土壤研究所提供），所用試劑除注明外均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由超純水機(jī)制備。

用水、乙酸和乙酸銨直接配制電泳運(yùn)行液，現(xiàn)用現(xiàn)配。用水和經(jīng)105 ℃干燥2 h 的KH2PO4配制質(zhì)量濃度為100 mg/L 的磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液（若以PO3-4計(jì)，則為306.6 mg/L），保存在4 ℃冰箱；實(shí)驗(yàn)時(shí)，取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用水配成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 實(shí)際樣品的處理

參照文獻(xiàn)方法［1-2］，土壤樣品經(jīng)烘干、研磨后稱取0.500 0 g 加入10 mL 水浸泡。震蕩5 min 后超聲浸提5 min，經(jīng)6 000 r/min 離心5 min 后靜置5 min。取適量上清液于進(jìn)樣瓶中（如有必要，可經(jīng)過濾處理），視實(shí)際樣品中磷含量用水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，使其質(zhì)量濃度處于線性檢測范圍之內(nèi)，上機(jī)進(jìn)行FASI-CE-C4D測定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

毛細(xì)管在使用前的處理參照文獻(xiàn)［17］：每2 次進(jìn)樣分析之間，用運(yùn)行液沖洗毛細(xì)管3 min，走基線8 min。電泳分析過程運(yùn)行5 h后，電泳儀兩端的儲液瓶中需換新鮮電泳運(yùn)行液。石英毛細(xì)管柱：45 cm×50 μm id，Leff=40 cm。35 mmol/L 乙酸+2 mmol/L 乙酸銨溶液為電泳運(yùn)行液。CE 儀器的參數(shù)為：負(fù)高壓分離：-14 kV，電動(dòng)進(jìn)樣：-11 kV×10 s。C4D 檢測器的輸出信號由數(shù)據(jù)工作站實(shí)時(shí)采集到上位微機(jī)中進(jìn)行CE-C4D電泳圖譜的記錄和分析。儀器運(yùn)行條件為室溫，相對濕度≤70%。

2 結(jié)果與討論

2.1 CE分離條件的選擇

磷酸根離子在水溶液中以陰離子形式存在，采用負(fù)高壓的分離模式可獲得良好的分離效果［15］。電泳運(yùn)行液對分離度、靈敏度、信噪比有著重要影響，通過選擇合適的運(yùn)行液，能夠獲得最佳的分離度、靈敏度、信噪比和平穩(wěn)基線。土壤樣品中共存的氯離子、硫酸根離子、硝酸根離子是磷酸根離子檢測中最主要的干擾離子。因此，在電泳運(yùn)行液的選擇方面主要考察Cl-、SO24-、NO-3、PO34-的分離情況。經(jīng)對多種電泳運(yùn)行液體系（HAc - NH4Ac、HAc-Tris、HAc-Tris-CTAB、HAc-NaOH、HAc-NaOH-CTAB）進(jìn)行測試，結(jié)果表明：采用35 mmol/L 乙酸-2 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 3.0）作為電泳運(yùn)行液時(shí)，可以很好地滿足土壤樣品中磷酸根離子的分離檢測要求，其主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：①此時(shí)該電泳運(yùn)行液的pH 3.0 左右，石英毛細(xì)管壁上的硅羥基電離幾乎完全抑制，導(dǎo)致電滲流很?。?9］，無需添加電滲流抑制劑，且基線平穩(wěn)。②在pH 3.0 的酸性介質(zhì)中，磷酸根離子主要以磷酸二氫根離子形式存在［20］，是毛細(xì)管中電遷移的主體，因此進(jìn)樣組分PO34-、HPO24-、H2PO-4均表現(xiàn)為具有相同電遷移時(shí)間的單峰，且峰形尖銳單一，磷酸根離子的檢測靈敏度高。③土壤中共存的常見無機(jī)陰離子（Cl-、SO24-、NO-3）不干擾磷的測定（見圖1）。因此本實(shí)驗(yàn)選擇35 mmol/L 乙酸-2 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 3.0）作為最佳電泳運(yùn)行液。

圖1 Cl-、SO24 -、NO-3、PO34 -混合離子的FASICE-C4D 電泳譜圖Fig.1 FASI-CE-C4D electropherogram of the mixed Cl-，SO24 -，NO-3 and PO34 -ions running buffer：35 mmol/L acetic acid+2 mmol/L ammonium acetate（pH 3.0）；separation voltage：-14 kV，electrokinetic injection：-11 kV×10 s

2.2 分離電壓的選擇

考察了分離電壓的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著分離電壓由-8 kV 升至-18 kV，目標(biāo)離子的出峰時(shí)間不斷縮短，有利于提高分析速度。但當(dāng)分離電壓達(dá)到-16 kV以后，目標(biāo)電泳峰與土壤中的干擾離子峰發(fā)生部分重疊，且電泳電流引起的焦耳熱也隨之增加，使得檢測結(jié)果的信噪比降低。綜合考慮分析時(shí)間、共存組分干擾情況以及基線穩(wěn)定性的影響，本文選擇-14 kV為最佳分離電壓。

2.3 場放大進(jìn)樣條件的選擇

在FASI 中，需對進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)考察了目標(biāo)電泳峰強(qiáng)度與進(jìn)樣電壓間的關(guān)系。結(jié)果表明：當(dāng)進(jìn)樣電壓由-3 kV 調(diào)至-11 kV 時(shí)，目標(biāo)峰的峰高隨之線性增加，而半峰寬變化不明顯；當(dāng)進(jìn)樣電壓超過-11 kV 后，峰高增加趨緩，而半峰寬則明顯增加。因此，從分離度方面考慮，本實(shí)驗(yàn)采用進(jìn)樣電壓為-11 kV。

考察了進(jìn)樣時(shí)間由3 s增至15 s時(shí)，磷酸根離子的電泳峰峰高和半峰寬的變化情況。結(jié)果表明：進(jìn)樣時(shí)間由2 s增至10 s時(shí)，峰高隨時(shí)間的增加而線性增加，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過10 s時(shí)，峰高隨時(shí)間變化趨緩，而峰寬則明顯增加。因此，選擇最佳進(jìn)樣時(shí)間為10 s。

電動(dòng)進(jìn)樣前，通過重力進(jìn)樣方式進(jìn)5 s左右的水（稱之為水塞）可進(jìn)一步提升磷酸根離子的檢測靈敏度（約提高50%）。但需指出水塞為非必要步驟，在靈敏度滿足實(shí)際樣品的檢測要求時(shí)可省略。本實(shí)驗(yàn)省略了該步驟。

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，測定了FASI法對磷酸根離子的富集因子，結(jié)果表明：通過FASI，磷酸根離子的檢測靈敏度相比于常規(guī)進(jìn)樣方法得到顯著提高，富集前后的譜圖對比如圖2 所示。圖2a 采用常規(guī)的重力進(jìn)樣，磷酸根離子的進(jìn)樣濃度為5.0 mg/L（樣品介質(zhì)為水）；圖2b采用FASI進(jìn)樣，磷酸根離子的進(jìn)樣濃度為0.10 mg/L。通過計(jì)算得出富集因子為580。

圖2 PO34 -經(jīng)常規(guī)重力進(jìn)樣（a）和FASI進(jìn)樣（b）的CE-C4D電泳譜圖Fig.2 CE-C4D electropherograms of PO34 -by normal hydrodynamic injection（5.0 mg/L）（a）and FASI（0.10 mg/L）（b）

2.4 干擾情況考察

土壤浸出液的基體相對較復(fù)雜，與磷酸根離子共存的組分主要有：無機(jī)陰離子Cl-、NO-3、SO2-4以及有機(jī)酸（如：草酸、甲酸、乙酸等）。但基于以下原因，這些基體物質(zhì)不干擾測定結(jié)果（見圖3）：①選擇了合適的電泳運(yùn)行液，使得主要的干擾組分Cl-、NO-3、SO2-4的電泳峰遠(yuǎn)在磷酸根離子電泳峰之前，不影響土壤中速效磷的測定；②負(fù)高壓分離模式下，僅有陰離子組分遷移到檢測器被檢出，而陽離子因遷移方向相逆未檢出；③由于采用了乙酸電泳運(yùn)行液，對于電離常數(shù)值接近或小于乙酸的有機(jī)弱酸，因電離幾乎被抑制而不能遷移至檢測器端被檢出［15-16］；④草酸、甲酸的電泳峰位于磷酸根離子電泳峰之前，且與目標(biāo)峰完全分離，不干擾測定。稍大于乙酸電離常數(shù)值的有機(jī)酸因出峰時(shí)間較長（10 min以上）而落在檢測窗口之外。另外，土壤浸出液基體顏色不影響測定結(jié)果。在實(shí)際樣品分析中，為了解決土壤樣品溶液基質(zhì)引起的校正曲線基體匹配問題，可采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，或其他定量方法［16］。本文采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。

圖3 土壤樣品（a）及加標(biāo)土壤樣品（b）的FASI-CE-C4D 電泳譜圖Fig.3 FASI-CE-C4D electropherograms for detection of available phosphorus in the soil sample（a）and spiked soil sample（b）

2.5 方法學(xué)評價(jià)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，對不同濃度的磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行FASI-CE-C4D 測定。結(jié)果表明：磷酸根離子質(zhì)量濃度在16～800 μg/L 范圍內(nèi)，其峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x，μg/L）間呈良好的線性關(guān)系：y= 8.36x-2.12，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 1。以目標(biāo)物峰高與背景噪聲的3 倍信噪比（S/N）計(jì)算得到磷酸根離子的檢出限為5 μg/L。表明本方法的檢出限可滿足痕量磷酸根離子的檢測要求。

對0.10 mg/L 磷酸根離子溶液平行測定5 次，測得其日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為4.0%和4.7%。表明該方法具有較好的重現(xiàn)性，可以滿足土壤中速效磷的定量分析要求。

2.6 實(shí)際樣品測定

將建立的方法應(yīng)用于5 個(gè)土壤樣品（采集于中山大學(xué)南校區(qū)的不同區(qū)域）及1 個(gè)土壤標(biāo)準(zhǔn)樣（GBW07461，速效磷的標(biāo)注值為11.2±1.6 mg/kg）中速效磷含量的測定。按“1.2”樣品制備方法獲得土壤浸出溶液。由于土壤含有一定量的有機(jī)質(zhì)，浸提液呈淺深不一的黃褐色。采用FASI-CE-C4D 對其速效磷含量進(jìn)行檢測，經(jīng)定量分析和單位換算后，結(jié)果見表1。土壤樣品中均檢出不同含量的速效磷，范圍為4.91～19.9 mg/kg。其中Sample#5是土壤標(biāo)準(zhǔn)樣，實(shí)驗(yàn)測得值與其標(biāo)注值基本一致。對實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行日內(nèi)6 次平行試驗(yàn)，測得加標(biāo)回收率為92.5%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5.0%。圖3為土壤及加標(biāo)土壤樣品的FASI-CE-C4D譜圖。

表1 6個(gè)土壤樣品中速效磷的含量及加標(biāo)回收率（n=6）*Table 1 Contents and spiked recoveries of available phosphorus in six soil samples（n=6）*

3 結(jié) 論

本研究采用非接觸式電導(dǎo)檢測和FASI在線富集技術(shù)，結(jié)合毛細(xì)管電泳對土壤中的速效磷進(jìn)行了分離檢測。土壤樣品經(jīng)水浸取后，無需復(fù)雜前處理即可上機(jī)檢測。方法操作簡單、靈敏快速，是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、分析成本低的優(yōu)良分析方法，可為土壤中速效磷的快速靈敏檢測提供新途徑。