青藤堿調節(jié)胃癌細胞誘發(fā)的巨噬細胞M2 極化的機制

陳昳菲，任牡丹，盧新蘭，盧桂芳，張 丹，趙 艷，李雅睿，郭 丹，和水祥

（西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內科，陜西西安 710061）

胃癌是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。由于內鏡下或外科手術切除等治療方式的發(fā)展，早期胃癌患者的5 年生存率可達95%以上，但我國大多數(shù)患者在診斷時已是中晚期[2]。晚期胃癌的預后較差，姑息性化療是主要的治療方法，臨床仍需要探索更多新的治療辦法來改善生存期，提高生存率[3]。

越來越多的證據(jù)支持，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）中的腫瘤相關細胞（TAM）的高密度與胃癌患者預后不良之間存在正相關[4]。TAM通常起源于循環(huán)單核細胞，可以在TME 內通過腫瘤細胞產生的細胞外信號募集，這些信號可能將TAM從抑制腫瘤的M1 表型轉化為促進腫瘤的M2 表型巨噬細胞[5-6]，而巨噬細胞反過來影響腫瘤的生長[7-8]。值得注意的是，很多研究都證明，驅動巨噬細胞M2極化可能促進胃癌細胞的增殖或者調節(jié)其活力、侵襲和遷移[9-11]。

青藤堿(sinomenine, SIN)是一種從中藥植物青藤中提取的生物活性堿化合物，鹽酸青藤堿是其水溶性鹽酸鹽（圖1A）。SIN 具有不同的治療特性，包括抗炎和免疫抑制活性[12]，還是一種多靶點抗腫瘤天然物質[13]。已有研究證明了SIN 在胃癌中的關鍵作用[14-15]，同時它還可以調節(jié)巨噬細胞亞群的分泌[16]，暗示了SIN 通過影響腫瘤微環(huán)境而在胃癌進展中發(fā)揮潛在作用。但是，SIN 在胃癌中的作用仍是不清楚的。本文旨在研究SIN 在胃癌細胞增殖和遷移中的作用，并通過探索其在胃癌細胞誘導的巨噬細胞極化中的作用及機制，闡述SIN 對胃癌腫瘤微環(huán)境的影響，進一步探討其在胃癌治療中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 細胞系及試劑

人胃癌細胞BGC-823 與MKN-45（上海生命科學研究院），SIN（湖南正清藥業(yè)公司），二甲基亞砜（DMSO）（上海碧云天），DMEM 培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（Sigma），CCK-8 試劑盒（上海碧云天），SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天），核蛋白提取試劑盒（上海碧云天），BCA 二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒（上海碧云天），蛋白質多克隆 一 抗Ki67、STAT-6、p-STAT6、C/EBPβ、p-C/EBPβ、Lamin B（Abcam 公司）、辣根過氧化物酶標記的二抗（壯志生物公司），Transwell 共培養(yǎng)室（Corning 公司），PMA 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（Sigma 公司），膠原酶細胞解離液（Invitrogen 公司），巨噬細胞標記物抗人抗體CD14（APC/Cy7，Biolegend）、CD163（BV510，BD Bioscience BD OptiBuild）、CD206(PE-Cy5，BD Biosciences, BD Pharmigen)、LIVE/DEAD ?Viability/Cytotoxicity Kit（Invitrogen公 司），細 胞 總RNA 提 取 試 劑Trizol（Invitrogen 公司），限制性內切酶、凝膠回收試劑盒、TaqDNA 聚合酶（TaKaRa 公司），PCR 反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒及引物（TaKaRa 公司），Human IL-6 ELISA 試劑盒（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及STAT6 重組載體的構建 人胃癌細胞BGC-823、MKN-45 和單核細胞系THP-1采用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于50 mL/L CO2、濕度95%、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。重組載體構建：Trizol 試劑用于從胃癌細胞BGC-823中提取總RNA；根據(jù)SuperScript ⅡFirst-Strand Synthesis System（Invitrogen）提供的說明書合成cDNA；通過PCR 合成人類全長信號轉導及轉錄激活蛋白6（STAT6）cDNA；將STAT6 cDNA 回收并插入pCDNA3.1(+)質粒（Invitrogen）以生成STAT6 重組質粒(rSTAT6)。質粒送測序驗證序列。使用0.5 μg rSTAT6 載體或空載體用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染胃癌細胞BGC-823 和MKN-45。通過RTqPCR 法 及Western blotting 評 估rSTAT6 轉 染 的效果。

1.2.2 CCK-8 法測定細胞活力 對數(shù)期生長的人胃癌細胞BGC-823 和MKN-45 細胞經消化、離心后，以8 000/孔接種至96 孔板，24 h 后，分別加入含有0～1 000 μmol/L SIN 的培養(yǎng)基。大約24 h 后，將10 μL CCK-8 試劑進一步補充到每孔培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5 h。隨后，測定450 nm 處的A 值來評估細胞活力。

1.2.3 克隆形成實驗測定細胞增殖能力 對數(shù)期生長的人胃癌細胞BGC-823 和MKN-45 以500/孔接種至6 孔板中，實驗組培養(yǎng)基中含有50 μmol/L SIN，對照組中加入等量DMSO，培養(yǎng)14 d后，用5 g/L結晶紫固定染色。

1.2.4 共培養(yǎng)和Transwell小室遷移實驗 使用Transwell共培養(yǎng)室進行胃癌細胞BGC-823、MKN-45 和巨噬細胞的共培養(yǎng)。將50 μmol/L SIN、rSTAT6質?；蛲庠葱訧L-6（10 ng/mL）預處理的胃癌細胞接種到下室。在上室鋪板之前，通過用50 nmol/L PMA 孵育24 h 將THP-1 單核細胞誘導為M0 巨噬細胞。48 h后，小室用40 g/L 多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色20 min，PBS清洗2次，然后在顯微鏡下拍照計數(shù)。

1.2.5 流式細胞術評估巨噬細胞極化 在與胃癌細胞BGC-823和MKN-45共培養(yǎng)48 h后，收集THP-1巨噬細胞。將細胞與熒光偶聯(lián)的抗人APC-CD14 抗體和FITC-CD206抗體CD14（APC/Cy7）、CD163（BV510）、CD206(PE-Cy5)、LIVE/DEAD?Viability/Cytotoxicity Kit 一起孵育30 min 后，沖洗細胞并用FACScan流式細胞儀和FlowJo 軟件（Becton, Dickinson &Company）進行分析，以評估巨噬細胞M2 極化。

1.2.6 RT-qPCR 法檢測基因的相對表達水平 用Trizol 試劑提取樣本總RNA，紫外分光光度計檢測濃度及純度。應用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，實 時定量PCR 在Bio-Rad C1000 PCR 儀上進行，每樣本設3 個復孔，反應條件：95 ℃30 s，95 ℃10 s，58 ℃5 s，擴增40 個循環(huán)。基因表達情況采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗重復3 次。引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence

1.2.7 Western blotting檢測蛋白的相對表達水平 細胞用RIPA 裂解緩沖液裂解，使用核蛋白提取試劑盒制備核蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定所提取蛋白濃度。行SDS-PAGE 凝膠電泳，每孔道上樣40 μg，恒壓2 h，濕法轉膜至PVDF 膜上，恒流2 h。用含有50 g/L 脫脂牛奶的Tris 緩沖鹽水（TBS）封閉1 h，分別加入1∶1 000 稀釋的對應一抗4 ℃過夜。用TBST 充分洗滌后，加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h，TBST 充分洗滌。然后使用ECL 檢測試劑顯影，ImageJ 軟件進行灰度分析。Lamin B 用于細胞核中基因表達的內參，β-actin用于其他基因的內參。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，應用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。生物學實驗均重復3 次。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較或多組間的兩組比較應用單因素方差分析（one-way ANOVA），事后比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SIN 抑制胃癌細胞增殖

用0～1 000 μmol/L SIN 處 理 胃 癌 細 胞BGC-823 和MKN-45，SIN 劑量依賴性地抑制了胃癌細胞的活性（圖1B）。經過50 μmol/L SIN 處理后的胃癌細胞中增殖相關蛋白Ki67 的表達下調（圖1C）。與此同時，克隆形成實驗也證明了低劑量SIN（50 μmol/L）處理后的胃癌細胞凋亡增加（DMSO 組vs.SIN 處理組，P＜0.05）（圖1D）。

圖1 青藤堿對胃癌細胞增殖的影響Fig.1 The effect of sinomenine on the proliferation of gastric cancer cells

2.2 SIN 抑制胃癌細胞募集巨噬細胞并抑制其M2型極化

首先建立了胃癌細胞與THP-1 巨噬細胞的Transwell 小室共培養(yǎng)（CC，co-culture）系統(tǒng)，并在腫瘤作用下評估了SIN 對巨噬細胞的招募和極化作用。胃癌細胞可以募集PMA 誘導的巨噬細胞，而在SIN處理腫瘤細胞后再與THP-1 共培養(yǎng)，這種募集能力減弱了（圖2A）。與胃癌細胞的共培養(yǎng)提高了THP-1巨噬細胞中CD14+CD206+細胞的百分比（圖2B），誘導M2 型 極 化，M2 標 志 物CD163、CD206 的 平 均 熒光強度升高，在SIN 處理后胃癌細胞的誘導能力明顯減弱，M2 標志物CD163、CD206 的平均熒光強度也被抑制（圖2C）。用SIN 處理胃癌細胞降低了巨噬細胞抗炎標志物CCL22 和Arg1 的mRNA 表達，促進了免疫抑制性炎癥因子TGF-β 和IL-10 的產生（圖2D）。

圖2 青藤堿對胃癌細胞誘導巨噬細胞募集和M2 極化能力的影響Fig.2 The effect of sinomenine on the ability of gastric cancer cells in inducing macrophage recruitment and M2 polarization

2.3 SIN抑制了STAT6的表達及C/EBPβ的表達和入核

SIN 降 低 了 胃 癌 細 胞 中STAT6 和C/EBPβ 在mRNA 水平的表達（圖3A、圖3B）和在蛋白水平的表達，同時胃癌細胞核中CAAT 增強子結合蛋白β（C/EBPβ）的 蛋 白 表 達 下 調（圖3C）。C/EBPβ 的Ser299磷酸化對其自身的核易位至關重要[17]，在SIN 的處理后，降低了C/EBPβ 的總蛋白表達水平，同時也抑制了磷酸化（圖3C、圖3D）。

圖3 青藤堿對胃癌細胞中STAT6 和C/EBPβ 的影響Fig.3 The effects of sinomenine on STAT6 and C/EBPβ in gastric cancer cells

2.4 STAT6 過表達可降低SIN 對胃癌細胞募集巨噬細胞和對M2 型極化的抑制作用

用重組STAT6 質粒轉染后，顯著提高了胃癌細 胞 系 中STAT6 和C/EBPβ 的mRNA 表 達 水 平（圖4A、圖4B），以及蛋白質水平（圖4C）。對于巨噬細胞招募功能的分析，證實了SIN 對胃癌細胞誘導的巨噬細胞募集功能的抑制作用，STAT6 過表達阻斷了SIN 對腫瘤的抑制（圖4D）。同時，STAT6 的過表達還會降低SIN 對腫瘤誘導CD14+、CD206+巨噬細胞的抑制作用（圖4E）。相比較于SIN 處理后的胃癌細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞，STAT6 過表達后M2 巨噬細胞標志物表達顯著上調（圖4F）。

圖4 STAT6 介導了青藤堿對胃癌細胞誘導巨噬細胞募集和M2 型極化的抑制作用Fig. 4 STAT6 mediated the inhibitory effect of sinomenine on gastric cancer cell-induced macrophage recruitment and M2-type polarization

2.5 STAT6 在胃癌細胞中釋放IL-6 是造成SIN 介導的巨噬細胞募集和M2 極化的原因

SIN 降低了IL-6 的mRNA 表達水平和在胃癌細胞中的含量，但是當STAT6 過表達后這種影響被逆轉（圖5A、圖5B）。而IL-6 抗體對其自身的抑制，顯著減輕了由SIN 介導的胃癌細胞引發(fā)的對巨噬細胞募集的抑制作用（圖5C）。此外，與IL-6 抗體共同孵育使在與胃癌細胞共培養(yǎng)的巨噬細胞中CD14+、CD206+細胞百分比下降，M2 巨噬細胞標志物表達降低。但加入外源性IL-6 后，逆轉了SIN 對胃癌細胞誘導的巨噬細胞募集和M2 極化的抑制作用（圖5D、圖5E）。

圖5 STAT6 過表達胃癌細胞中IL-6 對青藤堿介導的巨噬細胞募集和M2 極化的影響Fig.5 The effect of STAT6 overexpression of IL-6 in gastric cancer cells on sinomenine-mediated macrophage recruitment and M2 polarization

3 討 論

目前，研究者普遍認為，在實體腫瘤中，免疫微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產生了相當重要的作用，腫瘤細胞和非腫瘤細胞（免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞等）間通過細胞因子或直接作用等方式產生交互，進而重塑腫瘤微環(huán)境和腫瘤自身的變化。本研究專注于SIN 的藥理作用，發(fā)現(xiàn)SIN 通過抑制胃癌細胞的細胞增殖活力和遷移來抑制胃癌的癌變進展。更重要的功能在于，SIN 通過抑制C/EBPβ 調控的IL-6分泌，來抑制胃癌細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)條件下誘發(fā)的巨噬細胞招募作用和巨噬細胞M2 型極化。這項研究突出了在相對低劑量的作用下，SIN 并未直接殺死腫瘤細胞，但通過調節(jié)惡性腫瘤、癌細胞介導腫瘤相關巨噬細胞表型，改善腫瘤微環(huán)境，達到輔助免疫治療，調整TME 的作用。

最近的證據(jù)證明了SIN在體外具有抗腫瘤活性，如抑制炎癥、保護腦損傷、誘導血管舒張等。然而，由于SIN生物利用度較差，SIN的臨床效用較為有限，在腫瘤的局部環(huán)境中，很難維持有效殺傷腫瘤的局部藥物濃度。到目前為止，從自然界尋找有效的腫瘤抑制化合物仍然是研究熱點，研究者也期待能從傳統(tǒng)藥物的寶庫中尋找到解開腫瘤密碼的鑰匙。在乳腺癌中SIN 被證實具有抑制有絲分裂和抵抗缺氧誘導的EMT 的效果[18-19]。SIN 也可以通過調控PI3K/AKT 通路抑制視網膜母細胞瘤的增殖能力和侵襲遷移能力[20]。另外，在非小細胞肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌等惡性腫瘤的相關研究中，SIN 已被證實具備體外和動物體內抑制腫瘤進展的效果[14,21-23]。本研究首次發(fā)現(xiàn)了SIN 調控腫瘤免疫微環(huán)境的藥理作用，其藥理機制通過CEBE/β/IL-6 軸抑制腫瘤的進展，進一步探索SIN在胃癌中的藥理作用，有利于指導胃癌患者的治療方案，提示新的治療方法。

作為免疫環(huán)境中的重要成員，骨髓單核細胞來源的巨噬細胞在腫瘤浸潤局部發(fā)揮的功能一直受到爭議。在正常生理條件下和組織損傷后的組織穩(wěn)態(tài)中，巨噬細胞起著積極的關鍵作用[24]。巨噬細胞的許多表型已經根據(jù)它們在細胞培養(yǎng)實驗中的體外特征進行了表征。經典激活的M1 表型和繼發(fā)激活的M2 表型根據(jù)不同的表面受體表達、分泌特征和功能進行區(qū)分[25]。M1 型巨噬細胞表現(xiàn)為促炎細胞，其具備較高的抗原呈遞能力，激活I 型T 細胞免疫應答，具有表達較多IL-12 的特征[26]。M2 型巨噬細胞通常具有抗炎作用，其特點是抗原呈遞能力差；具有低IL-12 和高IL-10、IL-4 和IL-13 分泌特征，同時伴有免疫抑制特征[27]。

在目前的研究中，C/EBPβ 的入核活化已經被證實對胃癌的細胞干性和化療耐藥起到促進作用，也能促進胃癌的增殖，從多個維度導致了胃癌的進展[28-30]。隨著研究的深入，人們越來越關注C/EBPβ在腫瘤中和巨噬細胞及免疫環(huán)境之間的關系[31]。本研究證明了C/EBPβ 的過表達消除了SIN 對巨噬細胞招募和M2 極化的抑制作用。值得一提的是，C/EBPβ 本身也是重要的調控巨噬細胞表型的調控因子，在C/EBPβ 活化時介導巨噬細胞向M2 型巨噬細胞極化[32]。

綜上所述，天然藥物SIN 對胃癌具有良好的腫瘤抑制能力，抑制胃癌細胞的生存和遷移，并且通過抑制IL-6 的表達，抑制腫瘤微環(huán)境中的M2 表型，重塑腫瘤環(huán)境，降低M2 型巨噬細胞為胃癌腫瘤帶來免疫抑制環(huán)境的風險。本研究為胃癌的臨床治療提供了新的思路，SIN 抑制腫瘤的同時重塑了免疫微環(huán)境，提示用SIN 治療胃癌患者的同時結合免疫療法可能帶來更大的收益。