金-銀雙金屬納米簇@多壁碳納米管-二氧化鈦納米材料為新型氧化還原探針構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器

黃小梅，鄧 祥，鄧子禾

（1.四川文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，四川 達(dá)州 635000；2.四川省教育廳特色植物開發(fā)利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川達(dá)州 635000；3.四川省高等學(xué)校綠色化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；4.石河子大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832000）

糖類抗原19-9（CA19-9）是存在于血液循環(huán)的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原［1］，有助于胰腺癌、大腸及直腸癌的診斷［2］，也是迄今報(bào)道的對胰腺癌敏感性最高的標(biāo)志物。因此，靈敏和準(zhǔn)確地測定人體內(nèi)CA19-9腫瘤標(biāo)志物的含量，對于早期疾病診斷發(fā)揮了非常重要的作用［3-4］。目前報(bào)道檢測CA19-9的分析方法主要有酶聯(lián)免疫法［5］、放射性免疫法［6］、化學(xué)發(fā)光免疫法［7］等。然而，這些方法存在檢測時(shí)間長、準(zhǔn)確度低、難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn)［8］。電化學(xué)免疫傳感器用于檢測腫瘤標(biāo)志物具有操作簡單、成本低、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，成為近年研究的熱門領(lǐng)域［9-13］。

近年來，金屬納米團(tuán)簇（NCs）以其獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，以及低毒性等在電化學(xué)生物免疫傳感器中得到了廣泛關(guān)注［14-16］。特別是雙金屬納米團(tuán)簇表現(xiàn)出兩個(gè)原子的協(xié)同效應(yīng)和更優(yōu)越的電子、光學(xué)和催化性能，比單金屬納米團(tuán)簇引起了更多的研究興趣［17-19］。但金屬NCs 的小尺寸不利于進(jìn)一步分離、純化和固定，從而影響其應(yīng)用范圍。因此，將小尺寸的金屬NCs 固定在比表面積較大的載體上成為了一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的研究。

半導(dǎo)體（如TiO2和SiO2）由于其低成本、無毒、大的比表面積和良好的生物相容性而被用于構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器［20-22］，但差的導(dǎo)電性使其在電化學(xué)應(yīng)用中受到限制。近年來，半導(dǎo)體和碳納米管（CNTs）的結(jié)合對于提高半導(dǎo)體的導(dǎo)電性引起了人們的廣泛關(guān)注。如Li 等［23］使用CNTs 作為軸向鏈條將半導(dǎo)體納米晶TiO2串聯(lián)形成獨(dú)特的“珍珠項(xiàng)鏈”結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料（CNTs-TiO2NPs），不僅提高了CNTs-TiO2NPs 的導(dǎo)電性，而且促進(jìn)了納米晶TiO2的分散性，增加了活性比表面積。因此，與純TiO2相比，CNTs-TiO2NPs的活性顯著提高。

受上述研究啟發(fā)，本文首先采用微波方法合成了具有獨(dú)特“珍珠項(xiàng)鏈”納米結(jié)構(gòu)的CNTs-TiO2NPs。隨后，采用牛血清白蛋白（BSA）將CNTs-TiO2NPs功能化，以BSA作為穩(wěn)定劑潛在地結(jié)合和還原Au離子和Ag離子，在表面原位生成Au-Ag雙金屬NCs。以制備的Au-Ag雙金屬納米簇@CNTs-TiO2納米復(fù)合材料（Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs）作為一種新型氧化還原探針首次構(gòu)建了可對CA19-9進(jìn)行靈敏檢測的電化學(xué)免疫傳感器。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660D 電化學(xué)工作站（上海辰華有限公司）；S-4800 型號掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立）；H-800 透射電子顯微鏡（TEM，日本日立）；ESCALAB-250X-射線光電子能譜儀（XPS，英國V.G 公司）；FCMCR-3C 常壓微波合成反應(yīng)儀（科瑞儀器有限公司）；三電極體系，鉑電極為對電極，甘汞電極為參比電極，修飾的玻碳電極為工作電極（GCE，Φ=4 mm）。

胰腺癌腫瘤標(biāo)志物抗原（CA19-9）和小鼠單克隆抗體（anti-CA19-9）（種類反應(yīng)：人類；宿主/亞型：小鼠/IgG1，kappa；1 mg/mL，含0.09%疊氮化鈉）、二抗（4 mg/mL）購于鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司；氯化金（HAuCl4）購于Sigma 公司；多壁碳納米管（CNTs）購于南京先鋒納米有限公司；硝酸銀（AgNO3）、BSA（96%～99%）、殼聚糖（CS）、二甲亞砜（DMSO）和TiCl3溶液（15%）均購于四川科龍化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 納米材料的制備

1.2.1 Au-Fe3O4納米顆粒的制備［24］：用水熱法合成Fe3O4納米顆粒，然后用L-半胱氨酸將表面氨基化，再以抗壞血酸為還原劑將氯金酸還原成金納米顆粒（Au NPs），形成以Fe3O4納米顆粒為核，Au NPs為殼的納米顆粒（Au-Fe3O4NPs）。

1.2.2 CNTs-TiO2 NPs 的制備：CNTs-TiO2NPs 的制備根據(jù)文獻(xiàn)稍作修改［23］，首先分別將20 mg CNTs 和18 mL DMSO 加入到50 mL 帶聚四氟乙烯蓋的三頸瓶中，超聲分散30 min；隨后，加入2 mL TiCl3溶液（15%），磁力攪拌10 min 使其混勻后，將三頸瓶置于單室微波合成系統(tǒng)中；然后通入氮?dú)猓∟2），使反應(yīng)在氮?dú)夥罩羞M(jìn)行，以15°C/min的加熱速率對其進(jìn)行微波輻照加熱至180°C，保持30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用凝結(jié)水將系統(tǒng)溫度降至25 ℃，離心收集固體產(chǎn)物，分別用乙醇和水洗滌3次；在80°C烘箱中干燥3 h，即制得具有“珍珠項(xiàng)鏈”結(jié)構(gòu)的CNTs-TiO2NPs。

1.2.3 Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2 NPs的制備：用2 mL 3%BSA 對5 mg CNTs-TiO2NPs進(jìn)行表面化學(xué)修飾，得到—SH 或—NH2基團(tuán)功能化的CNTs-TiO2NPs。在劇烈攪拌下將2.0 mL HAuCl4（10 mmol/L）水溶液和1.0 mL 不同濃度AgNO3水溶液分別加入到2.0 mL BSA 官能化的CNTs-TiO2NPs 懸濁液中，10 min 后，加入0.2 mL 1 mol/L 的NaOH 溶液中，在37 ℃磁力攪拌反應(yīng)12 h 后獲得Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs。離心清洗后，真空干燥儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA 生 物 耦 合 物 的 制 備：將100 μL 2.0 mg/mL 的CA19-9 二抗加入到2 mL 1 mg/mL 的Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs 懸濁液中，在4 ℃磁力攪拌12 h。接著向上述懸濁液中加入200 μL 3%的BSA，在4 ℃攪拌反應(yīng)2 h。離心并將二抗生物耦合物分散到0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶液中，置于4 ℃下保存。圖1A 為Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的制備過程。

圖1 免疫傳感器的制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation of immunosensor

1.3 免疫傳感器的制備

圖1B 為免疫傳感器的制備過程。將Au-Fe3O4NPs 通過超聲分散于1 mg/mL CS 溶液中，形成均勻的Au-Fe3O4NPs-CS懸浮液（2.0 mg/mL）。取10 μL Au-Fe3O4NPs-CS滴涂于處理好的玻碳電極表面（GCE，Φ=4 mm），室溫下晾干，制得Au-Fe3O4NPs-CS/GCE修飾電極。將Au-Fe3O4NPs-CS/GCE修飾電極浸在anti-CA19-9溶液中吸附12 h，沖洗表面未結(jié)合的抗體。將其浸入0.25%BSA溶液中以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。制備好的免疫傳感器置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測試方法與檢測步驟

采用差分脈沖伏安法（DPV）和循環(huán)伏安法（CV）探討傳感器的響應(yīng)性能。DPV的檢測在含1.8 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶液中進(jìn)行，掃描電位為0.0～0.4 V，振幅為50 mV，脈沖寬度為5 ms。CV表征在5 mmol/L Fe（CN）63-/4-（pH 7.0）檢測底液中進(jìn)行，掃描電位為-0.2～0.6 V，掃描速率為50 mV/s。

檢測步驟基于夾心免疫反應(yīng)模式。在準(zhǔn)備好的免疫傳感器上滴加10 μL CA19-9標(biāo)準(zhǔn)樣品，在4 ℃條件下孵育30 min 后沖洗；隨后，將其孵育上具有氧化還原活性和放大作用的Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物。一定條件下，在含有H2O2的底液中檢測DPV 的電流變化值，即可測定抗原濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的表征

從圖2A 可以看出，Au NPs 均勻地分布于Fe3O4納米顆粒表面，形成均一多孔結(jié)構(gòu)的Au-Fe3O4NPs。在CNTs-TiO2NPs樣品中，CNTs與TiO2納米球串聯(lián)連接，形成類似珍珠項(xiàng)鏈的結(jié)構(gòu)（圖2B）。當(dāng)Au-Ag NCs 被原位還原時(shí)，由圖2C 可見，許多Au-Ag NCs 聚集在CNT-TiO2NPs表面，表明Au-Ag NCs可以很好地吸附在TiO2納米球上，這是由于TiO2納米球與Au-Ag NCs 間的靜電相互作用和氨基的高親和性。XPS結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該方法成功制得Au-Ag-NCs@CNTs-TiO2納米顆粒（圖2D）。

圖2 Au-Fe3O4 NPs的掃描電子顯微鏡（SEM）圖（A）、CNTs-TiO2NPs（B）、Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs（C）的透射電子顯微鏡（TEM）圖及Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs的X射線光電子能譜（XPS）圖（D）Fig.2 SEM image of Au-Fe3O4 NPs（A），TEM images of CNT-TiO2 NPs（B）and Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs（C），and XPS spectrum of Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs（D）

2.2 免疫傳感器制備過程的循環(huán)伏安表征

采用CV表征免疫傳感器的仿生界面的構(gòu)建過程，由圖3 所示，裸玻碳電極的循環(huán)伏安曲線呈現(xiàn)一對Fe（CN）63-/4-探針可逆的氧化還原峰（曲線a），當(dāng)修飾上Au-Fe3O4NPs 和殼聚糖（CS）的懸浮液（Au-Fe3O4NPs-CS）后，CV 的響應(yīng)信號顯著增強(qiáng)（曲線b），可見Au-Fe3O4NPs 具有很好的電子傳遞性能。當(dāng)抗體anti-CA19-9（曲線c）、BSA（曲線d）和抗原（曲線e）被依次固載于電極后，CV 的響應(yīng)信號逐漸降低，這是因?yàn)槠渚鶠樯锎蠓肿?，相互作用后，?huì)逐步阻礙電子的傳輸。

圖3 不同修飾電極在5 mmol/L Fe（CN）63-/4-（pH 7.0）溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 CV curves of different modified electrodes in 5 mmol/L Fe（CN）6 3-/4-（pH 7.0）solution a：bare GCE；b：Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE；c：anti-CA19-9/Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE；d：BSA/anti-CA19-9/Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE；e：CA19-9/BSA/anti-CA19-9/Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了探究Au NCs和Ag NCs的協(xié)同作用，本實(shí)驗(yàn)測量了Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物中不同摩爾比Au∶Ag的DPV電流響應(yīng)信號。如圖4A所示，Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA，表明Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的DPV 電流信號強(qiáng)度與Au NCs 摻雜量有關(guān)。當(dāng)Ag∶Au 的摩爾比為3∶1 時(shí)，Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的電流強(qiáng)度最大（約為單個(gè)Ag NCs的5倍），隨著Au NCs比例的繼續(xù)增加，電流強(qiáng)度增加緩慢，這可能是Au NCs和Ag NCs協(xié)同效應(yīng)減弱的原因。當(dāng)Ag∶Au的摩爾比為5∶1時(shí)，繼續(xù)增大Au NCs比例，其電流強(qiáng)度則快速降低。

圖4 偶合物中不同摩爾比Ag∶Au的電流響應(yīng)強(qiáng)度（A），底液中H2O2濃度對免疫傳感器反應(yīng)信號的影響（B）Fig.4 Current intensities of the coupling with different molar ratios of Ag∶Au（A）and influence of H2O2 concentration on response signals of the immunosensor（B）all modified electrodes were incubated in 5 U/mL CA19-9 solution at 4°C for 30 min

在底液中加入適量H2O2可增強(qiáng)電流響應(yīng)信號，提高檢測靈敏度，因此對底液中H2O2含量進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖4B所示，當(dāng)?shù)滓褐蠬2O2濃度達(dá)到1.8 mmol/L后電流信號增加的趨勢減小。本實(shí)驗(yàn)選擇底液中H2O2的最佳濃度為1.8 mmol/L。

2.4 不同納米材料催化性能的測定

為了考察納米材料間的協(xié)同作用，比較了Au NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA、Ag NCs@ TiO2/Ab2/BSA、Au-Ag NCs@TiO2NPs/Ab2/BSA、Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA、Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 5 種納米生物探針的DPV 信號及催化后的DPV 信號。由圖5 可知，這些納米生物探針中Ag NCs 作為氧化還原探針使傳感器產(chǎn)生電化學(xué)信號。而Au NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA中因無Ag NCs，導(dǎo)致無電化學(xué)信號（曲線a）。曲線b、c、d和e的電流響應(yīng)信號依次增強(qiáng)。這主要?dú)w因于：在“珍珠項(xiàng)鏈”結(jié)構(gòu)的Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA納米生物探針中，CNTs 作為軸向鏈條串聯(lián)TiO2NPs，既提高了材料導(dǎo)電性，又提高了TiO2NPs 的分散度和比表面積活性，從而在TiO2NPs 活性比表面積原位還原更多的Au-Ag NCs。因此，相較于純相TiO2表面原位還原Ag NCs 和Au-Ag NCs，Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 和Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 的 電 化 學(xué)信號顯著提高。由圖可知Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 的電化學(xué)信號最強(qiáng)，這是Au-NCs 和Ag-NCs 協(xié)同作用的結(jié)果。因此本實(shí)驗(yàn)選Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA為最終生物偶合物。

圖5 不同納米生物探針在含1.8 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）測試底液中的電化學(xué)信號Fig.5 DPV reponses of different nanoprobes in 0.1 mol/L PBS（pH 7.0）containing 1.8 mmol/L H2O2 a：Au NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA，b：Ag NCs@TiO2NPs/Ab2/BSA，c：Au-Ag NCs@TiO2 NPs/Ab2/BSA，d：Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA，e：Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA，f：Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA（without H2O2）

進(jìn)一步考察Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA在底液未加入H2O2（曲線b）和加入H2O2后（曲線a）時(shí)的DPV響應(yīng)曲線。結(jié)果顯示，由于Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs和Au-Fe3O4NPs均具有良好的模擬酶活性，協(xié)同催化H2O2，獲得了較大的電化學(xué)信號。由此可知，在底液中加入H2O2可顯著增強(qiáng)傳感器的電流信號。

抗體的固載量直接影響檢測靈敏度，因此抗體的固載基質(zhì)非常重要。本實(shí)驗(yàn)分別以Au-Fe3O4NPs和Au NPs 為抗體的固載基質(zhì)進(jìn)行了考察。以Au-Fe3O4NPs 為一抗的固載基質(zhì)的電流響應(yīng)強(qiáng)度為251.31 μA，是Au NPs 為固載基質(zhì)（82.19 μA）的3 倍多。這是因?yàn)?，一方面，磁性納米復(fù)合材料Au-Fe3O4NPs不僅具有普通復(fù)合納米材料的性質(zhì)，還具有超順磁性、高矯頑力、低居里溫度等特異的磁學(xué)性質(zhì)［25-26］。另一方面，以Fe3O4NPs為核，Au NPs為殼的Au-Fe3O4NPs，增大了Au NPs的有效表面積，能固載更多的抗體。此外，Au-Fe3O4NPs所具有的模擬酶特性可以很好地催化底液中的H2O2，繼而增強(qiáng)電流響應(yīng)強(qiáng)度。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Au-Fe3O4NPs 為一抗的固載基質(zhì)。

2.5 免疫傳感器對CA19-9的定量檢測

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用目標(biāo)免疫傳感器對不同濃度CA19-9 進(jìn)行靈敏檢測。結(jié)果如圖6 所示，DPV 的電流信號隨CA19-9 抗原濃度的增大而增強(qiáng)，表明隨著CA19-9 抗原濃度的增加被捕獲于電極表面的二抗生物探針也隨之增加。由圖6 插圖可知，檢測CA19-9 抗原的線性范圍為0.01～200 U/mL，線性方程為I= 108.68 logc+258.46（r=0.996 2），最低檢出限為0.003 U/mL。

圖6 目標(biāo)免疫傳感器對不同濃度CA19-9的DPV電流響應(yīng)Fig.6 DPV responses of the proposed immunosensor for different concentrations of CA19-9 concentration of CA19-9：0.01，0.1，1，5，10，20，100，200 U/mL；inset：the standard curve of an immunosensor for detection of CA19-9

2.6 免疫傳感器的選擇性、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

為了研究免疫傳感器的特異性，選擇癌抗原15-3（CA15-3）、癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）和甲胎蛋白（AFP）作為主要干擾因子。結(jié)果如圖7 所示，與標(biāo)準(zhǔn)CA19-9 樣品（5 U/mL）相比，CA15-3（20 U/mL）、CEA（20 U/mL）、CA125（20 U/mL）和AFP（20 U/mL）孵育前后的電流響應(yīng)變化較弱。表明該免疫傳感器對CA19-9的檢測具有高選擇性。

圖7 電化學(xué)免疫傳感器的選擇性研究Fig.7 Study on the selectivity of the immunosensor

在同一條件下，使用5 支制備相同的電極對同一濃度的CA19-9（5 U/mL）平行測定以考察該免疫傳感器的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，5 支電極的電化學(xué)響應(yīng)基本一致，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.3%，重復(fù)性較好。將免疫傳感器儲(chǔ)存于4 ℃條件下間歇檢測，一周后電流響應(yīng)值下降到95.3%，20 d 后電流響應(yīng)值也僅下降到89.4%。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示該傳感器的穩(wěn)定性較好。

2.7 生物樣品的測試

在優(yōu)化條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定免疫傳感器的回收率。血清中CA19-9的實(shí)際濃度（29.06 U/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)參考值。將健康人血清稀釋50倍后，配制成不同濃度的CA19-9 標(biāo)準(zhǔn)樣品，對其進(jìn)行檢測。由表可知，測得回收率為94.6%～105%，RSD為4.3%～6.5%，表明該免疫傳感器有望用于臨床血清樣品中CA19-9的檢測。

表1 免疫傳感器測定人體血清中CA19-9的加標(biāo)回收率Table 1 Spiked recoveries of CA19-9 in human serum determined by the immunosensor

3 結(jié) 論

本文首次合成了一種具有獨(dú)特“珍珠項(xiàng)鏈”結(jié)構(gòu)Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs 納米復(fù)合物為載體固載二抗，并將其直接作為信號標(biāo)簽構(gòu)建高靈敏CA19-9 電化學(xué)免疫傳感器。首先，將具有過氧化物模擬酶特性的磁性Au-Fe3O4NPs 用于修飾電極，以增加電極的有效面積，加快電極表面電子傳遞速率，同時(shí)有效催化底液中的H2O2以提高免疫傳感器的響應(yīng)信號。其次，Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs納米復(fù)合材料的特殊結(jié)構(gòu)，不僅提高了電化學(xué)免疫傳感器的導(dǎo)電性，也大大提高了生物分子的固載量，且表面的雙金屬納米簇Au-Ag NCs可有效催化底液中的H2O2，進(jìn)一步放大免疫傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號。最后，納米材料間的協(xié)同催化作用也極大地放大了該免疫傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號。因此，該免疫傳感器具有靈敏度高（最低檢出限為0.003 U/mL）、檢測范圍寬（0.01～200 U/mL）等優(yōu)點(diǎn)。